本方案介绍了如何使用微生物微滴培养系统（MMC）进行自动化的微生物培养和适应性进化研究。MMC 能够自动、连续地培养和传代微生物，并在线监测其生长情况，具有较高的通量和良好的平行性，可减少人力和试剂消耗。
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方法文章
使用微生物微滴培养系统（MMC）进行自动化微生物培养与适应性进化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
传统的微生物培养方法通常操作繁琐、通量低、效率低，且消耗大量人力和试剂。此外，近年来发展的基于微孔板的高通量培养方法由于溶氧量低、混合效果差以及蒸发和热效应严重，导致微生物生长状态不佳和实验平行性差。由于微液滴具有体积小、通量高、可控性强等诸多优势，基于液滴的微流控技术可克服上述问题，已被广泛应用于高通量微生物培养、筛选与进化研究中。然而，大多数先前的研究仍 停留在实验室构建与应用阶段。一些关键问题，如操作要求高、构建难度大以及缺乏自动化集成技术，限制了微液滴微流控技术在微生物研究中的广泛应用。本文成功开发了一种基于微液滴微流控技术的自动化微生物微液滴培养系统（MMC），实现了微生物液滴培养过程中所需的接种、培养、在线监测、传代、分选和取样等功能的集成。在本实验方案中，以野生型大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）MG1655和一种依赖甲醇的E. coli菌株（MeSV2.2）为例，详细介绍了如何利用MMC系统进行自动化且相对高通量的微生物培养与适应性进化研究。该方法操作简便，人力与试剂消耗少，实验通量高，数据平行性好，相较于传统培养方法具有显著优势，为科研人员开展相关微生物研究提供了一个低成本、易操作且结果可靠的实验平台。
引言
微生物培养是微生物学科学研究和工业应用的重要基础，广泛应用于微生物的分离、鉴定、重构、筛选及进化等过程1,2,3。传统的微生物培养方法主要采用试管、摇瓶和固体培养皿作为培养容器，结合摇床培养箱、分光光度计、酶标仪等设备进行微生物的培养、检测与筛选。然而，这些方法存在操作繁琐、通量低、效率低下以及人力和试剂消耗大等诸多问题。近年来发展的高通量培养方法主要基于微孔板。但微孔板存在溶氧水平低、混合性能差、蒸发严重以及热效应显著等问题，常导致微生物生长状态不佳和实验平行性差4,5,6,7；另一方面，其实现自动化培养和过程检测需配备液体处理工作站、酶标仪等昂贵设备8,9。
作为微流控技术的一个重要分支，液滴微流控技术近年来在传统连续流微流控系统的基础上发展而来。它是一种离散流微流控技术，利用两种互不相溶的液相（通常为油-水体系）生成....
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方案
1. 仪器与软件安装
- 选择一个洁净且无菌的环境（例如超净工作台）作为MMC的专用固定空间，并将MMC稳定安装在该位置。
注意：使MMC远离强电场、强磁场和强热辐射源的干扰，避免剧烈振动影响光学检测组件。为MMC提供AC220 V、50 Hz的电源。有关MMC的详细信息，请参见材料表及MMC的网站16。 - 从MMC.zip文件中安装操作软件
注意：请联系作者获取MMC.zip文件。- 创建一个专用文件夹，并将压缩文件保存其中。
- 再创建另一个专用文件夹作为“安装目录”。解压MMC.zip文件，并将解压后的文件保存至该新文件夹中。
注意：计算机配置建议满足以下条件：（1）Windows 7 64位或更高版本操作系统；（2）CPU：i5或更高；（3）内存：4 GB或以上；（4）硬盘：300 GB或以上（转速大于7200 rpm或固态硬盘）。
2. 准备工作
- 连接注射器针头（内径为0.41 mm，外径为0.71 mm）、快接接头A和试剂瓶图2C），并在高压灭菌器中于 121 °C 15分钟。
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结果
本方案采用 E. coli 以MG1655和MeSV2.2菌株为例，演示在MMC中采用自动化且相对高通量策略进行微生物培养及依赖甲醇的适应性进化。通过测定生长曲线主要用于表征微生物的培养特性。适应性进化过程通过自动化连续传代培养实现，并在每次传代过程中添加高浓度甲醇作为选择压力。通过监测每次传代周期中液滴最大OD值的变化趋势，评估适应性进化是否实现。MMC的可调参数与精度参数如图所示。 Table 2.
生长曲线测定结果
在培养约 20 小时后，从 MMC 中导出了培养过程中检测到的 15 个液滴的 OD600 值（图 5A）。可以看出，检测间隔约为每 14 分钟一次。该检测周期取决于生成液滴的数量，因为在培养过程中液滴在管道中往复循环，只有当液滴经过光纤探头时，检测模块才会检测其 OD 值（OD 值的检测与计算方法见补充图 .......
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讨论
本方案介绍了如何使用微生物微滴培养系统（Microbial Microdroplet Culture system, MMC）进行自动化微生物培养和长期适应性进化。MMC是一种微型化、自动化、高通量的微生物培养系统。与传统的微生物高通量培养方法和仪器相比，MMC具有多项优势，包括人力和试剂消耗低、操作简便、可在线检测（OD和荧光）、高时间分辨率数据采集以及优异的并行处理能力。此外，MMC还具备一些区别于传统微液滴微流控技术的特殊优势，后者通常使用皮升级（pL）和纳升级（nL）液滴。大多数先前报道的基于pL和nL液滴的系统在培养性能方面表现较差，且可检测参数较少（通常仅限荧光）。18,19,20,21尽管已有一些平台能够实现更优的培养性能和多参数检测，但其实现难度较大且需要耗费大量精力。例如，有研究人员报道了对皮升级液滴的OD检测，该方法基于图像识别，不仅存在假阳性问题，还需要进一步验.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到中国国家重点研发计划（2018YFA0901500）、国家自然科学基金国家重大科研仪器研制项目（21627812）以及清华大学自主科研计划项目（20161080108）的支持。我们还感谢瑞士苏黎世联邦理工学院生物系微生物研究所 Julia A. Vorholt 教授（苏黎世 8093，瑞士）提供甲醇依赖型 E. coli 毒株版本2.2（MeSV2.2）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm PVDF 滤膜 | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | 对 MMC 油进行灭菌 |
| 4 °C 冰箱 | 海尔 | BCD-289BSW | 用于试剂储存 |
| 琼脂 | 碧迪公司（Becton, Dickinson and Company） | 214010 | 用于固体培养基的制备 |
| CaCl2·2H2O | 国药集团化学试剂北京有限公司 | 20011160 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 洁净工作台 | 北京东联哈尔仪器制造有限公司 | DL-CJ-INDII | 用于无菌操作和紫外灭菌 |
| CoCl2·6H2O | 国药集团化学试剂北京有限公司 | 10007216 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 计算机 | 联想 | E450 | 软件安装和 MMC 控制 |
| 恒温培养箱 | 上海齐欣科学仪器有限公司 | LRH 250 | 用于固体培养基的微生物培养 |
| CuSO4·5H2O | 国药集团化学试剂北京有限公司 | 10008218 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 电子天平 | OHAUS | AR 3130 | 用于试剂称量 |
| EP 管 | 赛默飞世尔科技 | 1.5 mL | 用于液滴收集 |
| FeCl3·6H2O | 国药集团化学试剂北京有限公司 | 10011928 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 冻存管 | 赛默飞世尔科技 | 2.0 mL | 用于菌种保藏 |
| 葡萄糖酸盐 | Sigma-Aldrich | S2054 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 甘油 | 国药集团 | G66258A | 用于菌种保藏 |
| 高压蒸汽灭菌锅 | 三洋电机（SANYO Electric） | MLS3020 | 用于高压蒸汽灭菌 |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | Biotopped | 420322 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 硫酸卡那霉素 | 索莱宝 | K8020 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| KH2PO4 | 麦克林 | P815661 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 甲醇 | 麦克林 | M813895 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 微生物微液滴培养系统（MMC） | 洛阳泰茂树生物科技有限公司 | MMC-I | 用于生长曲线测定和适应性进化实验。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| 微流控芯片 | 洛阳泰茂树生物科技有限公司 | MMC-ALE-OD | 用于多种液滴操作。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC 油 | 洛阳泰茂树生物科技有限公司 | MMC-M/S-OD | 微液滴微流控中的油相。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | 国药集团化学试剂北京有限公司 | 20026118 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| NaCl | 国药集团 | G81793J | LB 培养基的组分 |
| Na2HPO4·12H2O | 国药集团 | G10267B | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| NH4Cl | 国药集团化学试剂北京有限公司 | 10001518 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 培养皿 | 康宁公司（Corning Incorporated） | 90 mm | 用于固体培养基的制备 |
| 移液器 | 艾本德（eppendorf） | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | 用于液体转移 |
| 快速接头 A | 洛阳泰茂树生物科技有限公司 | — | 用于各接口的连接。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/ |
| 试剂瓶 | 洛阳泰茂树生物科技有限公司 | MMC-PCB | 用于菌液和试剂的取样与储存。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/ |
| 摇瓶 | 联科生物 | 50 mL | 用于微生物培养 |
| 摇床培养箱 | 上海苏坤工业有限公司 | SKY-210 2B | 用于摇瓶中的微生物培养 |
| 硫酸链霉素 | 索莱宝 | S8290 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 注射器 | 江苏知雨医疗器械有限公司 | 10 mL | 用于吸取液体并注入试剂瓶 |
| 注射器针头 | 欧贝尔五金店 | 22G | 内径为 0.41 mm，外径为 0.71 mm |
| 胰蛋白胨 | Oxoid Ltd. | LP0042 | LB 培养基的组分 |
| 超低温冰箱 | 三洋超低温（SANYO Ultra-low） | MDF-U4086S | 用于菌种保藏（-80 °C） |
| 紫外-可见分光光度计（UV–Vis spectrophotometer） | 通用电气公司（General Electric Company） | Ultrospec 3100 pro | 用于 OD 值的测定 |
| 维生素 B1 | 索莱宝 | SV8080 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
| 酵母提取物 | Oxoid Ltd. | LP0021 | LB 培养基的组分 |
| ZnSO4·7H2O | 国药集团化学试剂北京有限公司 | 10024018 | MeSV2.2 特殊培养基的组分 |
参考文献
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.
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重印与许可
