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方法文章

使用微生物微滴培养系统（MMC）进行自动化微生物培养与适应性进化

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DOI：

10.3791/62800

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2022年2月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了如何使用微生物微滴培养系统（MMC）进行自动化的微生物培养和适应性进化研究。MMC 能够自动、连续地培养和传代微生物，并在线监测其生长情况，具有较高的通量和良好的平行性，可减少人力和试剂消耗。

摘要

传统的微生物培养方法通常操作繁琐、通量低、效率低，且消耗大量人力和试剂。此外，近年来发展的基于微孔板的高通量培养方法由于溶氧量低、混合效果差以及蒸发和热效应严重，导致微生物生长状态不佳和实验平行性差。由于微液滴具有体积小、通量高、可控性强等诸多优势，基于液滴的微流控技术可克服上述问题，已被广泛应用于高通量微生物培养、筛选与进化研究中。然而，大多数先前的研究仍 停留在实验室构建与应用阶段。一些关键问题，如操作要求高、构建难度大以及缺乏自动化集成技术，限制了微液滴微流控技术在微生物研究中的广泛应用。本文成功开发了一种基于微液滴微流控技术的自动化微生物微液滴培养系统（MMC），实现了微生物液滴培养过程中所需的接种、培养、在线监测、传代、分选和取样等功能的集成。在本实验方案中，以野生型大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）MG1655和一种依赖甲醇的E. coli菌株（MeSV2.2）为例，详细介绍了如何利用MMC系统进行自动化且相对高通量的微生物培养与适应性进化研究。该方法操作简便，人力与试剂消耗少，实验通量高，数据平行性好，相较于传统培养方法具有显著优势，为科研人员开展相关微生物研究提供了一个低成本、易操作且结果可靠的实验平台。

引言

微生物培养是微生物学科学研究和工业应用的重要基础，广泛应用于微生物的分离、鉴定、重构、筛选及进化等过程1,2,3。传统的微生物培养方法主要采用试管、摇瓶和固体培养皿作为培养容器，结合摇床培养箱、分光光度计、酶标仪等设备进行微生物的培养、检测与筛选。然而，这些方法存在操作繁琐、通量低、效率低下以及人力和试剂消耗大等诸多问题。近年来发展的高通量培养方法主要基于微孔板。但微孔板存在溶氧水平低、混合性能差、蒸发严重以及热效应显著等问题，常导致微生物生长状态不佳和实验平行性差4,5,6,7；另一方面，其实现自动化培养和过程检测需配备液体处理工作站、酶标仪等昂贵设备8,9。

作为微流控技术的一个重要分支，液滴微流控技术近年来在传统连续流微流控系统的基础上发展而来。它是一种离散流微流控技术，利用两种互不相溶的液相（通常为油-水体系）生成分散的微液滴并对这些液滴进行操作10。由于微液滴具有体积小、比表面积大、内部传质速率高以及因空间隔离而避免交叉污染等特点，同时具备液滴操控性强和高通量的优势，已有大量研究将液滴微流控技术应用于微生物的高通量培养、筛选与进化过程11。然而，要实现液滴微流控技术的普及化和广泛应用，仍存在一系列关键问题亟待解决。首先，液滴微流控的操作繁琐复杂，对操作人员的技术要求较高。其次，液滴微流控技术融合了光学、机械和电子元件，并需与生物技术应用场景相结合，若缺乏多学科协作，单一实验室或团队难以构建高效的液滴微流控控制系统。第三，由于微液滴体积极小（从皮升级（pL）到微升级（μL）），在实现诸如传代培养、分选和取样等基本微生物操作时，难以实现液滴的精确自动化控制和实时在线检测，同时也难以构建集成化的设备系统12。

为了解决上述问题，基于液滴微流控技术成功开发了一种自动化的微生物微液滴培养系统（Microbial Microdroplet Culture system, MMC）13。该MMC系统由四个功能模块组成：液滴识别模块、液滴光谱检测模块、微流控芯片模块和取样模块。通过对各模块的系统集成与控制，实现了液滴的生成、培养、检测（光密度（OD）和荧光）、分裂、融合、分选和取样等操作的自动化，从而集成了微生物液滴培养过程中所需的接种、培养、监测、传代、分选和取样等功能。MMC系统最多可容纳200个体积为2–3 µL的平行液滴培养单元，相当于200个摇瓶培养单元。该微液滴培养系统能够满足微生物生长过程中无污染、溶解氧供应、混合以及物质与能量交换的要求，并通过多种集成功能满足微生物研究的各类需求，例如生长曲线测定、适应性进化、单因素多水平分析以及基于荧光检测的代谢物研究与分析13,14。

本文详细介绍了如何利用微生物连续培养系统（MMC）进行自动化微生物培养与适应性进化实验。图1）。我们采用了野生型 大肠杆菌 (大肠杆菌以 MG1655 为例演示生长曲线的测定及甲醇依赖性 E. coli 毒株 MeSV2.215 为展示微液滴微流控系统（MMC）中的适应性进化过程，开发了一套MMC操作软件，使操作过程极为简便直观。整个实验流程中，用户仅需准备初始菌液，设定MMC的运行条件，随后将菌液及相关试剂注入MMC装置。此后，MMC将自动完成微液滴生成、识别与编号、培养及适应性进化等操作，并以高时间分辨率对微液滴进行在线检测（OD与荧光），同时在软件界面实时显示相关数据（可导出）。操作人员可根据实时结果随时终止培养过程，并提取目标微液滴用于后续实验。该MMC系统操作简便，人力与试剂消耗低，实验通量相对较高，数据平行性良好，相较于传统培养方法具有显著优势。为研究人员开展相关微生物学研究提供了一个低成本、易操作且稳定的实验平台。

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方案

1. 仪器与软件安装

  1. 选择一个洁净且无菌的环境（例如超净工作台）作为MMC的专用固定空间，并将MMC稳定安装在该位置。
    注意：使MMC远离强电场、强磁场和强热辐射源的干扰，避免剧烈振动影响光学检测组件。为MMC提供AC220 V、50 Hz的电源。有关MMC的详细信息，请参见材料表及MMC的网站16。
  2. 从MMC.zip文件中安装操作软件
    注意：请联系作者获取MMC.zip文件。
    1. 创建一个专用文件夹，并将压缩文件保存其中。
    2. 再创建另一个专用文件夹作为“安装目录”。解压MMC.zip文件，并将解压后的文件保存至该新文件夹中。
      注意：计算机配置建议满足以下条件：（1）Windows 7 64位或更高版本操作系统；（2）CPU：i5或更高；（3）内存：4 GB或以上；（4）硬盘：300 GB或以上（转速大于7200 rpm或固态硬盘）。

2. 准备工作

  1. 连接注射器针头（内径为0.41 mm，外径为0.71 mm）、快接接头A和试剂瓶图2C），并在高压灭菌器中于 121 °C 15分钟。
    注意：灭菌时将试剂瓶盖略微拧松。每次可多准备几瓶试剂以备使用。
  2. 使用一个 0.22 µm 聚偏氟乙烯（PVDF）滤膜过滤MMC油。将微流控芯片（图 2B将MMC油提前放入洁净工作台，并在使用前用紫外线照射灭菌30分钟。
    注意：有关快速连接器A、试剂瓶、MMC油和微流控芯片的详细信息，请参见 材料清单.
  3. 安装微流控芯片
    1. 打开操作室的门（图2A）并抬起光纤探头。
    2. 将电场孔与电场针准直，轻柔地将芯片放置在芯片基座上。然后将两个定位柱插入定位孔中，并放下光纤探头图 2D).
    3. 根据位置编号将芯片上的快接接头A连接到MMC对应的端口（C5-O5、C4-O4、C6-O6、C2-O2、CF-OF、C1-O1、C3-O3）。然后关闭操作室的门。
  4. 使用前，在油瓶中补充MMC油（约80 mL），并清空废液瓶中的废液。
    注意：废液通常为有机废液。处理时请参照当地法律法规，具体规定可能因实验设置不同而有所变化。

3. 在MMC中测量生长曲线

  1. 初始细菌溶液的制备
    1. 按照相关标准规程配制Luria-Bertani（LB）培养基，并在121°C下高压灭菌15分钟。
      注：LB培养基的成分：NaCl（10 g/L）、酵母提取物（5 g/L）和胰蛋白胨（10 g/L）。
    2. 从甘油保藏菌种中取出大肠杆菌（E. coli）MG1655菌株，在50 mL三角摇瓶中加入10 mL LB培养基，于37 °C、200 rpm条件下在摇床中培养5–8小时。
      注：培养时间取决于具体菌株，最佳状态是将菌株培养至对数生长期。
    3. 用新鲜培养基将培养后的大肠杆菌（E. coli）MG1655菌液稀释至OD600为0.05–0.1，得到初始细菌溶液（准备约10 mL）。
  2. 点击初始化以启动微液滴培养系统（MMC）。初始化界面出现后，将培养温度设置为37 °C，光电信号值设置为0.6（图3A）。初始化过程约需20分钟。
  3. 在初始化过程中打开紫外灯（波长254 nm）。
  4. 将初始细菌溶液和MMC油注入试剂瓶中。
    1. 在洁净工作台上取出一个已灭菌的试剂瓶，并拧紧瓶盖。
    2. 使用10 mL无菌注射器，通过侧管的针头向试剂瓶内注入3–5 mL的MMC油。缓慢倾斜并旋转试剂瓶，使油充分浸润瓶内壁。
    3. 注入约5 mL初始细菌溶液，然后再次注入5–7 mL油，将试剂瓶充满。
    4. 拔出独立的快速接头A，将试剂瓶的快速接头A插入其对应的快速接头B，完成样品注入操作（图4A）。
  5. 等待初始化结束后，关闭紫外灯（波长254 nm）。
  6. 打开操作室门，将试剂瓶放入金属浴中。
  7. 拔出芯片的C2接头和试剂瓶的快速接头A，将试剂瓶的侧管接头连接至C2接头，顶部管路接头连接至O2接头，然后关闭操作室门。
  8. 点击生长曲线，选择生长曲线测定功能（图3A）。在参数设置界面中，输入数量为15，开启OD检测开关，并将波长设置为600 nm。点击开始以启动液滴生成，过程约需10分钟。
    注：此处数量指待生成液滴的数量，波长指待检测OD的波长。根据实验需求设置数量（最大200）和波长（350–800 nm）。
  9. 当主界面弹出提示“请移除C2与O2之间的试剂瓶，完成后点击‘确定’按钮”时，打开操作室门，取出试剂瓶，并连接C2与O2接头。
  10. 关闭操作室门，点击弹出窗口中的确定按钮，系统将自动培养液滴并检测OD值。
    注：MMC在液滴通过光纤探头时检测OD值，因此检测周期取决于生成的液滴数量。
  11. 当生长曲线进入稳定期后，点击数据导出按钮导出OD数据。选择数据保存路径，以.csv格式导出培养期间记录的OD值，该文件可用相应软件（如Microsoft Excel）打开。随后使用绘图软件（如EXCEL或Origin 9.0）绘制生长曲线。
    注：在培养过程中，可随时点击数据导出按钮，导出当前所有液滴的OD数据。

4. 在MMC中的适应性进化

  1. 初始细菌溶液的制备
    1. 按照相关标准规程配制 MeSV2.2 专用液体培养基和固体平板，并在 121 °C 下高压灭菌 15 min。
      注：专用培养基的成分参见表 1和材料表。
    2. 将 MeSV2.2 接种于固体平板（直径 = 90 mm），在 37 °C 恒温培养箱中培养 72 h。挑取单菌落，接种至含 10 mL 专用液体培养基的 50 mL 三角摇瓶中，在 37 °C、200 rpm 摇床中培养 72 h。
    3. 用培养基将培养后的 MeSV2.2 溶液稀释至 OD600 为 0.1–0.2（确保总体积不少于 10 mL），继续在三角摇瓶中培养 5 h，获得初始细菌溶液。
      注：MeSV2.2 是一种依赖甲醇的 E. coli 菌株。专用液体培养基中含有 500 mmol/L 甲醇，对 MeSV2.2 构成强烈胁迫，导致其生长极为缓慢。请注意，此处获得初始细菌溶液的方法与步骤 3.1 中所述不同。
  2. 按照步骤 3.2、3.3 和 3.5 初始化 MMC。
  3. 取出两个已灭菌的试剂瓶，分别用于盛装初始细菌溶液和新鲜培养基。按照步骤 3.4 所述，向试剂瓶中注入初始细菌溶液（5 mL）、新鲜培养基（12–15 mL）以及 MMC 油。
    注：由于适应性进化是一个涉及多次传代的长期过程，应尽可能多地在 MMC 中储存新鲜培养基。实验运行期间无法补充培养基。
  4. 按照步骤 3.6 将两个试剂瓶安装至 MMC。将用于初始细菌溶液的试剂瓶安装在 C2 与 O2 连接口之间，将用于新鲜培养基的试剂瓶安装在 C4 与 O4 连接口之间。
  5. 点击适应性进化（ALE）以选择适应性进化功能（图 3B）。在参数设置界面中，打开OD 检测开关。
  6. 设置数量（Number）为 50，波长（Wavelength）为 600 nm，浓度（Concentration）为 0%，类型（Type）为时间，参数（Parameter）为 30 h，重复次数（Repetitions）为 99。点击开始（Start）启动液滴生成，过程约需 25 min。
    注：此处“浓度”指适应性进化中化学因子的最高浓度。在 MMC 中可实现为不同液滴引入不同浓度的化学因子，从而提供不同的生长条件。化学因子引入浓度可通过以下公式计算：
    等差数列公式：\(C = a + \frac{b-a}{7} \times i\)，其中 \(i = 1, 2, ..., 7\)。
    其中“C”指引入液滴的化学因子浓度；“a”指安装在 C4 与 O4 连接口之间试剂瓶中的化学因子浓度；“b”指安装在 C6 与 O6 连接口之间试剂瓶中的化学因子浓度；“i”指可选浓度序号。MMC 中共有八种浓度可选。由于本实验中化学因子为单一浓度（500 mmol/L 甲醇），且为培养基组分之一，仅安装一个含该化学因子的试剂瓶，因此将浓度（Concentration）设为 0%。类型（Type）指传代模式，分为三种：时间模式、OD 值模式和荧光模式。前者指固定培养时间后传代，后两者指培养至预设 OD 值或荧光强度后传代。参数（Parameter）指选择传代模式时所需的相应参数。重复次数（Repetitions）指传代次数。
  7. 按照步骤 3.8 移除安装在 C2 与 O2 连接口之间的试剂瓶。
  8. 观察每次传代周期内液滴的最大 OD 值是否显著增加。若出现增长且满足实验要求，按照步骤 3.9 点击数据导出（Data Export）按钮导出 OD 数据。
    注：此处传代周期取决于参数（Parameter）。例如，当设置类型（Type）为时间、参数（Parameter）为 30 h 时，传代周期为 30 h。每个传代周期内均有液滴的最大 OD 值。通过最大 OD 值的增长情况评估适应性进化是否满足实验要求（增长幅度取决于菌株实际培养过程，例如增长超过 20%）。
    警告：注意观察储存的新鲜培养基是否耗尽。若培养基耗尽后仍未出现显著增长，应提取生长较好的液滴，开展新一轮适应性进化。
  9. 从 MMC 中提取目标液滴。
    1. 点击筛选（Screening）按钮选择液滴提取功能（图 3C）。选择收集（Collect）选项，点击目标液滴编号，然后点击确定（OK）。
      注：液滴筛选包括“收集”、“丢弃”和“提取种子液”。“提取种子液”指在传代操作后收集剩余液滴13。
    2. 等待弹出窗口提示“请拔出 CF 快速接头并插入 EP 管”。根据软件提示将 CF 快速接头插入微量离心管中进行收集，然后点击确定（OK）（图 4D）。
    3. 1–2 min 后，软件界面将弹出新窗口提示“请重新插入接头并在完成后点击确定（OK）”。随后将 CF 快速接头重新插入并点击确定（OK），使 MMC 继续运行（图 4D）。当下一个目标液滴到达液滴识别位点时，重复步骤 4.9.2–4.9.3 以收集该液滴。
      注：所有目标液滴收集完毕后，MMC 将继续培养剩余液滴。若无需继续培养，可点击停止以直接终止操作。
    4. 使用 2.5 µL 移液器吸取液滴，滴加至 90 mm 琼脂糖平板上，用边长为 3 cm 的三角玻璃涂布棒均匀涂布。随后在 37 °C 恒温培养箱中培养 72 h。
    5. 挑取 3–5 个独立菌落，分别接种于含 10 mL 新鲜培养基的 50 mL 三角摇瓶中，在 37 °C、200 rpm 摇床中培养 48–72 h。按照相关标准规程将培养后的菌液分装至甘油管中保存，用于后续实验。

5. MMC 的清洗

  1. 实验结束后，单击停止以终止所有操作，然后单击清洗以清洗芯片和管路，此过程约需15分钟。

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结果

本方案采用 E. coli 以MG1655和MeSV2.2菌株为例，演示在MMC中采用自动化且相对高通量策略进行微生物培养及依赖甲醇的适应性进化。通过测定生长曲线主要用于表征微生物的培养特性。适应性进化过程通过自动化连续传代培养实现，并在每次传代过程中添加高浓度甲醇作为选择压力。通过监测每次传代周期中液滴最大OD值的变化趋势，评估适应性进化是否实现。MMC的可调参数与精度参数如图所示。 Table 2.

生长曲线测定结果
在培养约 20 小时后，从 MMC 中导出了培养过程中检测到的 15 个液滴的 OD600 值（图 5A）。可以看出，检测间隔约为每 14 分钟一次。该检测周期取决于生成液滴的数量，因为在培养过程中液滴在管道中往复循环，只有当液滴经过光纤探头时，检测模块才会检测其 OD 值（OD 值的检测与计算方法见补充图 ...

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讨论

本方案介绍了如何使用微生物微滴培养系统（Microbial Microdroplet Culture system, MMC）进行自动化微生物培养和长期适应性进化。MMC是一种微型化、自动化、高通量的微生物培养系统。与传统的微生物高通量培养方法和仪器相比，MMC具有多项优势，包括人力和试剂消耗低、操作简便、可在线检测（OD和荧光）、高时间分辨率数据采集以及优异的并行处理能力。此外，MMC还具备一些区别于传统微液滴微流控技术的特殊优势，后者通常使用皮升级（pL）和纳升级（nL）液滴。大多数先前报道的基于pL和nL液滴的系统在培养性能方面表现较差，且可检测参数较少（通常仅限荧光）。18,19,20,21尽管已有一些平台能够实现更优的培养性能和多参数检测，但其实现难度较大且需要耗费大量精力。例如，有研究人员报道了对皮升级液滴的OD检测，该方法基于图像识别，不仅存在假阳性问题，还需要进一步验...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到中国国家重点研发计划（2018YFA0901500）、国家自然科学基金国家重大科研仪器研制项目（21627812）以及清华大学自主科研计划项目（20161080108）的支持。我们还感谢瑞士苏黎世联邦理工学院生物系微生物研究所 Julia A. Vorholt 教授（苏黎世 8093，瑞士）提供甲醇依赖型 E. coli 毒株版本2.2（MeSV2.2）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm PVDF 滤膜Merck Millipore Ltd.SLGPR33RB对 MMC 油进行灭菌
4 °C 冰箱海尔BCD-289BSW用于试剂储存
琼脂碧迪公司（Becton, Dickinson and Company）214010用于固体培养基的制备
CaCl2·2H2O国药集团化学试剂北京有限公司20011160MeSV2.2 特殊培养基的组分
洁净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司DL-CJ-INDII用于无菌操作和紫外灭菌
CoCl2·6H2O国药集团化学试剂北京有限公司10007216MeSV2.2 特殊培养基的组分
计算机联想E450软件安装和 MMC 控制
恒温培养箱上海齐欣科学仪器有限公司LRH 250用于固体培养基的微生物培养
CuSO4·5H2O国药集团化学试剂北京有限公司10008218MeSV2.2 特殊培养基的组分
电子天平OHAUSAR 3130用于试剂称量
EP 管赛默飞世尔科技1.5 mL用于液滴收集
FeCl3·6H2O国药集团化学试剂北京有限公司10011928MeSV2.2 特殊培养基的组分
冻存管赛默飞世尔科技2.0 mL用于菌种保藏
葡萄糖酸盐Sigma-AldrichS2054MeSV2.2 特殊培养基的组分
甘油国药集团G66258A用于菌种保藏
高压蒸汽灭菌锅三洋电机（SANYO Electric）MLS3020用于高压蒸汽灭菌
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）Biotopped420322MeSV2.2 特殊培养基的组分
硫酸卡那霉素索莱宝K8020MeSV2.2 特殊培养基的组分
KH2PO4麦克林P815661MeSV2.2 特殊培养基的组分
甲醇麦克林M813895MeSV2.2 特殊培养基的组分
MgSO4·7H2OBIOBYING1305715MeSV2.2 特殊培养基的组分
微生物微液滴培养系统（MMC）洛阳泰茂树生物科技有限公司 MMC-I用于生长曲线测定和适应性进化实验。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
微流控芯片洛阳泰茂树生物科技有限公司MMC-ALE-OD用于多种液滴操作。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
MMC 油洛阳泰茂树生物科技有限公司MMC-M/S-OD微液滴微流控中的油相。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2国药集团化学试剂北京有限公司20026118MeSV2.2 特殊培养基的组分
NaCl国药集团G81793JLB 培养基的组分
Na2HPO4·12H2O国药集团G10267BMeSV2.2 特殊培养基的组分
NH4Cl国药集团化学试剂北京有限公司10001518MeSV2.2 特殊培养基的组分
培养皿康宁公司（Corning Incorporated）90 mm用于固体培养基的制备
移液器艾本德（eppendorf）2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL用于液体转移
快速接头 A洛阳泰茂树生物科技有限公司—用于各接口的连接。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
试剂瓶洛阳泰茂树生物科技有限公司MMC-PCB用于菌液和试剂的取样与储存。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
摇瓶联科生物50 mL用于微生物培养
摇床培养箱上海苏坤工业有限公司SKY-210 2B用于摇瓶中的微生物培养
硫酸链霉素索莱宝S8290MeSV2.2 特殊培养基的组分
注射器江苏知雨医疗器械有限公司10 mL用于吸取液体并注入试剂瓶
注射器针头欧贝尔五金店22G内径为 0.41 mm，外径为 0.71 mm
胰蛋白胨Oxoid Ltd.LP0042LB 培养基的组分
超低温冰箱三洋超低温（SANYO Ultra-low）MDF-U4086S用于菌种保藏（-80 °C）
紫外-可见分光光度计（UV–Vis spectrophotometer）通用电气公司（General Electric Company）Ultrospec 3100 pro用于 OD 值的测定
维生素 B1索莱宝SV8080MeSV2.2 特殊培养基的组分
酵母提取物Oxoid Ltd.LP0021LB 培养基的组分
ZnSO4·7H2O国药集团化学试剂北京有限公司10024018MeSV2.2 特殊培养基的组分

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