使用微生物滴培养系统（MMC）的自动微生物培养和适应性进化

Summary

该协议描述了如何使用微生物滴培养系统（MMC）进行自动微生物培养和适应性进化。MMC可以自动连续地培养和分培养微生物，并在线监测其生长，具有相对较高的通量和良好的并行化性，减少了劳动力和试剂消耗。

Abstract

传统的微生物培养方法通常操作繁琐，通量低，效率低，消耗大量劳动力和试剂。此外，近年来开发的基于微孔板的高通量培养方法由于其溶解氧低，混合物不良以及严重的蒸发和热效应，微生物生长状况较差，实验平行化程度低。由于微液滴的诸多优点，如体积小、通量高、可控性强等，液滴基微流控技术可以克服这些问题，已应用于多种高通量微生物培养、筛选、进化的研究。然而，大多数先前的研究仍处于实验室建设和应用阶段。一些关键问题，如操作要求高，施工难度高，缺乏自动化集成技术，限制了液滴微流控技术在微生物研究中的广泛应用。在这里，基于液滴微流技术成功开发了一种自动化微生物微滴培养系统（MMC），实现了微生物液滴培养过程中所需的接种、培养、在线监测、亚培养、分选、取样等功能的集成。以野生型大肠杆菌MG1655和甲醇必需大肠杆菌菌株（MeSV2.2）为例，详细介绍了如何使用MMC进行自动化和相对高通量的微生物培养和适应性进化。该方法操作简便，消耗的人工和试剂少，实验通量高，数据并行度好，与常规培养方法相比具有很大的优势。它为科研人员开展相关微生物研究提供了一个低成本、操作友好、结果可靠的实验平台。

Introduction

微生物培养是微生物科学研究和工业应用的重要基础，广泛应用于微生物的分离、鉴定、重建、筛选和进化^1，2，3。传统的微生物培养方法主要采用试管、摇瓶、实心板作为培养容器，结合振荡培养箱、分光光度计、酶标仪等设备进行微生物培养、检测和筛选。但是，这些方法存在许多问题，例如操作繁琐，通量低，效率低，消耗大量劳动力和试剂。近年来开发的高通量培养方法主要基于微孔板。但微孔板溶解氧水平低，混合性能差，蒸发和热效应严重，往往导致微生物生长状态和实验平行化不良^{4，5，6，7};另一方面，它需要配备昂贵的设备，如液体处理工作站和酶标仪，以实现自动化培养和过程检测^8，9。

作为微流控技术的一个重要分支，液滴微流体近年来在传统的连续流微流体系统的基础上发展起来。它是一种离散流动微流体技术，它使用两个不混溶的液相（通常是油 - 水）来产生分散的微液滴....

Protocol

1. 仪器和软件安装

1. 选择清洁无菌环境（如洁净工作台）作为MMC的专用永久空间。在空间中稳定地安装MMC。
   注意:使MMC远离强电场，磁场和强热辐射源的干扰。避免剧烈振动影响光学检测元件。向MMC提供AC220 V，50 HZ的电源。有关 MMC 的详细信息，请参阅 材料表 和 MMC^{16 的网站}。
2. 从 MMC.zip 文件安装操作软件
   注意:请与作者联系以获取 MMC.zip文件。
   1. 创建一个专用文件夹并将 zip 文件保存在其中。
   2. 创建另一个专用文件夹作为"安装目录"。解压缩 MMC.zip并将文件保存在新文件夹中。
      注:计算机配置最好满足:（1）Windows 7 64位操作系统或更高版本;（2） CPU:i5以上;（3）内存:4GB以上;（4）硬盘:300GB以上（转速大于7200转/分或固态硬盘）。

2. 准备工作

1. 连接注射器针头（内径为0.41 mm，外径为0.71 mm），快速接头A和试剂瓶（图2C），并在121°C下高压灭菌15分钟。
   注意:灭菌期间，请略微拧下试剂瓶的盖子。每次可以再准备几个试剂瓶....

Results

该协议使用 大肠杆菌 MG1655和MesV2.2菌株作为示例，以展示MMC中具有自动化和相对高通量策略的微生物培养和甲醇必需的适应性进化。生长曲线测量主要用于表征微生物培养。通过自动连续亚培养和在每个亚培养过程中加入高浓度甲醇作为选择压力进行适应性进化。通过每个次培养期间液滴最大OD值的变化趋势来估计是否实现了适应性进化。MMC的可调参数和精度参数如 表 2所示。

生长曲线测量结果
在培养过程中检测到的15个液滴的OD₆₀₀ 值在培养约20小时后从MMC输出（图5A）。可以观察到，检测大约每14分钟进行一次。该检测周期取决于产生的液滴数量，因为液滴在培养管中来回循环，检测模块仅在液滴通过光纤探头时检测OD值（OD值的检测和计算见 补充图 1）。因此，14分钟的检测周期非常短，提供了高时间分辨率的检测过程，以更.......

Discussion

该协议介绍了如何使用微生物滴培养系统（MMC）进行自动微生物培养和长期适应性进化。MMC是一种小型化，自动化和高通量微生物培养系统。与传统的微生物高通量培养方法和仪器相比，MMC具有劳动力和试剂消耗少、操作简单、在线检测（OD和荧光）、高时间分辨率数据采集、超并行化等诸多优点。MMC还具有一些与常规液滴微流体技术不同的特殊优势，后者通常使用pL和nL液滴。以前报道的大多数使用pL和nL液滴的系统具有较差的培养性能和很少的可检测参数（通常只有荧光）^{18，19，20，21}。虽然已经有一些平台可以实现更好的栽培性能和多参数检测，但难度很大，需要付出很多努力。例如，一些研究人员报告了pL液滴的OD检测。它基于图像识别，不仅有误报，还需要进一步验证精度²²。但是，MMC可以通过相对简单的方式完成这些操作。MMC使用很少报告的微升（μL）液滴。MM.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PVDF 滤膜	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	MMC 油进行
4 & 度消毒;C 冰箱	海尔	BCD-289BSW	用于试剂储存
琼脂	Becton， Dickinson and Company	214010	用于固体板制备
CaCl2·2H2O	国药化学试剂北京有限公司	20011160	MeSV2.2 特殊培养基的组分。
洁净工作台	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co.， Ltd.	DL-CJ-INDII	用于无菌作和紫外线灭菌
CoCl2·6H2O	国药化学试剂北京有限公司	10007216	MeSV2.2 特殊培养基的组分。
电脑	联想	E450	软件安装及MMC控制
恒温培养箱	上海奇信科学仪器有限公司	LRH 250	用于使用固体培养基的微生物培养
CuSO4·5H2O	国药化学试剂北京有限公司	10008218	MeSV2.2 特殊培养基的组分。
电子天平	OHAUS	AR 3130	用于试剂称量
EP 管	Thermo Fisher	1.5 mL	用于液滴收集
FeCl3·6H2O	国药化学试剂北京有限公司	10011928	MeSV2.2 特殊培养基的组分。
冻存管	Thermo Fisher	2.0 mL	用于菌株保存
葡萄糖酸盐	Sigma-Aldrich	S2054	MeSV2.2 特殊培养基的组分。
甘油	GENERAL-REAGENT	G66258A	用于菌株保存
高压蒸汽灭菌壶	SANYO Electric	MLS3020	用于高压灭菌
异丙基-β;-d-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）	生物拓扑	420322	MeSV2.2 特殊培养基的成分。
硫酸卡那霉素	Solarbio	K8020	MeSV2.2 特殊培养基的组分。
KH2PO4	MACKLIN	P815661	MeSV2.2 特殊培养基的组分。
甲醇	MACKLIN	M813895	MeSV2.2 专用培养基的组分。
MgSO4·7H2O	生物1305715		MeSV2.2 特殊介质的组成部分。
微生物微滴培养系统 （MMC）	洛阳 TMAXTREE Biotechnology Co.， Ltd.	MMC-I	进行生长曲线测定和适应性进化。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
微流控芯片	洛阳TMAXTREE生物科技有限公司。	MMC-ALE-OD	用于各种液滴作。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
MMC石油	洛阳TMAXTREE生物科技有限公司。	MMC-M/S-OD	液滴微流体的油相。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2	国药化学试剂北京有限公司。	20026118	MeSV2.2 特殊培养基的组分。
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	LB 培养基的组分
Na2HPO4·12H2O	通用试剂		MeSV2.2 专用培养基的组分。
NH4Cl	国药化学试剂北京有限公司	10001518	MeSV2.2 特殊培养基的组分。
培养皿	Corning Incorporated	90 mm	用于制备固体培养基
Pipette	eppendorf	2.5 μL， 10 μL， 100μL， 1000&亩;L	液体处理
用 快速接头 A	洛阳TMAXTREE生物科技有限公司	—	用于每个关节的连接。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
试剂瓶	洛阳TMAXTREE生物科技有限公司。	MMC-PCB	细菌溶液和试剂的取样和储存。请参考 http://www.tmaxtree.com/en/
摇瓶	Union-Biotech	50 mL	用于微生物培养
摇床培养箱	上海苏坤实业有限公司	SKY-210 2B	用于摇瓶中微生物培养
链霉素	Solarbio	S8290	MeSV2.2 特殊培养基的组分。
注射器	江苏智宇医疗指导有限公司	10 mL	吸液注入试剂瓶
注射器针头	OUBEL 五金店	22G	内径为 0.41 毫米，外径为 0.71 毫米。
胰蛋白胨	Oxoid Ltd.	LP0042	LB 培养基的成分
超低温冰箱	SANYO 超低温	MDF-U4086S	用于菌株保存 （-80 °C）
紫外线–可见分光光度计	通用电气公司	Ultrospec 3100 pro	用于测量 OD 值
维生素 B1	Solarbio	SV8080	MeSV2.2 特殊培养基的成分。
酵母抽提	Oxoid Ltd.	LP0021	LB培养基
组分ZnSO4·7H2O	国药化学试剂北京有限公司	10024018	MeSV2.2 特殊培养基的组分。