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方法文章

用于 N-聚糖释放的双歧杆菌内糖苷酶的重组生产

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DOI：

10.3791/62804

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2021年7月20日

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1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, 5Evolve BioSystems Inc., 6Department of Biomedical Engineering, Karabuk University, 7Department of Chemistry, Hacettepe University

本文内容

摘要

双歧杆菌具有独特的基因组能力，可切割N-聚糖。重组表达这些酶将成为一种有前景的新工具，用于从富含糖蛋白的底物（如初乳）中释放生物活性N-聚糖。

摘要

蛋白质糖基化是一种多样且常见的翻译后修饰，与多种重要功能相关，包括蛋白质折叠、稳定性、酶保护作用以及生物识别等。连接在糖蛋白（如乳铁蛋白、乳黏附素和免疫球蛋白）上的N-聚糖无法被宿主消化，可到达大肠，并被某些有益微生物所利用。因此，它们被视为新一代益生元化合物，能够选择性地促进肠道微生物组中有益微生物的生长。然而，分离这些新型益生元需要新的酶类。本文描述了从不同双歧杆菌菌株（分离自婴儿、兔子、鸡和熊蜂）中重组表达新型糖苷酶的方法，以改进从糖蛋白中分离N-聚糖的效率。本研究中所述方法包括以下步骤：采用体内重组克隆策略对双歧杆菌基因进行分子克隆、转化成功与否的检测、蛋白质诱导表达以及蛋白质纯化。

引言

糖基化是一种在蛋白质中广泛存在的关键翻译后修饰。据估计，真核生物中超过50%的蛋白质以糖基化形式存在。N-糖基化和O-糖基化是糖基化的两种主要类型1,2。O-连接聚糖（O-聚糖）通过N-乙酰半乳糖胺共价连接至丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）氨基酸残基的羟基上。N-连接聚糖（N-聚糖）是复杂的寡糖，通过N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）连接至蛋白质中特定氨基酸序列AsN-X-Ser/Thr，以及较少见的AsN-X-Cys（半胱氨酸）中的天冬酰胺（Asn）残基上（其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸）3,4。N-聚糖的基本核心结构由两个HexNAc和三个甘露糖残基组成。该共同核心在糖基转移酶和糖苷酶的作用下进一步延伸，根据分支程度和连接类型的不同，形成不同类别的N-聚糖5。N-聚糖通常分为三大类：高甘露糖型（HM）、复杂型（CT）和杂合型（HY）6。

N-聚糖由于宿主生物缺乏糖苷水解酶而无法被消化。这些化合物以未消化的形式到达小肠/大肠，在那里成千上万种不同的细菌物种可利用它们，并可通过促进特定的肠道微生物（尤其是Bifidobacterium属物种）发挥益生元作用7。最近的研究表明，N-聚糖可选择性地刺激某些细菌物种的生长8,9。从牛乳糖蛋白中释放的N-聚糖可选择性地促进婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium longum亚种infantis，简称B. infantis）的生长，该菌是婴儿肠道中一种关键的双歧杆菌，而其他双歧杆菌物种如动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis，简称B. animalis）则不能利用这些化合物9。此外，最近一项体内研究表明，来自乳铁蛋白和免疫球蛋白的19种独特N-聚糖可选择性地促进B. infantis的生长8。 特别是，B. infantis具有裂解和代谢聚糖的基因组能力。一种属于糖基水解酶第18家族的内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（EndoBI-1），由B. infantis ATCC 15697重组表达，在体外条件下对乳源性糖蛋白表现出高活性9,10。这种新型糖苷水解酶能够切割N-聚糖中存在的N-N′-二乙酰壳二糖结构部分10,11。EndoBI-1的活性不受核心岩藻糖基化以及高温、pH、反应时间等不同反应条件的影响3,11,12。双歧杆菌糖苷水解酶的这一独特特性为从富含糖蛋白的底物（如牛初乳）中制备N-聚糖提供了有前景的工具13,14。

已有多种化学和酶法开发的去糖基化方法被广泛用于从糖蛋白中获取N-聚糖和O-聚糖2,15。由于操作简便、成本低且底物特异性高，化学方法在糖生物学中被广泛用于糖蛋白的去糖基化16。最常见的化学去糖基化方法包括β-消除法和肼解法17。其中，β-消除法基于将糖蛋白暴露于碱性条件下，从而裂解糖链的原理。释放的聚糖在此过程中可能因β-消除反应而降解，但可通过使用硼氢化钠（NaBH4）等还原剂避免该问题18,19,20。然而，β-消除法存在若干局限性：还原剂会将聚糖转化为糖醇，从而阻止其与荧光团或发色团结合，因此难以监测聚糖的释放19,20。此外，由于该方法清洗步骤中盐含量较高，可能导致洗脱时样品损失20。另一种从糖蛋白中释放聚糖的方法是肼解法，其原理是在糖蛋白中加入无水肼后发生水解反应。由于可通过调节温度等反应条件控制聚糖的分离，肼解法在糖生物学中已被广泛应用21。除上述方法外，还可使用无水氟化氢和三氟乙酸进行化学去糖基化16,22,23。酶法释放糖蛋白中的N-聚糖通常由肽基-N-糖苷酶（PNGases）完成，这类酶通常可释放各种大小和电荷的N-聚糖24,25,26,27。与化学去糖基化方法类似，酶法去糖基化过程也面临不同挑战。PNGases在多种去垢剂存在下仍具活性，这些去垢剂可提高酶对聚糖的可及性；然而，这些剧烈处理可能破坏天然聚糖结构及剩余多肽结构28。当岩藻糖连接至N-乙酰氨基葡萄糖时，PNGases可能无法裂解聚糖29。某些内切糖苷酶（如F1、F2和F3）在天然蛋白上的活性高于PNGases，但这些内切糖苷酶对多天线型聚糖的活性较低，而耐热新型内切糖苷酶EndoBI-1则对所有类型的N-聚糖均有效10,11,28。鉴于现有方法的局限性，显然仍需开发新型酶以实现无限制的有效聚糖释放。为此，双歧杆菌属含有大量编码多种糖苷水解酶的基因组岛，能够裂解糖蛋白中的N-聚糖30,31。在此背景下，本研究的总体目标是从不同双歧杆菌物种中发现新的糖苷酶。为实现这些酶的重组表达，计划采用不同的融合标签以提高其表达量和活性。

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方案

1. 双歧杆菌基因的分子克隆

  1. 通过三组载体引物（N-His、C-His 和 N-His SUMO）对目标基因进行 PCR 扩增
    1. 通过加入公司指定体积的无菌水，配制100 µM的引物（寡核苷酸）储备液。从该储备液中稀释制备10 µM的工作储备液，用于目标基因的PCR扩增。
    2. 在PCR管中配制PCR反应液（总体积50 µL），包含25 µL预混液、0.2 µM浓度的上下游引物各1 µL、DNase/RNase-free去离子水21 µL以及2 µL模板DNA（细菌细胞）。用移液器轻柔吹打混匀。
      注意：用于PCR的预混液（Lucigen）含有高纯度和高活性的Taq DNA聚合酶，可在较高温度下工作，可靠扩增长达5 kb的模板。
    3. 设定PCR程序如下：95 °C预变性5 min以释放基因组DNA，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性30 s、60 °C退火30 s、72 °C延伸1 min，最后在72 °C延伸10 min。
    4. 使用1%琼脂糖凝胶，在100 V条件下电泳60分钟后，通过凝胶成像系统进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将PCR产物与DNA Marker分别与上样染料按1:5的比例混合（5 µL PCR产物 + 1 µL上样染料，5 µL 1 kb DNA ladder + 1 µL上样染料），然后上样至凝胶中。图1).
    5. 在分子克隆步骤之前，使用荧光计测量PCR产物的DNA浓度。
      注意：PCR产物的浓度应处于分子克隆所需的范围内（25–100 ng/µL）。
  2. 用于分子克隆的LB（Lysogeny Broth）琼脂培养基的制备
    1. 将12.5 g LB和6 g琼脂糖溶解于500 mL去离子水中2O，并对LB琼脂培养基进行高压灭菌（121 °C，20 min）。
    2. 将15 mg卡那霉素溶于1 mL dH₂O中2O，并在 -20 °C 下保存。
    3. 高压灭菌后，向含有500 mL无菌LB琼脂培养基的瓶中加入1 mL卡那霉素，终浓度为30 µg/mL。在实验室操作柜中，将25 mL含卡那霉素的LB琼脂培养基倒入每个培养皿中。
  3. 化学感受态细胞的热激转化 E. coli 细胞
    1. 向每个含有 40 µL 感受态细胞的离心管中加入 1–3 µL（25 至 100 ng）各菌株的 PCR 产物 E. coli 细胞，然后向同一离心管中加入2 µL的载体DNA。用移液枪头轻轻搅匀，并将混合物转移至15 mL离心管中。
      注意：此步骤需在冰上操作。避免吹打混匀，以防产生气泡并意外升高细胞温度。
    2. 将含有感受态细胞和DNA的试管置于冰上孵育30分钟。在42 °C水浴中对混合物进行45秒的热激处理。立即将这些试管放回冰上，孵育2分钟。
    3. 向离心管中的细胞加入960 µL用于分子克隆后细胞快速复苏的复苏培养基，将离心管置于摇床培养箱中，在37 °C、250 rpm条件下孵育1小时。
    4. 在含有 30 µg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板上接种 100 µL 转化后的细胞。仅使用化学感受态 E. coli 细胞作为阴性对照。
      注意：将1.2.2步骤中制备的含30 µg/mL卡那霉素的LB琼脂平板提前放入37 °C培养箱中预热。
    5. 37 °C 常规大气环境下孵育所有培养皿过夜图2).
  4. 用于菌落PCR的LB培养基的制备
    1. 将7.5 g LB溶解于300 mL dH₂O中2将LB培养基装入瓶中，并在121 °C下高压灭菌20分钟。
    2. 将9 mg卡那霉素（30 µg/mL）溶于1 mL去离子水（dH₂O）中2O，并置于 -20 °C 保存。高压灭菌后，向含有 300 mL 无菌 LB 培养基的瓶中加入 1 mL 卡那霉素。将液体培养基贮存于 +4 °C，待用。
  5. 通过菌落PCR筛选转化子
    1. 为确认所有转化子均携带重组基因，随机挑选菌落，并使用克隆试剂盒提供的测序引物通过 PCR 扩增目标基因。
    2. 所有步骤均在冰上进行，使用前将所有PCR管和15 mL管预先冷却。
    3. 使用移液枪枪头将所选菌落的一半转移至每个样本的PCR管中。用移液枪枪头取另一半导入含有5 mL LB+卡那霉素液体培养基（步骤1.4中配制）的15 mL离心管中。涡旋振荡15 mL离心管，随后将液体培养物置于摇床培养箱中，在37 °C、250 rpm条件下过夜培养。
    4. 将50 µL PCR反应混合液（25 µL预混液、1 µL上游引物、1 µL下游引物、23 µL无DNase/RNase的去离子水）加入所有PCR管中，轻轻吹打混匀以分散细胞。
    5. 将PCR程序设置为：95 °C 预变性5 min，以裂解细菌细胞释放基因组DNA；随后进行40个循环，每个循环包括95 °C 变性30 s、60 °C 退火30 s、72 °C 延伸1 min；最后在72 °C 下终延伸10 min。
    6. 通过1%琼脂糖凝胶在100 V条件下电泳60分钟后，采用凝胶电泳法检测PCR产物图3）。DNA凝胶电泳的详细步骤见1.1.3。
    7. 制备成功转化子的15%甘油菌种。向冻存管中加入500 µL 60%甘油溶液，再加入1,500 µL成功转化子的液体培养物。将制备好的菌种保存于-80 °C。

2. L-鼠李糖诱导蛋白表达

  1. 在含有30 µg/mL卡那霉素的1 L LB液体培养基中制备预培养液。
  2. 将8 mL LB培养基加入50 mL离心管中。取其中一管作为阴性对照，仅含液体培养基。以20% L-鼠李糖作为储备液时，将0.5 g L-鼠李糖溶于2.5 mL dH₂O中2O，并在使用前于 -20 °C 保存。
  3. 将10 µL菌种加入含有8 mL液体培养基的离心管中。轻轻涡旋混匀，置于37 °C摇床中过夜培养。
  4. 将250 mL LB液体培养基倒入一个已灭菌的2 L锥形瓶中。
  5. 将2.5 mL过夜液体培养物接种至含有LB液体培养基的2 L三角瓶中，培养基体积与三角瓶容量之比为1:100，在摇床培养箱中37 °C、150 rpm条件下振荡培养4 h。
  6. 在 600 nm 处测量光密度（OD600使用分光光度计测定细菌细胞的光密度。当细胞达到0.5–0.6的光密度时，向250 mL LB培养液中加入2.5 mL 20%鼠李糖溶液（终浓度为0.2%），在摇床培养箱中于37 °C、250 rpm条件下过夜培养。
  7. 将液体培养物转移至5个50 mL离心管中，以3724 × g离心样品 g 在4°C下离心15分钟，弃去上清液。将沉淀物保存在-20°C，直至进行纯化步骤。
    ​注意：为了通过SDS-PAGE检测蛋白质表达，需在培养物处于光密度600 nm为0.5–0.6时（未加L-鼠李糖）收集1 mL未诱导样品作为对照，并在过夜诱导培养后收集1 mL诱导样品。将所有样品在12,000 x g 1分钟，分别用50 µL和100 µL的SDS-PAGE上样缓冲液重悬未诱导和诱导的样品。

3. 含有组氨酸标签酶的化学感受态 E. coli 细胞的裂解

  1. 配制 pH 8.0 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，1 mM 咪唑，1% SDS）、pH 7.4 平衡缓冲液（20 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM 咪唑）、pH 7.4 洗涤缓冲液（20 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，25 mM 咪唑）以及 pH 7.4 洗脱缓冲液（20 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM 咪唑）。
  2. 将含有细胞沉淀的 50 mL 离心管置于 -80 °C 冷冻 15 分钟，随后从 -80 °C 取出，在室温下解冻。
  3. 向沉淀中加入 5 mL dH2O，通过上下吹打溶解。在 +4 °C 条件下以 3724 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。
  4. 对于 50 mL 培养物的细胞沉淀，向其中加入 6,300 µL 裂解缓冲液和 63 µL 无 EDTA 的 Halt 蛋白酶抑制剂混合液（1:100 比例），通过上下吹打溶解。冰上孵育 30 分钟，每 10 分钟涡旋振荡一次。
  5. 将超声破碎仪的脉冲模式设置为开启 10 秒、关闭 59 秒，振幅设为 37%。将离心管置于盛有冰的烧杯中，并将超声探头浸入管内。
    注意：探头应完全浸入液体中，且不得接触管壁任何部位。
  6. 超声处理后（每次超声 10 秒，共 6 次，每次间隔 1 分钟冷却），在 +4 °C 条件下以 3,724 × g 离心 45 分钟。随后收集所有上清液至一新管中，并在 +4 °C 条件下以 3,724 × g 再次离心 5 分钟。
  7. 收集上清液至新管中，取 100 µL 样品用于第 4.7 步的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。使用荧光计测定样品的蛋白浓度。

4. 通过分批法纯化带组氨酸标签的酶

  1. 取1 mL Ni-NTA树脂加入离心管中，于700 × g 离心2分钟。小心取出离心管，弃去上清液。
  2. 向离心管中加入2 mL（两倍树脂体积）平衡缓冲液，充分混匀使树脂完全悬浮。于700 × g 离心2分钟，小心吸出并弃去缓冲液。
  3. 在离心管中按1:1比例混合蛋白提取物与平衡缓冲液。将混合液加入含树脂的离心管中，置于摇床以150 rpm振荡30分钟。于700 × g 离心2分钟，弃去上清液。
  4. 用5 mL洗涤缓冲液洗涤树脂，于700 × g 离心2分钟。重复洗涤步骤，直至上清液浓度降至基线水平。
  5. 向离心管中加入1 mL洗脱缓冲液，以洗脱结合的His标签蛋白。于700 × g 离心2分钟，收集上清液，并取100 µL用于步骤4.7的SDS-PAGE分析。重复洗脱步骤三次。使用荧光计测定每次洗脱所得上清液的蛋白浓度。
  6. 将所有上清液收集至10 kDa截留分子量的离心管中，于700 × g 离心2分钟。重复离心，期间偶尔吹打混合，直至上清液体积减少至200 µL。将纯化后的蛋白于-20 °C保存，并取100 µL用于步骤4.7的SDS-PAGE分析。
    注意：应测定蛋白浓度，若浓度较低，则继续离心浓缩至浓度升高。
  7. 纯化蛋白的SDS-PAGE分析
    1. 配制4%浓缩胶（40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺、1 M Tris pH 6.8、10% SDS、10%过硫酸铵、TEMED、dH2O）和12%分离胶（40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺、1 M Tris pH 8.8、10% SDS、10%过硫酸铵、TEMED、dH2O）。
    2. 按1:1比例将样品与2× Laemmli上样缓冲液混合，于95 °C孵育5分钟以变性蛋白。
      注意：上样前应测定样品蛋白浓度，根据浓度调整上样体积，确保各泳道蛋白上样量相等。
    3. 向电泳槽中加入1×电泳缓冲液，将样品和蛋白Marker加入加样孔中。初始电压设为80 V，当蛋白从浓缩胶进入分离胶后，将电压升至120 V。
    4. 将凝胶放入考马斯亮蓝染色液中，置于摇床染色30分钟。用脱色液（250 mL dH2O + 50 mL 乙酸（HOAc）+ 200 mL 甲醇）洗涤凝胶，拍摄图像（图4）。

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结果

本研究选取了来自不同来源的糖基水解酶家族酶。假设联合使用具有不同结构的酶可能实现更佳的聚糖释放效果，因为这些酶在进化上适应于在不同糖蛋白上发挥活性。目标基因及其来源列于 表1细菌菌株购自比利时微生物协调保藏中心。引物序列组根据制造商的说明书进行设计（补充表1）。N-His Kan 载体的正向和反向引物设计如下：F: 5'-CAT CAT CAC CAC CAT CAC XXX2 XXX3 XXX4 XXX5 XXX6 XXX7 XXX8 （XXX2-XXX8 代表靶编码区的第2至第8个密码子）和R：5'-GTG GCG GCC GCT CTA TTA XXXn XXXn-1 XXXn-2 XXXn-3 XXXn-4 XXXn-5 XXX...

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讨论

与传统的克隆方法相比，本研究所采用的体内重组克隆策略在目标基因的分子克隆中具有快速且可靠的优势。尽管目前已有多种便捷的分子克隆方法，但本文所述方法具备更多优点。体内克隆系统与其他克隆系统不同，无需对PCR产物进行任何酶处理或纯化步骤，也不存在序列连接位点的限制，亦无需限制性内切酶。在该系统中，只需将扩增后的基因与细胞及载体（随试剂盒提供）混合即可完成克隆，无需酶促连接反应。因此该方法被称为体内克隆，因为PCR产物末端与载体之间的重组发生在细胞内。该系统中的线性载体两端各含有18个核苷酸长度的黏性末端，且这两个序列彼此不互补。由于这一特性，载体可完全避免自连或序列反向插入的风险。用于扩增目标基因的引物需根据这些末端序列设计，以确保高效结合。克隆试剂盒中提供的N-His、C-His以及N-His SUMO载体，可实现目标基因的快速克隆，所表达蛋白带有氨基端或羧基端的6xHis亲和标签，可在天然或变性条件下实现蛋白的快速、简便亲和纯化。

尽管该克隆系统的转化成功率高于95%，但其少数缺点之一是感受态细胞无法在常规实验室条件下制备。含有...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK #118z146）和乌卢奥瓦乳品贸易有限公司（Uluova Süt Ticaret A.Ş）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EconoTaq PLUS 2X 主混合液Lucigen30035-1目的基因扩增（PCR）
无DNase/RNase的蒸馏水Invitrogen10977035目的基因扩增（PCR）
Safe-Red 上样染料abmG108-RDNA凝胶电泳
1 kb Plus DNA MarkerGoldBioD011-500DNA凝胶电泳
Qubit 蛋白检测试剂盒InvitrogenQ33211DNA浓度测定
LB培养基，Miller型（Luria-Bertani）amrescoJ106-2KG细菌培养基
琼脂糖Invitrogen16500-500细菌培养基等
卡那霉素单硫酸盐GoldBioK-120-5细菌培养基中的抗生素
Expresso 鼠李糖克隆与表达系统试剂盒，N-HisLucigen49011-1克隆试剂盒
Expresso 鼠李糖克隆与表达系统试剂盒，SUMOLucigen49013-1克隆试剂盒
Expresso 鼠李糖克隆与表达系统试剂盒，C-HisLucigen49012-1克隆试剂盒
甘油溶液Sigma-Aldrich15524-1L-R甘油菌保存液制备
L-鼠李糖一水合物Sigma-Aldrich83650蛋白表达诱导
2X Laemmli 上样缓冲液ClearBandTGS10SDS-PAGE分析
SureCast 40% (w/v) 丙烯酰胺溶液InvitrogenHC2040SDS-PAGE分析
SureCast 过硫酸铵（APS）InvitrogenHC2005SDS-PAGE分析
SureCast TEMEDInvitrogenHC2006SDS-PAGE分析
10X 电泳缓冲液ClearBandTGS10SDS-PAGE分析
Tris等BioShopTRS001.1SDS-PAGE分析和细胞裂解
10% SDSClearBandS100SDS-PAGE分析
PageRuler Plus 预染蛋白MarkerThermoFisher26619SDS-PAGE分析
咪唑Sigma-Aldrich56750细胞裂解
NaClSigma-Aldrich31434-5Kg-R细胞裂解
无水磷酸二氢钠amresco0571-1Kg用于细胞裂解的磷酸钠缓冲液
二水合磷酸氢二钠等Sigma-Aldrich04272-1Kg用于细胞裂解的磷酸钠缓冲液
10 kDa截留分子量离心过滤器Amicon®- MERCKUFC9010酶的纯化

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