用于 N-聚糖释放的双歧杆菌内糖苷酶的重组生产

摘要

双歧杆菌具有独特的基因组能力，可切割N-聚糖。重组表达这些酶将成为一种有前景的新工具，用于从富含糖蛋白的底物（如初乳）中释放生物活性N-聚糖。

摘要

蛋白质糖基化是一种多样且常见的翻译后修饰，与多种重要功能相关，包括蛋白质折叠、稳定性、酶保护作用以及生物识别等。连接在糖蛋白（如乳铁蛋白、乳黏附素和免疫球蛋白）上的N-聚糖无法被宿主消化，可到达大肠，并被某些有益微生物所利用。因此，它们被视为新一代益生元化合物，能够选择性地促进肠道微生物组中有益微生物的生长。然而，分离这些新型益生元需要新的酶类。本文描述了从不同双歧杆菌菌株（分离自婴儿、兔子、鸡和熊蜂）中重组表达新型糖苷酶的方法，以改进从糖蛋白中分离N-聚糖的效率。本研究中所述方法包括以下步骤：采用体内重组克隆策略对双歧杆菌基因进行分子克隆、转化成功与否的检测、蛋白质诱导表达以及蛋白质纯化。

引言

糖基化是一种在蛋白质中广泛存在的关键翻译后修饰。据估计，真核生物中超过50%的蛋白质以糖基化形式存在。N-糖基化和O-糖基化是糖基化的两种主要类型^1,2。O-连接聚糖（O-聚糖）通过N-乙酰半乳糖胺共价连接至丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）氨基酸残基的羟基上。N-连接聚糖（N-聚糖）是复杂的寡糖，通过N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）连接至蛋白质中特定氨基酸序列AsN-X-Ser/Thr，以及较少见的AsN-X-Cys（半胱氨酸）中的天冬酰胺（Asn）残基上（其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸）^3,4。N-聚糖的基本核心结构由两个HexNAc和三个甘露糖残基组成。该共同核心在糖基转移酶和糖苷酶的作用下进一步延伸，根据分支程度和连接类型的不同，形成不同类别的N-聚糖⁵。N-聚糖通常分为三大类：高甘露糖型（HM）、复杂型（CT）和杂合型（HY）⁶。

方案

1. 双歧杆菌基因的分子克隆

1. 通过三组载体引物（N-His、C-His 和 N-His SUMO）对目标基因进行 PCR 扩增
   1. 通过加入公司指定体积的无菌水，配制100 µM的引物（寡核苷酸）储备液。从该储备液中稀释制备10 µM的工作储备液，用于目标基因的PCR扩增。
   2. 在PCR管中配制PCR反应液（总体积50 µL），包含25 µL预混液、0.2 µM浓度的上下游引物各1 µL、DNase/RNase-free去离子水21 µL以及2 µL模板DNA（细菌细胞）。用移液器轻柔吹打混匀。
      注意：用于PCR的预混液（Lucigen）含有高纯度和高活性的Taq DNA聚合酶，可在较高温度下工作，可靠扩增长达5 kb的模板。
   3. 设定PCR程序如下：95 °C预变性5 min以释放基因组DNA，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性30 s、60 °C退火30 s、72 °C延伸1 min，最后在72 °C延伸10 min。
   4. 使用1%琼脂糖凝胶，在100 V条件下电泳60分钟后，通过凝胶成像系统进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将PCR产物与DNA Marker分别与上样染料按1:5的比例混合（5 µL PCR产物 + 1 µL上样染料，5 µL 1 kb DNA ladder + 1 µL上样染料），然后上样至凝胶中。图1

结果

本研究选取了来自不同来源的糖基水解酶家族酶。假设联合使用具有不同结构的酶可能实现更佳的聚糖释放效果，因为这些酶在进化上适应于在不同糖蛋白上发挥活性。目标基因及其来源列于 表1细菌菌株购自比利时微生物协调保藏中心。引物序列组根据制造商的说明书进行设计（补充表1）。N-His Kan 载体的正向和反向引物设计如下：F: 5'-CAT CAT CAC CAC CAT CAC XXX₂ XXX₃ XXX₄ XXX₅ XXX₆ XXX₇ XXX₈ （XXX₂-XXX₈ 代表靶编码区的第2至第8个密码子）和R：5'-GTG GCG GCC GCT CTA TTA XXX_n XXX_n-1 XXX_n-2 XXX_n-3 XXX_n-4 XXX_n-5 XXX_.......

讨论

与传统的克隆方法相比，本研究所采用的体内重组克隆策略在目标基因的分子克隆中具有快速且可靠的优势。尽管目前已有多种便捷的分子克隆方法，但本文所述方法具备更多优点。体内克隆系统与其他克隆系统不同，无需对PCR产物进行任何酶处理或纯化步骤，也不存在序列连接位点的限制，亦无需限制性内切酶。在该系统中，只需将扩增后的基因与细胞及载体（随试剂盒提供）混合即可完成克隆，无需酶促连接反应。因此该方法被称为体内克隆，因为PCR产物末端与载体之间的重组发生在细胞内。该系统中的线性载体两端各含有18个核苷酸长度的黏性末端，且这两个序列彼此不互补。由于这一特性，载体可完全避免自连或序列反向插入的风险。用于扩增目标基因的引物需根据这些末端序列设计，以确保高效结合。克隆试剂盒中提供的N-His、C-His以及N-His SUMO载体，可实现目标基因的快速克隆，所表达蛋白带有氨基端或羧基端的6xHis亲和标签，可在天然或变性条件下实现蛋白的快速、简便亲和纯化。

尽管该克隆系统的转化成功率高于95%，但其少数缺点之一是感受态细胞无法在常规实验室条件下制备。含有.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EconoTaq PLUS 2X 主混合液	Lucigen	30035-1	目的基因扩增（PCR）
无DNase/RNase的蒸馏水	Invitrogen	10977035	目的基因扩增（PCR）
Safe-Red 上样染料	abm	G108-R	DNA凝胶电泳
1 kb Plus DNA Marker	GoldBio	D011-500	DNA凝胶电泳
Qubit 蛋白检测试剂盒	Invitrogen	Q33211	DNA浓度测定
LB培养基，Miller型（Luria-Bertani）	amresco	J106-2KG	细菌培养基
琼脂糖	Invitrogen	16500-500	细菌培养基等
卡那霉素单硫酸盐	GoldBio	K-120-5	细菌培养基中的抗生素
Expresso 鼠李糖克隆与表达系统试剂盒，N-His	Lucigen	49011-1	克隆试剂盒
Expresso 鼠李糖克隆与表达系统试剂盒，SUMO	Lucigen	49013-1	克隆试剂盒
Expresso 鼠李糖克隆与表达系统试剂盒，C-His	Lucigen	49012-1	克隆试剂盒
甘油溶液	Sigma-Aldrich	15524-1L-R	甘油菌保存液制备
L-鼠李糖一水合物	Sigma-Aldrich	83650	蛋白表达诱导
2X Laemmli 上样缓冲液	ClearBand	TGS10	SDS-PAGE分析
SureCast 40% (w/v) 丙烯酰胺溶液	Invitrogen	HC2040	SDS-PAGE分析
SureCast 过硫酸铵（APS）	Invitrogen	HC2005	SDS-PAGE分析
SureCast TEMED	Invitrogen	HC2006	SDS-PAGE分析
10X 电泳缓冲液	ClearBand	TGS10	SDS-PAGE分析
Tris等	BioShop	TRS001.1	SDS-PAGE分析和细胞裂解
10% SDS	ClearBand	S100	SDS-PAGE分析
PageRuler Plus 预染蛋白Marker	ThermoFisher	26619	SDS-PAGE分析
咪唑	Sigma-Aldrich	56750	细胞裂解
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-5Kg-R	细胞裂解
无水磷酸二氢钠	amresco	0571-1Kg	用于细胞裂解的磷酸钠缓冲液
二水合磷酸氢二钠等	Sigma-Aldrich	04272-1Kg	用于细胞裂解的磷酸钠缓冲液
10 kDa截留分子量离心过滤器	Amicon®- MERCK	UFC9010	酶的纯化