光学汽化全氟化碳纳米液滴的配方和声学调制

Summary

光学活化全氟化碳纳米液滴在血管系统以外的成像应用中显示出前景。本文将演示如何合成这些颗粒，交联聚丙烯酰胺模型，并在声学上调制液滴以增强其信号。

Abstract

微泡是超声中最常用的成像造影剂。然而，由于它们的大小，它们仅限于血管室。这些微气泡可以冷凝或配制成全氟化碳纳米液滴（PFCnD），其小到足以外渗，然后在目标位点以声学方式触发。这些纳米颗粒可以通过包括诸如近红外有机染料或纳米颗粒（例如硫化铜纳米颗粒或金纳米颗粒/纳米棒）的光吸收剂来进一步增强。光学标记的PFCnD可以通过激光照射在称为光滴汽化（ODV）的过程中汽化。这种活化过程允许使用高沸点全氟化碳核心，这些核心在诊断成像的最大机械指数阈值下不能在声学上汽化。较高的沸点核心导致液滴在汽化后重新冷凝，导致"闪烁"PFCnD在蒸发后短暂产生对比度，然后凝结回纳米液滴形式。该过程可以重复以按需产生对比度，从而允许通过光学和声学调制进行无背景成像、多路复用、超分辨率和对比度增强。本文将演示如何利用探针超声合成光学触发的脂壳PFCnD，创建聚丙烯酰胺模型来表征纳米液滴，并在ODV后对PFCnD进行声学调制以提高对比度。

Introduction

微泡是最普遍的超声造影剂，因为与软组织相比，微泡具有生物相容性和出色的回声性。这使它们成为可视化血流、器官描绘和其他应用的宝贵工具¹。然而，它们的尺寸（1-10μm）使它们在基于共振频率的成像中非常出色，因此将其应用限制在脉管系统²上。

这种限制导致了PFCnD的发展，PFCnD是由包裹在液体全氟化碳核心周围的表面活性剂组成的纳米乳液。这些纳米颗粒可以以小至200nm的尺寸合成，旨在利用肿瘤脉管系统中发现的"泄漏"脉管系统或孔隙和开窗。虽然这些破坏是肿瘤依赖性的，但这种渗透性允许纳米颗粒从~200nm-1.2μm外渗，具体取决于肿瘤^3，4。在它们的初始形式中，这些颗粒几乎不产生超声波对比度。在汽化时 - 通过声学或光学诱导 - 核心相从液体变为气体，导致直径^增加两倍半到五倍5，^6，7并产生光声和超声波对比。虽然声学汽化是最常见的激活方法，但这种方法会产生声学伪影，从而限制汽化成像。此外，大多数全氟化碳需要机械指数超过安全阈值的聚焦超声才能蒸发⁸。这导致了低沸点PFCnD的发展，它可以通过将微气泡冷凝成纳米液滴来合成^9。然而，这些液滴更易挥发，并且会自发汽化¹⁰。

另一方面，光滴汽化（ODV）需要添加光学触发器，例如纳米颗粒11，¹²，¹³或染料⁶，^{14，15，并且}可以使用ANSI安全限值¹¹内的注量蒸发更高沸点的全氟化碳。用更高沸点核心合成的PFCnD更稳定，汽化后会重新凝结，从而实现无背景成像¹⁶、多路复用¹⁷和超分辨率¹⁸。这些技术的主要局限性之一是高沸点PFCnD在汽化后仅在短时间内产生回波，在毫秒¹⁹的尺度上，并且相对较暗。虽然这个问题可以通过反复汽化和平均来缓解，但液滴信号的检测和分离仍然是一个挑战。

从脉冲反转中汲取灵感，可以通过修改超声成像脉冲¹⁹的相位来增强持续时间和对比度。通过以稀疏相（n脉冲）启动超声成像脉冲，汽化PFCnD的持续时间和对比度都会增加。相反，以压缩期（p脉冲）启动超声成像脉冲会导致对比度降低和持续时间缩短。本文将介绍如何合成光学触发的全氟化碳纳米液滴，即成像中常用的聚丙烯酰胺模型，并通过声学调制演示对比度增强和延长信号寿命。

Protocol

1. 全氟化碳纳米液滴制剂

1. 用氯仿冲洗出 10 mL 圆底烧瓶，然后反复吸出整个注射器体积并排出总共 3 次，用氯仿冲洗 10 μL 和 1 mL 气密玻璃注射器。
   注意:氯仿是挥发性的，如果吸入可能有毒。所有使用该溶剂的工作都应在通风橱中进行。
2. 使用注射器，将 200 μL DSPE-mPEG2000 （25 mg/mL）、6.3 μL 1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC，25 mg/mL）和 1 mL IR 1048（1 mg/mL 氯仿溶液）加入圆底烧瓶中。请记住清理脂质/染料之间的注射器，以防止污染库存。
   注意:红外染料对光敏感，应在昏暗的条件下工作，或者烧瓶应用铝箔覆盖。
3. 使用旋转蒸发器除去溶剂。确保将真空缓慢调节到 332 mbar，以防止碰撞。5分钟后，将压力降低至42毫巴以除去可能已进入溶液的任何水。
   注意:脂质饼可以在4°C下在覆盖有封口膜的圆底烧瓶中储存过夜。
4. 将脂质饼悬浮在 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并在室温下超声处理或涡旋 5 分钟或直到所有脂质饼悬浮并溶解在溶液中。超声处理2分钟以使溶液均质化。
5. 将溶液转移到 7 mL 玻璃小瓶中，并将小瓶放入装满冰的玻璃培养皿中，让溶液冷却 5 分钟，然后使用气密玻璃注射器加入 50 μL 全氟己烷。请记住在将注射器分配到小瓶中之前用全氟己烷冲洗注射器。
6. 将装有脂质和冰浴的玻璃小瓶放入探头超声仪外壳中，并将探头尖端浸入微型探头下方。确保超声仪探头的侧面不接触玻璃小瓶的边缘。
7. 探头使用以下设置对混合物进行超声处理:振幅 1，处理时间:20 秒，脉冲开启:1 秒，脉冲关闭:5 秒。然后以以下设置进行超声处理:振幅:50，处理时间:5秒，脉冲开启:1秒，脉冲关闭:10秒。
8. 将纳米液滴溶液转移到1.5mL离心管中，并以300× g 离心3分钟，以从较小的液滴中分离出较大的液滴（>1μm）。
9. 弃去沉淀并将上清液转移到另一个 1.5 mL 离心管中。通过以3000× g 离心5分钟洗涤上清液以沉淀溶液中的所有液滴。通过上下移液沉淀将 PFCnD 重悬于 1 mL PBS 中，然后在浴超声仪中超声处理 1 分钟。
10. 使用动态光散射 （DLS） 测量液滴的大小。将原液PFCnD稀释100倍（10μLPFCnD原液在990μLPBS中）并在测量前对浴进行超声处理以分散PFCnD。代表性结果如图 1所示。
11. 使用纳米颗粒示踪分析仪确定PFCnD的浓度（参见 材料表）。将PFCnD稀释100-1000倍，以确保准确测量浓度。该方案通常产生浓度约为 10¹⁰ 个颗粒/mL 的液滴。
12. 在 50 mL 离心管中制备 10 mL 超声偶联凝胶，加入 1% （v/v） 或 100 μL PFCnD，制成 ~10⁸ 个颗粒/mL 的溶液。涡旋溶液进行混合。将混合物以4000× g 离心3分钟以除去气泡。

2.聚丙烯酰胺幻影制备

1. 通过在 500 mL 真空烧瓶中填充 400 mL 去离子水对水进行脱气，用橡胶软木塞密封，然后将烧瓶连接到真空管路。打开真空管路，将烧瓶底部浸入浴超声仪中。超声处理5分钟或直到看不到气泡形成。
2. 通过将 500 mg 溶解在 5 mL 脱气水中来制备 10% 过硫酸铵 （APS） 溶液。如果过硫酸铵没有完全溶解，轻轻旋转溶液。
3. 在搅拌板上带有搅拌棒的 400 mL 烧杯中，加入 150 mL 脱气水和 50 mL 40% （w/v） 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液，形成 200 mL 10% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液。以 200 rpm 的速度搅拌混合物，以便在不引入气泡的情况下进行适当的混合。
   注意:丙烯酰胺是一种致癌物质，所有工作都应戴手套在通风橱中进行，尤其是在使用粉末形式的丙烯酰胺时。
4. 称取400mg二氧化硅，加入步骤2.3中的10%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液中，形成0.2%（w / v）的二氧化硅和丙烯酰胺溶液。
   注意:吸入二氧化硅可能是一种致癌物质。包括称重在内的所有工作都应在通风橱中进行。
5. 通过从塑料转移移液器上切断尖端并用实验室胶带将其固定在模具中，准备一个带有圆柱形内含物的 58 mm x 58 mm x 78 mm 方形模具。参见 图2。
6. 向烧杯中加入 2 mL 的 10 % APS 溶液，使终浓度为 0.1% APS，并向幻影溶液中加入 250 μL 四甲基乙二胺 （TEMED）。让溶液短暂搅拌（不到一分钟）。
7. 快速将溶液倒入模具中，同时注意不要将气泡引入溶液中。溶液应在10分钟内聚合。通过将实验室刮刀的平端绕模具边缘并倒置模具来去除幻影。
   注意:这些幻影可以多次重复使用，应浸入水中并储存在 4°C。

3. 全氟化碳纳米液滴成像

1. 按照制造商的说明打开并预热脉冲激光系统~20分钟。确保光纤束正确连接到激光输出，并且两个支腿正确放置在光纤束支架内。
2. 打开超声成像系统，将阵列成像换能器（L11-4v）连接到系统，并将换能器固定在支架内，使其成像平面与激光横截面对齐。
3. 将激光系统的脉冲重复频率设置为10Hz，并在光纤束的末端放置一个功率计以测量能量。调谐 q 开关延迟，直到估计的通量为 70 mJ/cm²。
   注意:发射激光时必须佩戴适当的眼镜，激光幕必须封闭空间。
4. 使用 1 mL 塑料滑头注射器用超声凝胶/PFCnD 混合物回填聚丙烯酰胺模型中的一个通道。用超声凝胶自由覆盖通道顶部，并用 1 mL 塑料滑头注射器去除任何气泡。将聚丙烯酰胺模型放在换能器和光纤束下方，如图 3所示。
5. 使用基于软件²⁰ 的组合激光超声和弹性（CLUE）成像平台对PFCnD进行与光学激活同步的成像。更改 参数结构中 用于成像的常规用户定义参数:将开始/结束深度设置为0/40mm，中心频率设置为6.9MHz，传感器名称设置为"L11-4v"。
6. 定义新的 RunCase 并设计用于重复光学激活/重聚和 PFHnD 的 US 成像的模块序列。这是通过列出预定义的模块来完成的，例如超快成像（mUF），外部激光器（mExtLaser）和空闲（mIdle）。
   1. 重复序列集 mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF 两次，以获取n脉冲和p脉冲成像数据。
      注意:通过将 ExtLaser.Enable 设置为 0，将每个序列中的第一个 mExtLaser 模块设置为假激光器，并包括"mIdle"，以最大限度地减少激光激活后背景美国图像和 n/p 脉冲美国图像之间的时间。
7. 为放置在当前运行案例的模块序列中的每个模块设置模块参数。通过与模块序列中的顺序对应的索引访问每个模块参数。模块将使用用户在此处设置的模块参数执行预定义的操作。
   1. 将外部激光模块中的 ExtLaser.QSdelay 设置为在步骤 3.3 中调整的激光 Q 开关延迟值（以微秒为单位）。该模块等待激光系统的闪光灯触发，并在 QSdelay中指定的延迟后产生Q开关触发。
   2. 在超快成像模块中，将 Resource.numFrame 设置为 100，将 SeqControl.PRI 设置为 200 （μs），并将 TW.polarity 设置为 1（对于 P 脉冲，将 -1 设置为 -1（相应的脉冲形状见 图 4 ）。该模块将传输超快的0度平面波，脉冲类型以 TW.极性指定。
      1. 获取 38.8 mm 宽的全孔径成像窗口，用于 Resource.numFrame 中的帧数、 SeqControl.PRI 的脉冲重复间隔，然后保存数据以供离线处理。
   3. 将空闲模块中的 SeqControl.lastPRI_Module 设置为激光脉冲之间的时间长度（100 ms）减去Q开关延迟、成像数据采集时间（20 ms）和信号传播的20 μs裕量。该模块使系统在 SeqControl.lastPRI_Module 时间内保持"无操作"状态，以填补成像数据采集结束和下一次激光脉冲激发之间的时间间隔。

Results

PFCnDs的成功配制和离心分离应产生直径约为200-300nm的液滴（图1A）。分离不当的液滴可能在1μm附近显示小峰。这些溶液可以进一步进行浴超声处理，以分解较大的液滴。由于在称为奥斯特瓦尔德成熟²¹，²²的过程中聚结和/或扩散^，液滴的大小将随着时间的推移而增加（图1B）。

通过操纵成像脉冲对液滴进行声学调制，提高了汽化PFCnD的对比度。这在通过减去波束成形图像的相邻帧重建的PFCnD图像中得到了证明，因此只有从汽化PFCnD返回的信号是可见的，并且抑制了静止的背景信号。对比度通过圆形夹杂区域的平均信号与平均背景信号与平均背景信号之间的差异之比来量化。背景信号由来自背景的两个矩形ROI的信号定义，这两个ROI与夹杂物的深度和等效区域相同。N脉冲与内含物的对比度大约是P脉冲的3.2倍（即改善220%）（

Discussion

探针超声处理是一种相对简单易学的PFCnD制备方法。有几个步骤必须小心。处理氯仿时，必须使用外置活塞式移液器或玻璃注射器，因为它具有挥发性，并且会从标准空气置换式移液器中"泄漏"。此外，如果使用正置换，请确保使用适当的吸头，因为氯仿会溶解大多数塑料吸头，这会将污染物引入溶液中。对于全氟己烷，还建议使用外置活塞式移液器或玻璃注射器，因为它既易挥发又比水密度大。通常，可以通过在空气置换式移液器中进行预润湿和使用秤分别调整移液器上设置的体积来减少挥发性和高密度的个别影响。但是，对于具有这两种特性的全氟己烷，挥发性将难以获得准确的重量测量值，因此外置活塞式移液器/玻璃注射器成为最可行的选择。

在对溶液进行超声处理之前，重要的是将脂质和全氟化碳溶液在冰浴中孵育，使其冷却以防止在超声处理过程中使全氟化碳沸腾。此步骤对于低沸点全氟化碳（如全氟戊烷）尤其重要。此外，在探测溶液超声处理时必须小心。超声探头尖端应浸没，但不应与玻璃小瓶的底部或侧面接触，因为它可能会损坏尖端并粉碎小瓶，将脂质溶液排入冰浴中。

PFCnD制造方案可以通过一些次要方式进...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
过硫酸铵 （APS）	VWR	97064-592
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DSPC）	Avanti 极性脂质	850365C	脂质，这些可以购买悬浮在氯仿或粉末形式的脂质。对于长期储存，粉末形式是最好的，但氯仿更实用。
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（DSPE-PEG）	Avanti 极性脂质	880120C	脂质，这些可以购买悬浮在氯仿或粉末形式的脂质。对于长期储存，粉末形式是最好的，但氯仿更实用。
丙烯酰胺 ： 双丙烯酰胺溶液 （19：1） 40% （w/v）， OmniPur®	VWR	EM-1300	丙烯酰胺溶液，较低浓度/粉末
IR-1048	Sigma	405175	红外染料
L11-4v	Verasonics	-	超声线性阵列换能器
微尖 1/8"	Qsonica LLC	4418	微尖，用于探头超声仪
N， N， N′， N′-四甲基乙二胺 （TEMED）	VWR	97064-902	用于在过硫酸铵存在下形成自由基聚合聚丙烯酰胺
Nova II	Ophir-Spiricon	7Z01550	激光功率计
全氟己烷	氟医学	APF-60M	全氟化碳液体
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 片	VWR	97062-732	用于制造 PBS
Q500	Qsonica LLC	的片剂Q500-110	探针超声仪
硅胶	Sigma-Aldrich	288500	2-25 μm 粒径
Tempest 30	New wave research	-	脉冲激光系统
Vantage 128	Verasonics	-	研究超声成像系统
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments Ltd	-	基于动态光散射进行粒径测量