光激活的全氟碳纳米液滴在血管系统外的成像应用中展现出良好的前景。本文将演示如何合成这些颗粒、交联聚丙烯酰胺仿组织体模，并通过声学调控增强其信号。
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本文内容
摘要
摘要
微泡是超声成像中最常用的造影剂。然而，由于其尺寸限制，微泡仅能局限于血管腔内。这些微泡可以被压缩或配制成全氟碳纳米液滴（PFCnDs），其尺寸足够小，能够发生血管外渗，并可在靶部位通过声学手段触发。通过添加光学吸收剂（如近红外有机染料或纳米颗粒，例如硫化铜纳米颗粒或金纳米颗粒/纳米棒），可进一步增强这些纳米颗粒的性能。经光学标记的PFCnDs可通过激光照射实现液滴汽化，该过程称为光学液滴汽化（ODV）。这种激活方式使得高沸点全氟碳核得以应用，而这类核在诊断成像允许的最大机械指数阈值下无法通过声学方式汽化。高沸点核形成的液滴在汽化后会重新冷凝，从而产生“闪烁”型PFCnDs——即在汽化后短暂产生造影信号，随后重新冷凝为纳米液滴状态。该过程可重复进行，实现按需造影，从而支持无背景干扰成像、多重检测、超分辨率成像，并通过光学与声学双重调控实现造影增强。本文将演示如何利用探头超声法合成可光学触发的脂质壳PFCnDs，制备聚丙烯酰胺模体以表征纳米液滴，并在ODV后通过声学调控PFCnDs以提升造影效果。
引言
由于微泡具有良好的生物相容性，并且与软组织相比具有优异的回声特性，因此成为最常用的超声造影剂。这使得微泡在血流可视化、器官边界显示及其他应用中具有重要价值1。然而，其尺寸（1–10 µm）虽然使其在基于共振频率的成像中表现出色，但也限制了其应用范围，仅限于血管系统2。
这一局限性促使了全氟碳化物纳米乳剂（PFCnDs）的开发，PFCnDs是由表面活性剂包裹液态全氟碳核心所构成的纳米乳剂。这些纳米颗粒可合成至小至200 nm的粒径，并被设计用于利用 "渗漏的" 肿瘤血管中的血管结构、孔隙以及开放的窗孔结构。尽管这些结构异常依赖于肿瘤类型，但其通透性可使纳米颗粒从约200 nm至1.2 µm的尺寸范围内发生外渗，具体范围取决于肿瘤类型3,4在初始状态下，这些颗粒产生的超声造影效果极弱或几乎无造影效果。在受到声学或光学诱导发生汽化后，其核心由液相转变为气相，导致直径增大2.5至5倍。5,6,7 并产生光声和超声对比效应。尽管声致汽化是最常见的激活方式，但该方法会产生声学伪....
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方案
1. 全氟碳纳米液滴的配制
- 用氯仿冲洗一个10 mL的圆底烧瓶，并用氯仿清洗一支10 µL和一支1 mL的气密玻璃注射器，通过反复抽吸和排出注射器的全部体积，共操作三次。
注意：氯仿具有挥发性，吸入后可能有毒。所有涉及该溶剂的操作均应在通风橱中进行。 - 使用注射器将200 µL的DSPE-mPEG2000（25 mg/mL）、6.3 µL的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DSPC，25 mg/mL）和1 mL的IR 1048（1 mg/mL，溶于氯仿）加入圆底烧瓶中。在不同脂质或染料之间使用前请务必清洗注射器，以防止原液污染。
注意：红外染料对光敏感，操作应在避光条件下进行，或将烧瓶用铝箔包裹。 - 使用旋转蒸发仪除去溶剂。确保将真空度缓慢调节至332 mbar，以防止暴沸。5分钟后，将压力进一步降低至42 mbar，以去除可能进入溶液的水分。
注意：脂质薄膜可在4 °C、用封口膜密封的圆底烧瓶中过夜保存。 - 将脂质薄膜用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，并在室温下超声或涡旋5分钟，直至脂质完全溶解。再额外超声2分钟以均质化溶液。
- 将溶液转移至一个7 mL玻璃小瓶中，并将小瓶置于盛有冰块的玻璃容器中，使溶液冷却5分钟，然后使用气密玻璃注射器加入50 µL全氟己烷。在将全氟己烷注入小瓶前，请务必先用其冲洗注射器。
- 将含有脂质并置于冰浴中的玻璃小瓶放入探头式超声仪....
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结果
成功配制并经离心分离的PFCnDs应产生直径约为200-300 nm的液滴（图1A）。分离不当的液滴可能在约1 µm处出现小峰。这些溶液可进一步通过水浴超声处理以破碎较大的液滴。由于聚并和/或扩散作用，液滴尺寸会随时间增加，该过程称为奥斯特瓦尔德熟化21,22（图1B）。
通过调控成像脉冲对液滴进行声学调制，提高了气化全氟碳化物纳米液滴（PFCnDs）的对比度。该效果通过减去波束成形图像相邻帧后重建的PFCnD图像得以展示，使得仅来自气化PFCnDs的信号可见，同时抑制了静止背景信号。对比度通过圆形包含区域的平均信号与平均背景信号之差与平均背景信号的比值进行量化。背景信号由两个与包含区域深度相同、面积相等的矩形背景感兴趣区域（ROI）的信号定义。N脉冲模式下包含区域的对比度约为即，220% 的提升）高于 P 脉冲（
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讨论
探针超声是一种相对简单且易于掌握的制备全氟碳纳米点（PFCnDs）的方法。操作过程中有几个步骤需要特别注意。在处理氯仿时，必须使用正向置换移液器或玻璃注射器，因为氯仿具有挥发性，会 "泄漏" 使用正向置换移液器时，应确保使用合适的吸头，因为氯仿会溶解大多数塑料吸头，可能向溶液中引入污染物。对于全氟己烷，同样推荐使用正向置换移液器或玻璃注射器，因其具有挥发性且密度大于水。通常情况下，空气置换移液器可通过预润洗来减少挥发性带来的影响，而通过称重校正移液器设定体积可减轻高密度造成的影响。然而，全氟己烷同时具备这两种特性，其挥发性将导致准确称重困难，因此正向置换移液器或玻璃注射器是最可行的选择。
在对溶液进行探头超声处理之前，必须将脂质和全氟碳化合物溶液在冰浴中孵育，使其充分冷却，以防止超声过程中全氟碳化合物沸腾。此步骤对于沸点较低的全氟碳化合物（如全氟戊烷）尤为重要。此外，在使用探头超声处理溶液时需格外小心。超声探头的尖端应浸入液面以下，但不得接触玻璃小瓶的底部或侧壁，以免损坏探头或导致小瓶破裂，使脂质溶液泄漏至冰浴中。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由乳腺癌研究基金会（资助号：BCRF-20-043）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 过硫酸铵（APS） | VWR | 97064-592 | |
| 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC） | Avanti Polar Lipids | 850365C | 脂质，可购买氯仿悬浮液或粉末形式。长期储存建议使用粉末形式，但氯仿溶液更便于使用。 |
| 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）（DSPE-PEG） | Avanti Polar Lipids | 880120C | 脂质，可购买氯仿悬浮液或粉末形式。长期储存建议使用粉末形式，但氯仿溶液更便于使用。 |
| 丙烯酰胺：双丙烯酰胺溶液（19:1）40%（w/v），OmniPur® | VWR | EM-1300 | 丙烯酰胺溶液，低浓度/粉末 |
| IR-1048 | Sigma | 405175 | 红外染料 |
| L11-4v | Verasonics | - | 超声线性阵列换能器 |
| Microtip 1/8" | Qsonica LLC | 4418 | 探头式超声破碎仪用微尖 |
| N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED） | VWR | 97064-902 | 在过硫酸铵存在下通过生成自由基促进聚丙烯酰胺聚合 |
| Nova II | Ophir-Spiricon | 7Z01550 | 激光功率计 |
| 全氟己烷 | Fluoromed | APF-60M | 全氟碳液体 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）片剂 | VWR | 97062-732 | 用于配制PBS的片剂 |
| Q500 | Qsonica LLC | Q500-110 | 探头式超声破碎仪 |
| 硅胶 | Sigma-Aldrich | 288500 | 2–25 μm 粒径 |
| Tempest 30 | New Wave Research | - | 脉冲激光系统 |
| Vantage 128 | Verasonics | - | 科研用超声成像系统 |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments Ltd | - | 基于动态光散射技术进行粒径测量 |
参考文献
- Schutt, E. G., Klein, D. H., Mattrey, R. M., Riess, J. G. Injectable microbubbles as contrast agents for diagnostic ultrasound imaging: the key role of perfluorochemicals. Angewandte Chemie International Edition. 42 (28), 3218-3235 (2003).
- Lee, H., et al.
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重印与许可
