利用双光子显微镜在斑马鱼原肠胚中实现深度与空间可控的体积消融

摘要

胚胎发育需要细胞运动的大规模协调。双光子激发介导的激光消融技术可实现对深层大量细胞进行空间可控的三维消融。此外，该技术还可用于探究集体迁移细胞的反应 体内 其力学环境的扰动。

摘要

形态发生涉及多种细胞运动，以将细胞组织成组织和器官。为了实现正常的发育，所有这些运动都需要高度协调，越来越多的证据表明，这种协调至少部分是通过机械相互作用实现的。在胚胎中验证这一点需要直接进行物理扰动。激光消融是一种日益常用的方法，可用来解除机械约束，或在物理上将两个细胞群体相互隔离开。然而，许多消融操作使用的是紫外（UV）激光，其轴向分辨率和组织穿透能力有限。本文介绍了一种利用双光子显微镜消融深层、显著且空间位置明确的组织体积的方法。该方法在一个转基因斑马鱼品系中进行了演示，该品系在轴向中胚层中表达绿色荧光蛋白，并可用于切断轴向中胚层，同时不损伤其上方的外胚层或下方的卵黄细胞。通过活体成像在消融前后持续监测细胞行为。该消融方案可用于不同的发育阶段、任意细胞类型或组织，作用尺度可从数微米到超过一百微米。

引言

细胞间的相互作用在发育过程中发挥着至关重要的作用。细胞可提供信号，供其直接相邻的细胞或更远距离的细胞感知，从而影响这些细胞的命运和/或行为。这些信号中许多具有化学性质。例如，在已被充分表征的诱导事件中，一群细胞产生可扩散的分子，影响另一群细胞的命运¹。然而，其他信号则属于机械性质；细胞对其邻近细胞施加力学作用力和约束，邻近细胞能够感知并对此作出响应²。

研究这些细胞间相互作用重要性的一种方法 体内 是消除某些细胞并观察其后续发育。遗憾的是，目前可用于去除或破坏细胞的技术有限。细胞可通过手术方式移除^3,4，使用针头或细金属丝，但这类方法具有侵入性，精确度较低，通常需在体视显微镜下操作，从而无法在显微镜下立即成像。此外，靶向深层细胞需要穿透覆盖的组织，造成不必要的干扰。基因编码的光敏蛋白（如 KillerRed）已可用于通过光照诱导细胞死亡⁵光敏剂是经光照后可产生活性氧物种的发色团。其主要局限性在于需要较长的光照时间（约15分钟），若细胞处于运动状态，则难以实现有效照射；此外，光敏剂通过诱导细胞凋亡导致细胞死亡，该过程并非即时发生。

近15年来，激光....

方案

所有动物实验均已获得伦理委员会编号59以及法国国家教育部、高等教育与研究部的批准，批准文件编号为APAFIS#15859-2018051710341011v3。下述部分步骤针对我们的仪器设备和软件而设定，但可轻松适配于其他设备。

1. 注射液的制备

1. 在胚胎培养基（EM）中配制75 mL的1%琼脂糖溶液。
2. 将注射模具放入90 mm的培养皿中，倒入约50 mL琼脂糖溶液，使模具能够漂浮。待琼脂糖凝固后，取出注射模具。
3. 在30 mm培养皿中加入1 mL琼脂糖溶液，制备琼脂糖包被的培养皿。
4. 将原液用无RNase水稀释，配制4 µL浓度为30 ng/µL的组蛋白2B-mCherry mRNA溶液，并置于冰上保存。
   ​注意：操作mRNA时应佩戴手套，避免RNase导致的降解。
5. 使用微量移液器拉针仪从毛细管中拉制注射针。

2. 胚胎制备

1. 鱼类产卵后，用 EM 在 90 mm 培养皿中收集、冲洗并收获卵。将胚胎置于 28.5 °C 培养箱中孵育。
2. 等待 20 分钟，直至第一个细胞清晰可见。
3. 将 30 个胚胎转移至盛有 EM 的注射板中，用略钝的镊子将胚胎轻轻压入凹槽，并调整方向使动物极朝上。
4. 使用微量加样吸头，向注射针中加入 2....

结果

为了在中段切断胚盾，将注射了组蛋白2B-mCherry mRNA的Tg(gsc:GFP)胚胎按照步骤4所述方法固定于70%上胚层延伸阶段。通过GFP表达确定胚盾位置，并将胚胎固定，使胚盾平面垂直于光轴（图1B）。若将胚胎偏离此位置倾斜，则会使操作复杂化，光线需穿过更多组织才能到达消融平面，且消融平面将相对于胚胎轴线发生倾斜。在确认所有细胞核均被正确标记后，记录10分钟的消融前延时成像，以捕获消融前的细胞运动（图1E和图3A，电影S1）。

通过形态学方法鉴定了帽状结构（polster），并在其中部选取一个15 µm × 200 µm的矩形区域，在五个焦平面上进行消融，以确保贯穿整个帽状结构的深度完成切断（图1E， 视频S1）。消融后立即重新开始成像，用于.......

讨论

本文描述了一种利用非线性光学技术进行深层且空间定位精确的体积消融的实验方案。该方案最关键的步骤是确定合适的处理条件，以提供足以实现消融的激光能量，同时避免能量过高导致产生过多碎片或空化效应。靶点处实际传递的能量主要取决于以下因素：（1）激光输出功率，（2）激光准直质量，（3）光束在到达消融平面过程中所穿过的组织性质，（4）消融平面的深度。因此，在每次实验前，必须测量激光输出功率，并将其调整至参考值（在本方案中为820 nm波长下300 mW），同时确保激光准直正确。在满足上述条件的前提下，实验处理参数应在不同实验日之间具有良好的可重复性。我们建议针对特定类型的样本进行充分测试，以确定最佳参数（激光功率和处理帧数），这些参数随后可用于所有类似的实验。以本文所述示例（原肠胚形成期间切断胚盾结构）为例，我们已针对胚胎内不同深度的消融建立了相应的处理条件（表1），并在后续实验中直接参考该图表。值得注意的是，选择820 nm波长是因为在我们的系统中，该波长能够提供最高的峰值能量（由激光器和光学系统的特性决定）。根据系统性能的不同，也可选用更短或更长的波长^6.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25倍水浸物镜	Olympus	XLPLN25XWMP2
琼脂糖	PanReac AppliChem	A8963,0500
数据分析软件：Matlab	数学工作
电光调制器（EOM）	ConOptics	350-80LA
胚胎培养基（EM）溶液			Westerfield, M. 《斑马鱼手册：斑马鱼（Danio rerio）实验室使用指南》，第5版。俄勒冈大学出版社，尤金（图书）。（2000）
环境箱	Okolab	H201-T-UNIT-BL
EOM 驱动器	ConOptics	302RM
荧光光源	Lumencor	SOLA
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0-10-C
玻璃毛细管	哈佛仪器公司	300085	外径 1.0 mm，内径 0.58 毫米
玻璃移液管	Volac	D810	尖端应进行火焰抛光
绿光/消融激光	Spectra Physics	Mai Tai HP DeepSee
组蛋白2B-mCherry mRNA			由pCS2-H2B-mCherry质粒（Dumortier）合成&等 2012）
图像分析软件：IMARIS	Bitplane
ImSpector 软件	Abberior Instruments 开发团队
注塑模具	自适应科学工具	I-34
微量移液器吸头	Eppendorf	5242956003
显微操作仪	Narishige	MN-151
微移液管拉制仪	Sutter	P-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 体外转录试剂盒	Invitrogen	AM1340
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140-122	每毫升含10000单位青霉素和10毫克链霉素
光电倍增管（PMT）	滨松	H7422-40
PicoPump（空气注射器）	世界精密仪器公司	PV820
红激光	Spectra Physics	OPO/Insight DeepSee
注射用无RNase水	Sigma	W3500
电子表格软件：Excel	微软
体视显微镜	尼康	SMZ18
Tg(gsc:GFP) 斑马鱼品系			Doitsidou, M. 等. 原始生殖细胞迁移受趋化因子 SDF-1 的引导. Cell. 111 (5), 647–59，doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002)。
TriM Scope II 显微镜	La Vision Biotech