Method Article

使用光遗传TAEL/C120系统在斑马鱼胚胎中的光诱导GFP表达

DOI:

10.3791/62818

⸱

August 19th, 2021

 , 
1Department of Molecular Cell Biology, University of California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光遗传学是一种功能强大的工具，具有广泛的应用。该协议演示了如何使用蓝光响应 TAEL/C120 系统在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

诱导基因表达系统是研究生物过程的宝贵工具。光遗传表达系统可以利用光作为诱导剂，精确控制基因表达的时间、位置和振幅。在这个协议中，光遗传表达系统用于在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。该系统依赖于一个工程转录因子称为TAEL基于自然发生的光激活转录因子从细菌 E.利托拉利斯。当蓝光照射时，TAEL 变暗，与称为 C120 的认知调节元素结合，并激活转录。该协议使用转基因斑马鱼胚胎，表达TAEL转录因子在无处不在的 无所 不在的促进者控制下。同时，C120 调控元素驱动荧光记者基因 （GFP） 的表达。使用简单的 LED 面板提供激活蓝光，GFP 表达感应可在 30 分钟的照明后首先检测到，并在 3 小时光处理后达到 130 倍以上感应的峰值。表达感应可以通过定量实时PCR（qRT-PCR）和荧光显微镜进行评估。这种方法是一种多功能且易于使用的光遗传基因表达方法。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

诱导基因表达系统有助于控制基因表达的数量、时间和位置。然而，在多细胞生物体中实现精确的空间和时间控制是具有挑战性的。时间控制最常通过添加小分子化合物1 或激活热冲击促进剂2来实现。尽管如此，这两种方法都容易受到时间、上岗强度和偏离目标压力反应等问题的影响。空间控制主要通过使用组织特异性促进剂3来实现，但这种方法需要一个合适的促进者或调节元素，这些元素并不总是可用的，也不利于亚组织水平的诱导。

与这种传统方法相比，光激活光遗传学转录活化器具有更精细的基因表达空间和时间控制的潜力。蓝光响应TAEL/C120系统被开发和优化，用于斑马鱼胚胎5，6。该系统基于来自E.利托拉利斯7，8细菌的内源光活化转录因子。TAEL/C120 系统由称为 TAEL 的转录激活器组成，该激活器包含 Kal-TA4 转激活域、蓝光响应 LOV（光氧电压感应）域和六角形转氦 （HTH） DNA 绑定域5。照明后，LOV域....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究是经加州大学默塞德分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准进行的。

1. 斑马鱼穿越和胚胎采集

  1. 保持单独的转基因斑马鱼线，其中包含TAEL转录激活剂或C120控制的记者基因，以尽量减少虚假激活。
  2. 使用标准方法9从每条线上穿过6-8只成年斑马鱼，产生含有TAEL和C120成分的双转基因胚胎（图1B）。
    注:或者，这两个组件可以通过使用标准方法10对mRNA或质粒DNA进行微注射来暂时表达。
  3. 在含有蛋水的培养皿中收集胚胎（60微克/mL 即时海洋盐溶解在蒸馏水中），每个条件约有30个胚胎需要测试。
  4. 将盘子放在防光箱中或用铝箔盖住，以尽量减少环境光线的意外激活（见表1）。

2. 全球光感应

  1. 使用蓝光（465 nm）LED面板同时为多个胚胎提供激活蓝光。
  2. 将 LED 面板相对于含有胚胎的培养皿放置，以便通过光功率和能量计（图 2A）测量，胚胎接收到的实际光功率约为1.5 mW/cm 2。
  3. 如果....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对于这次演示，一条C120响应的GFP记者线（Tg（C120F:GFP）ucm107）与一条转基因线交叉，该线表示TAEL-N无处不在，来自无处不在的b（ubb:TAEL-N）促进器（Tg（ubb:TAEL-N）ucm113），以产生含有这两种元素的双转基因胚胎。24小时受精后，胚胎暴露在激活蓝光下，脉冲频率为1h/1h关闭。激活后 30 分钟、1 小时、3 小时和 6 小时（图 2B和表 1）由 qRT-PCR 量化 GFP 表达式。与控制在黑暗中的兄弟姐妹胚胎相比，在蓝光照射后30分钟就检测到了GFP表达的诱导。然后，GFP 表达水平在激活后持续增加至 6 小时。

GFP 诱导也通过检查激活后同一时间点的荧光强度（图 2C-F）进行定性评估。GF.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议描述了使用光遗传学 TAEL/C120 系统实现蓝光诱导基因表达。该系统由转录激活器 TAEL 组成，该激活器在蓝光照射下变暗，并激活 C120 调控元素下游感兴趣的基因的转录。在光照曝光后，可以检测到 GFP 记者的诱导表达，这表明此方法具有相对快速和响应灵敏的动能。

有几个因素会影响上岗水平。最关键的是激活光的波长和功率。在此协议中，使用了 465 nm LED 灯，其速度为 1.5 W/cm2。较短和较长的波长（分别为紫色和绿色光）和较低的光功率不能有效地激活表达（未显示数据）。另一方面，更多的光功率会增加胚胎光照的发生风险。因此，要成功使用 TAEL 系统，激活光必须在可见光谱的蓝色范围内 （1） 和 （2） 在足够的功率下平衡 TAEL 的有效激活和降低光破坏风险。有效的光功率可能因实验条件而异，因此可能需要进行经验确定。在激活之前，还应注意保护胚胎免受环境光的照射，环境光中含有一定量的蓝光。研究发现，TAEL/C120依赖性表达可以通过广谱环境光诱导，尽管与蓝光相比，其水平要低得多（表1）。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

没有宣布任何利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢斯特凡·马特纳和伍和马特纳实验室的成员对本协议的有益建议和评论。我们感谢安娜·里德、凯文·加德纳和劳拉·莫塔-梅纳在制定本协议时所做的宝贵讨论和见解。这项工作得到了国家卫生研究院（国家卫生研究院）的赠款的支持。R03 DK106358）和加州大学癌症研究协调委员会（CRN-20-636896）到S.W.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BioRender 基于网络的科学插图工具BioRenderhttps://biorender.com/
彩色 CCD 数码相机Lumenara755-107
紧凑型功率和能量计控制台，数字 4 英寸 LCDThorlabsPM100D
激发滤光片，545 nm奥林巴斯ET545/25x
illustra RNAspin Mini 试剂盒GE医疗保健95017-491
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
MARS AQUA 可调光 165 W LED 水族馆灯（蓝色和白色）AmazonB017GWDF7E
甲基纤维素Sigma-AldrichM7140
NEARPOW 可编程数字定时开关AmazonB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR 绿色快速混合Quantabio101414-286
Photoshop图像处理软件Adobe
Prism绘图和统计软件GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3实时PCR系统Applied BiosystemsA28137
显微镜OlympusSZX16
三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 荧光 LED 光源Excelitas010-00326R已停产。它已被 X-Cite mini+ 取代
立体

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic Gene ExpressionLight Induced ExpressionZebrafish EmbryosTAEL C120 SystemGFP ExpressionBlue Light ActivationFluorescence MicroscopyQuantitative PCRInducible Expression SystemTransgenic Zebrafish

Related Articles