光遗传学是一种具有广泛应用的强大工具。本方案展示了如何利用对蓝光响应的TAEL/C120系统，在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。
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摘要
摘要
诱导型基因表达系统是研究生物过程的宝贵工具。光遗传学表达系统利用光作为诱导剂，可精确控制基因表达的时间、空间和表达水平。本实验方案采用一种光遗传学表达系统，实现斑马鱼胚胎中光诱导的基因表达。该系统基于一种名为TAEL的工程化转录因子，该因子源自海洋细菌E. litoralis中天然存在的光激活转录因子。当受到蓝光照射时，TAEL发生二聚化，结合到其对应的调控元件C120上，从而激活转录。本方案使用转基因斑马鱼胚胎，其中TAEL转录因子在泛表达启动子ubb的驱动下表达；同时，C120调控元件驱动荧光报告基因（GFP）的表达。通过简单的LED面板提供激活用的蓝光，照射30分钟后即可检测到GFP表达的诱导，经3小时光照处理后，诱导水平可达对照的130倍以上。基因表达的诱导效果可通过定量实时PCR（qRT-PCR）和荧光显微镜进行评估。该方法是一种多功能且易于使用的光遗传学基因表达技术。
引言
诱导型基因表达系统有助于控制基因表达的量、时间和空间位置。然而，在多细胞生物中实现精确的空间和时间控制一直具有挑战性。时间控制最常用的方法是添加小分子化合物1或激活热激启动子2。但这两种方法均容易受到诱导时间、诱导强度以及脱靶应激反应等问题的影响。空间控制主要通过使用组织特异性启动子3来实现，但该方法需要合适的启动子或调控元件，而这些元件并非总是可获得，并且难以实现组织内更精细水平的诱导。
与这些传统方法不同，光激活的光遗传学转录激活因子在基因表达的时空控制方面具有更高的精确性4。蓝光响应型TAEL/C120系统已开发并优化用于斑马鱼胚胎5,6。该系统基于一种来自细菌E. litoralis的内源性光激活转录因子7,8。TAEL/C120系统包含一种名为TAEL的转录激活因子，其结构包括Kal-TA4转录激活结构域、蓝光响应型LOV（光-氧-电压感应）结构域以及螺旋-转角-螺旋（HTH）DNA结合结构域5。在光照条件下，LOV结构域发生构象变化，促使两个TAEL分子形成二聚体，结合至TAEL响应性的C120启动子，并启动下游目标基因的转录5,8。TAEL/C120系统表现出快速且强烈的诱导效果，且毒性极低，并可通过多种不同的光照方式激活。最近，通过对TAEL添加核定位信号（TAEL-N），并将C120调控元件与cFos基础启动子连接（C120F），进一步改进了TAEL/C120系统（图1A）。这些改进使诱导水平提高了15倍以上6。
在本实验方案中，使用一个简单的LED面板来激活TAEL/C120系统，从而诱导报告基因GFP的泛在性表达。基因表达的诱导可通过观察荧光强度进行定性监测，或通过定量实时PCR（qRT-PCR）检测转录水平进行定量分析。本方案将展示TAEL/C120系统作为一种多功能且易于使用的工具，可实现对基因表达的高效调控 体内.
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方案
本研究已获得加州大学默塞德分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 斑马鱼交配与胚胎收集
- 分别维持含有TAEL转录激活因子或C120调控的报告基因的转基因斑马鱼品系，以尽量减少非特异性激活。
- 采用标准方法9将每个品系的6-8条成年斑马鱼进行杂交，以获得同时含有TAEL和C120元件的双转基因胚胎（图1B）。
注意：也可通过显微注射mRNA或质粒DNA的方式，采用标准方法10瞬时表达两个元件。 - 将胚胎收集至含有卵水（在蒸馏水中溶解60 µg/mL Instant Ocean海盐）的培养皿中，每种待测条件约收集30个胚胎。
- 将培养皿置于避光盒中或用铝箔包裹，以尽量减少环境光引起的非预期激活（见表1）。
2. 全局光诱导
- 使用蓝光（465 nm）LED 面板同时向多个胚胎提供激活用蓝光。
- 将 LED 面板相对于盛有胚胎的培养皿放置，使胚胎实际接收到的光功率约为 1.5 mW/cm2，该数值需通过光功率和能量计测量确定（图 2A）。
- 若光照时间超过 3 小时，使用定时继电器以 1 小时开/1 小时关的脉冲模式进行光照，以降低对 TAEL 转录激活因子的光损伤风险5,8。
注意：确切的光照持续时间可能需要根据具体应用进行优化。本方案中提供了 30 分钟、1 小时、3 小时和 6 小时等不同光照时长的示例。 - 移除培养皿盖子，以尽量减少冷凝水引起的光散射。
- 将含有对照组胚胎的培养皿置于避光盒中，或用铝箔包裹，以实现黑暗对照。
3. 通过qRT-PCR对诱导作用进行定量评估
- 在达到所需的激活时间后，将胚胎移出光照环境。
- 使用RNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书，从30–50个光照激活的胚胎和30–50个避光胚胎中提取总RNA。
- 将胚胎转移至1.5 mL微量离心管中，去除多余的卵水。加入裂解缓冲液，并用塑料研磨棒充分匀浆胚胎。
- 将裂解液转移至试剂盒提供的柱子中，继续按照试剂盒说明书操作。立即进行步骤3.3，或将纯化后的RNA在-20 °C至-80 °C下保存。
- 使用1 µg总RNA，按照cDNA合成试剂盒说明书进行cDNA合成。
- 取一个薄壁0.2 mL PCR管，加入1 µg RNA、4 µL 5x cDNA反应主混合液（含优化缓冲液、oligo-dT和随机引物以及dNTPs）、1 µL 20x逆转录酶溶液，并用无核酸酶水补足至总体积20 µL。
- 将PCR管放入热循环仪中，程序设置如下：22 °C孵育10分钟，42 °C孵育30分钟，85 °C孵育5分钟，然后保持在4 °C。立即进行步骤3.4，或在-20 °C下保存cDNA。
- 配制qPCR反应体系，包含SYBR Green酶主混合液、5倍稀释的cDNA（步骤3.3所得）以及每种GFP引物终浓度为325 nM。
注：本实验所用引物序列如下。GFP正向引物：5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'；GFP反向引物：5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'；ef1a正向引物：5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'；ef1a反向引物：5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3'。 - 在实时荧光定量PCR仪中进行qPCR反应。
注：PCR程序为：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（95 °C变性30秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟）。 - PCR结束后进行熔解曲线分析，以确认扩增产物的特异性。每个样本设置三个技术重复。
- 采用2-ΔΔCt法11计算光照激活组相对于避光组的诱导倍数变化。可使用统计学软件进行显著性分析。
4. 通过荧光显微镜进行诱导的定性评估
- 在完成所需时间的激活后，将胚胎移出光照环境。
- 将胚胎固定于含0.01% 三卡因的3%甲基纤维素中，置于玻璃凹面载玻片内以进行成像。
- 使用连接数字相机的荧光体视显微镜，并采用标准GFP滤光片设置，采集荧光和明场图像。所有样本均应使用相同的图像采集参数。
- 使用图像处理软件在采集后合并明场与荧光图像。
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结果
在本实验中，将对C120响应的GFP报告基因品系（Tg(C120F:GFP)ucm107）与一个在ubiquitin b（ubb）启动子驱动下全身性表达TAEL-N的转基因品系（Tg(ubb:TAEL-N)ucm113）进行杂交，以获得同时携带两种元件的双转基因胚胎。受精后24小时，将胚胎暴露于蓝光下进行激活，光照程序为每1小时开启、1小时关闭的脉冲模式。在激活后的30分钟、1小时、3小时和6小时，通过qRT-PCR定量检测GFP表达的诱导情况（图2B 和 表1）。与始终保持在黑暗条件下的对照同胞胚胎相比，蓝光照射后30分钟即可检测到GFP表达的诱导信号，并且GFP表达水平在激活后持续上升，直至6小时仍呈稳定增长趋势。
还通过在激活后的相同时间点观察荧光强度，定性评估了GFP的诱导情况（图2C-
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讨论
本方案描述了使用光遗传学TAEL/C120系统实现蓝光诱导基因表达的方法。该系统包含一种转录激活因子TAEL，在蓝光照射下发生二聚化，进而激活位于C120调控元件下游的目标基因转录。在光照30分钟后即可检测到GFP报告基因的诱导表达，表明该方法具有相对较快且响应迅速的动力学特性。
多种因素可影响诱导水平，其中最关键的是激活光的波长和功率。在本方案中，使用波长为465 nm、功率为1.5 W/cm2的LED光源。较短和较长的波长（分别为紫光和绿光）以及较低的光照功率均无法有效激活表达（数据未显示）。另一方面，过高的光照功率会增加胚胎光损伤的风险。因此，要成功使用TAEL系统，激活光必须满足两个条件：（1）处于可见光谱的蓝光范围内；（2）具有足够的功率，以在有效激活TAEL的同时降低光损伤风险。有效的光照功率可能因实验条件不同而有所差异，因此可能需要通过实验确定。此外，在激活前还应注意保护胚胎，避免暴露于含有一定量蓝光的环境光中。研究发现，广谱环境光也可诱导TAEL/C120依赖性表达，但其诱导水平远低于仅使用蓝光的情况（表1）。...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢Stefan Materna以及Woo实验室和Materna实验室成员对本实验方案提出的宝贵建议和意见。感谢Anna Reade、Kevin Gardner和Laura Motta-Mena在本方案开发过程中提供的有益讨论和深刻见解。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH；R03 DK106358）和加州大学癌症研究协调委员会（CRN-20-636896）向S.W.提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 基于网络的科学绘图工具 BioRender | BioRender | https://biorender.com/ | |
| 彩色CCD数码相机 | Lumenara | 755-107 | |
| 紧凑型功率和能量计控制台，带4"数字LCD显示屏 | Thorlabs | PM100D | |
| 激发滤光片，545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini 试剂盒 | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean 海盐 | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA 可调光165 W LED水族灯（蓝色和白色） | Amazon | B017GWDF7E | |
| 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW 可编程数字定时开关 | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR Green Fast Mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop 图像处理软件 | Adobe | ||
| Prism 绘图与统计分析软件 | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | A28137 | |
| 体视显微镜 | Olympus | SZX16 | |
| 三卡因（甲磺酸乙酯-3-氨基苯甲酸酯） | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 荧光LED光源 | Excelitas | 010-00326R | 已停产。已被 X-Cite mini+ 取代 |
参考文献
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