使用光遗传TAEL/C120系统在斑马鱼胚胎中的光诱导GFP表达

摘要

光遗传学是一种功能强大的工具，具有广泛的应用。该协议演示了如何使用蓝光响应 TAEL/C120 系统在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。

摘要

诱导基因表达系统是研究生物过程的宝贵工具。光遗传表达系统可以利用光作为诱导剂，精确控制基因表达的时间、位置和振幅。在这个协议中，光遗传表达系统用于在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。该系统依赖于一个工程转录因子称为TAEL基于自然发生的光激活转录因子从细菌 E.利托拉利斯。当蓝光照射时，TAEL 变暗，与称为 C120 的认知调节元素结合，并激活转录。该协议使用转基因斑马鱼胚胎，表达TAEL转录因子在无处不在的 无所 不在的促进者控制下。同时，C120 调控元素驱动荧光记者基因 （GFP） 的表达。使用简单的 LED 面板提供激活蓝光，GFP 表达感应可在 30 分钟的照明后首先检测到，并在 3 小时光处理后达到 130 倍以上感应的峰值。表达感应可以通过定量实时PCR（qRT-PCR）和荧光显微镜进行评估。这种方法是一种多功能且易于使用的光遗传基因表达方法。

引言

诱导基因表达系统有助于控制基因表达的数量、时间和位置。然而，在多细胞生物体中实现精确的空间和时间控制是具有挑战性的。时间控制最常通过添加小分子化合物¹ 或激活热冲击促进剂²来实现。尽管如此，这两种方法都容易受到时间、上岗强度和偏离目标压力反应等问题的影响。空间控制主要通过使用组织特异性促进剂³来实现，但这种方法需要一个合适的促进者或调节元素，这些元素并不总是可用的，也不利于亚组织水平的诱导。

与这种传统方法相比，光激活光遗传学转录活化器具有更精细的基因表达空间和时间控制^的潜力。蓝光响应TAEL/C120系统被开发和优化，用于斑马鱼胚胎^5，6。该系统基于来自E.利托拉利斯^7，8细菌的内源光活化转录因子。TAEL/C120 系统由称为 TAEL 的转录激活器组成，该激活器包含 Kal-TA4 转激活域、蓝光响应 LOV（光氧电压感应）域和六角形转氦 （HTH） DNA 绑定域^5。照明后，LOV域经历了构象变化，允许两个TAEL分子变暗，与TAEL响应C120促进器结合，并启动下游感兴趣的基因^5，8的转录。TAEL/C120 系统具有快速和坚固的感应，毒性最小，并且可以通过多种不同的送光方式激活。最近，通过向 TAEL （TAEL-N） 添加核定位信号，并将 C120 监管元素与 cFos 玄武岩促进器 （C120F） （图 1A）耦合，对 TAEL/C120 系统进行了改进。这些修改使感应水平提高了15^倍以上6倍。

在此协议中，一个简单的 LED 面板用于激活 TAEL/C120 系统并诱导记者基因 GFP 的无处不在的表达。可以通过观察荧光强度或使用定量实时 PCR （qRT-PCR） 测量成绩单水平来定性地监测表达感应。该协议将证明TAEL/C120系统是一个多功能，易于使用的工具，使强大的调节基因表达 在体内。

方案

这项研究是经加州大学默塞德分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准进行的。

1. 斑马鱼穿越和胚胎采集

1. 保持单独的转基因斑马鱼线，其中包含TAEL转录激活剂或C120控制的记者基因，以尽量减少虚假激活。
2. 使用标准方法⁹从每条线上穿过6-8只成年斑马鱼，产生含有TAEL和C120成分的双转基因胚胎（图1B）。
   注:或者，这两个组件可以通过使用标准方法¹⁰对mRNA或质粒DNA进行微注射来暂时表达。
3. 在含有蛋水的培养皿中收集胚胎（60微克/mL 即时海洋盐溶解在蒸馏水中），每个条件约有30个胚胎需要测试。
4. 将盘子放在防光箱中或用铝箔盖住，以尽量减少环境光线的意外激活（见表1）。

2. 全球光感应

1. 使用蓝光（465 nm）LED面板同时为多个胚胎提供激活蓝光。
2. 将 LED 面板相对于含有胚胎的培养皿放置，以便通过光功率和能量计（图 2A）测量，胚胎接收到的实际光功率约为^1.5 mW/cm 2。
3. 如果照明超过 3 小时，则使用时器继电器以 1 小时/1 小时的间隔脉冲光线，以降低对 TAEL 转录激活器^5、8进行光伤害的风险。
   注:可能需要针对特定应用优化照明的确切持续时间。在此协议中，提供了 30 分钟、1 小时、3 小时和 6 小时照明持续时间示例。
4. 取出培养皿盖，以尽量减少凝结产生的光散射。
5. 将含有控制胚胎的培养皿放在防光箱中，或用铝箔盖住，以进行深色控制。

3. qRT-PCR 对上岗的定量评估

1. 在所需的激活持续时间后，从照明中取出胚胎。
2. 根据试剂盒的说明，使用RNA隔离套件从30-50个光激活和30-50个深色胚胎中提取总RNA。
   1. 将胚胎移植到1.5mL微中心管中，并去除多余的卵水。添加裂解缓冲器，用塑料害虫使胚胎均质化。
   2. 将解酯转移到工具包提供的列中，并继续使用套件的说明。立即开始第 3.3 步，或将纯化RNA存储在 -20 °C 至 -80 °C。
3. 使用 1 μg 总 RNA 进行 cDNA 合成，使用 cDNA 合成套件，按照套件的说明进行合成。
   1. 使用薄壁 0.2 mL PCR 管，将 1 μg 的 RNA 添加到 4 μL 的 5 倍 cDNA 反应主组合（包含优化缓冲、寡头 dT 和随机引物以及 dNTP）、1 μL 的 20 倍反向转录酶溶液和无核酸酶水，总体积为 20 μL。
   2. 将管子放在热循环器中，编程如下:22 °C 10 分钟，42 °C 30 分钟，85 °C 5 分钟，然后保持在 4 °C。 立即开始步骤 3.4 或在 -20 °C 下存储 cDNA。
4. 准备含有 SYBR 绿色酶主混合物、5 倍稀释 cDNA（步骤 3.3）和 325 nM 的 QPCR 反应，用于 GFP。
   注:本协议中使用的引点如下。GFP 转发: 5'-阿加卡CC-3':GFP 反向: 5 '- Gtccccc 加特加特加特克 - 3':ef1a 前锋 5 '- 卡卡加卡卡塔格 - 3';ef1a 反向: 5 '- 卡加加加塔克塔克塔克塔格特 - 3'） 。
5. 在实时 PCR 机器中执行 qPCR 反应。
   注:PCR 程序:初始激活速度为 95 °C，为 10 分钟，然后是 40 周期 30 秒，95 °C，30 秒 60 °C，1 分钟 72 °C。
6. 完成 PCR 后执行熔化曲线分析，以确定反应特异性。为每个示例执行三个技术复制。
7. 使用^2+Ct 方法¹¹计算光激活感应，作为相对于在黑暗中保存的胚胎的折叠变化。统计意义可以通过统计软件包确定。

4. 荧光显微镜诱导定性评估

1. 在所需的激活持续时间后，从照明中取出胚胎。
2. 固定胚胎，使其在玻璃抑郁症幻灯片中含有0.01%三甲基纤维素的3%中成像。
3. 使用标准 GFP 滤镜设置，在连接到数码相机的荧光立体显微镜上获取荧光和亮场图像。对所有样品使用相同的图像采集设置。
4. 收购后，将亮场和荧光图像与图像处理软件合并。

结果

对于这次演示，一条C120响应的GFP记者线（Tg（C120F:GFP）ucm107）与一条转基因线交叉，该线表示TAEL-N无处不在，来自无处不在的b（ubb:TAEL-N）促进器（Tg（ubb:TAEL-N）ucm113），以产生含有这两种元素的双转基因胚胎。24小时受精后，胚胎暴露在激活蓝光下，脉冲频率为1h/1h关闭。激活后 30 分钟、1 小时、3 小时和 6 小时（图 2B和表 1）由 qRT-PCR 量化 GFP 表达式。与控制在黑暗中的兄弟姐妹胚胎相比，在蓝光照射后30分钟就检测到了GFP表达的诱导。然后，GFP 表达水平在激活后持续增加至 6 小时。

GFP 诱导也通过检查激活后同一时间点的荧光强度（图 2C-F）进行定性评估。GF...

讨论

本协议描述了使用光遗传学 TAEL/C120 系统实现蓝光诱导基因表达。该系统由转录激活器 TAEL 组成，该激活器在蓝光照射下变暗，并激活 C120 调控元素下游感兴趣的基因的转录。在光照曝光后，可以检测到 GFP 记者的诱导表达，这表明此方法具有相对快速和响应灵敏的动能。

有几个因素会影响上岗水平。最关键的是激活光的波长和功率。在此协议中，使用了 465 nm LED 灯，其速度为 1.5 W/cm^2。较短和较长的波长（分别为紫色和绿色光）和较低的光功率不能有效地激活表达（未显示数据）。另一方面，更多的光功率会增加胚胎光照的发生风险。因此，要成功使用 TAEL 系统，激活光必须在可见光谱的蓝色范围内 （1） 和 （2） 在足够的功率下平衡 TAEL 的有效激活和降低光破坏风险。有效的光功率可能因实验条件而异，因此可能需要进行经验确定。在激活之前，还应注意保护胚胎免受环境光的照射，环境光中含有一定量的蓝光。研究发现，TAEL/C120依赖性表达可以通过广谱环境光诱导，尽管与蓝光相比，其水平要低得多（表1）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BioRender 基于网络的科学插图工具	BioRender		https://biorender.com/
彩色 CCD 数码相机	Lumenara	755-107
紧凑型功率和能量计控制台，数字 4 英寸 LCD	Thorlabs	PM100D
激发滤光片，545 nm	奥林巴斯	ET545/25x
illustra RNAspin Mini 试剂盒	GE医疗保健	95017-491
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA 可调光 165 W LED 水族馆灯（蓝色和白色）	Amazon	B017GWDF7E
甲基纤维素	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW 可编程数字定时开关	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR 绿色快速混合	Quantabio	101414-286
Photoshop图像处理软件	Adobe
Prism绘图和统计软件	GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3实时PCR系统	Applied Biosystems	A28137
显微镜	Olympus	SZX16
三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 荧光 LED 光源	Excelitas	010-00326R	已停产。它已被 X-Cite mini+ 取代