免疫组织化学的合成抗原对照

摘要

本研究记录了一种用于免疫组织化学的合成抗原对照品的简便制备方法。该技术可适用于多种抗原，并能在较宽的浓度范围内进行调整。所制备的样品可作为参考，用于评估实验内和实验间的一致性及可重复性。

摘要

免疫组织化学（IHC）检测可提供有关蛋白质表达模式的重要信息，其可靠解读依赖于经过充分表征的阳性和阴性对照样本。由于合适的组织或细胞系对照并不总是可获得，因此建立一种简便的方法来制备合成的IHC对照可能具有重要意义。本文介绍了一种适用于多种抗原类型（包括蛋白质、多肽或寡核苷酸）且浓度范围广泛的合成IHC对照制备方法。本方案以人红细胞白血病致癌基因B2（ERBB2/HER2）胞内区（ICD）的一段多肽为例，该多肽可被多种具有诊断意义的抗体识别。将HER2 ICD多肽在牛血清白蛋白（BSA）溶液中进行系列稀释后，加入甲醛并在85 °C加热10分钟，使多肽与BSA混合物凝固并发生交联。所得凝胶可像组织样本一样进行处理、切片和染色，从而获得一系列已知抗原浓度的样本，其染色强度覆盖较宽的范围。

该简易方案与常规组织学实验室操作流程一致。本方法仅要求使用者具备足量的目标抗原。可自行合成或商业制备编码相关表位的重组蛋白、蛋白结构域或线性肽段。自行制备抗体的实验室可保留免疫原性抗原的等分试样，作为合成对照靶标。通过制备浓度范围广泛的明确定义的阳性对照，使用者可评估实验室内及实验室间检测的性能，深入了解其检测方法的动态范围和线性关系，并针对特定实验目标优化检测条件。

引言

免疫组织化学（IHC）能够在福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织切片中，对目标抗原进行灵敏、特异且空间定位精确的检测。然而，IHC染色结果可能受到多种变量的影响，包括热缺血和冷缺血时间、组织固定、组织预处理、抗体活性与浓度、检测体系的化学反应以及反应时间¹。因此，为确保IHC反应结果的可重复性并实现准确判读，必须严格控制这些变量，并使用经过充分表征的阳性与阴性对照样本。常用的对照包括已知表达目标抗原的石蜡包埋组织或细胞系，这些信息通常来自独立的分析结果，但此类样本并非总是可获得¹。此外，组织和细胞系对照中目标抗原的表达水平通常仅能定性了解，且可能存在变异。含有可重复、浓度精确已知的目标抗原的对照样本，有助于优化IHC反应条件。作者已描述一种通用方法，可适用于多种抗原类型，并在生理相关浓度范围内制备合成IHC对照样本²。本文提供了该类标准品制备与使用的详细实验方案。

适当的对照对于正确解读免疫组化（IHC）检测结果至关重要^1,3,4。根据研究人员的具体需求，已采用组织、培养细胞以及包被多肽的基质作为IHC对照。使用组织作为IHC对照的优势与局限性已....

方案

1. 储备液和工具的准备

1. 在50 mL锥形管中，将5 g BSA粉末加入14 mL、pH 7.2的PBS中，配制20 mL 25% w/v BSA溶液，搅拌至均匀分散。必要时使用涡旋振荡器帮助分散BSA粉末。
   1. 将溶液在4 °C下静置过夜，以确保完全溶解。用PBS定容至20 mL，得到25% w/v的储存液。
2. 在50 mL锥形管中，将6.26 g BSA粉末加入13 mL、pH 7.2的PBS中，配制20 mL 31.3% w/v BSA溶液，搅拌至均匀分散。将溶液在4 °C下静置过夜，以确保完全溶解。用PBS定容至20 mL，得到31.3% w/v的储存液。
3. 将金属加热块预热至85 °C。
   注意：以下方案在1.5 mL微量离心管中制备体积为1.26–1.4 mL的肽/BSA凝胶。若需使用更小体积（例如抗原储备量有限时），可在PCR管中制备凝胶，并使用设定为85 °C的PCR仪作为加热装置。
4. 通过将700 µL 25% BSA溶液与700 µL 37%甲醛混合，检测BSA/甲醛混合物是否能按预期形成凝胶。在5–10秒内上下吹打5次，充分混匀，避免产生气泡。
   警告：浓甲醛具有毒性，请采取适当的安全防护措施。
5. BSA溶液与甲醛溶液混合后立即封闭微量离心管，置于85 °C加热块中加热10分钟。取出后让其自然冷却。确认凝胶已按预期形成。

....

结果

多肽应在室温下完全溶解于适当的溶剂中，形成光学澄清的溶液。如果在30-60分钟后仍存在可见的颗粒物质，可尝试加入额外体积的原始溶剂或替代溶剂，但总体积不得超过表1中计算的5倍浓度多肽储备液的预定体积。同样，多肽与BSA的混合溶液应保持半透明状态（图1A）。

肽/BSA 凝胶样品在与37%甲醛加热后应形成不透明的橡胶状物质（图1B-I）。在从微量离心管中取出时，凝胶样品可能出现轻微断裂（图3A），但这不应影响后续步骤。石蜡包埋的凝胶样品应能顺利切片，不发生撕裂或震颤。若切片出现不规则撕脱（图3B），可通过减少修块面的切削力度和/或短暂浸泡于冰水或氨水中加以改善。当一种或多种染色试剂分布不均时，可能出现呈水印样模式的信号减弱区域（

讨论

该方法允许用户利用大多数组织学实验室常见的材料和技术，制备具有已知组成和抗原浓度的均匀样品，作为免疫组化（IHC）反应中的标准品。最关键的步骤是确定目标抗体所结合的表位。本方案描述了使用来自ERBB2/HER2胞内区（ICD）的线性肽抗原进行操作。相同的方案也可用于制备含有寡核苷酸、荧光标记、蛋白质结构域或全长蛋白质的BSA凝胶。后一种方法对于识别构象性表位的抗体尤为有用，因为单一线性肽序列无法重建此类表位。例如，含有0.1 mg/mL小鼠、大鼠和兔源性天然IgG的BSA凝胶标准品可作为流程对照，以确认二抗检测和染色步骤按预期正常进行。

本文所述的抗原-BSA凝胶方法可与其他技术相互补充，用于控制和标准化免疫组化（IHC）反应。具有明确目标抗原表达水平的细胞系和组织样本对于严格控制的IHC实验方案至关重要^1,3,4。已有研究提出将偶联在玻片或玻璃微珠表面的多肽作为定量对照

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗 HER2/neu 克隆 4B5	Ventana	5278368001
活检包埋盒	Leica	3801090
牛血清白蛋白，超纯	Cell Signaling Technology	BSA #9998
50 mL 圆底离心管	Corning	352070
一次性底模（15 mm x 15 mm）	Fisher	22-363-553
一次性底模 （24 mm x 24 mm）	Fisher	22-363-554
一次性刮勺	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% 甲醛	Electron Microscopy Sciences	15686
ERBB2 / HER2 肽段			UniProt P04626-1；氨基酸 1240-55
Leica Autostainer XL	Leica	ST5010
磁力搅拌子
NanoZoomer 2.0 HT 全片图像扫描仪	Hamamatsu
10% 中性缓冲福尔马林	VWR	16004-128
无核酸酶微离心管 1.5 mL
Paraplast 石蜡	Leica	39601006
肽段参数计算器	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
肽段供应商	ABclonal Science		用户应联系肽段供应商以获取质量、纯度和成本的详细信息。
	Anaspec Peptide		用户应联系肽段供应商以获取质量、纯度和成本的详细信息。
	CPC Scientific		用户应联系肽段供应商以获取质量、纯度和成本的详细信息。
	New England Peptide		用户应联系肽段供应商以获取质量、纯度和成本的详细信息。
磷酸盐缓冲液 pH 7.2
试剂级乙醇	Thermo Scientific	9111
单刃剃刀	VWR	55411-050
Superfrost Plus 带正电荷载玻片	Thermo Scientific	6776214
TMA 组织阵列仪（Tissue Grand Master）	3DHISTECH
二甲苯	VWR	89370-088