用于荧光标记大促卵体定量的自动成像和分析

Summary

使用多孔微孔板的自动测定是识别通路调节剂的有利方法，因为它允许在单个实验中评估多种条件。在这里，我们将完善的巨噬菌体成像和定量方案改编为96孔微孔板格式，并为使用多模读板仪的自动化提供了全面的概述。

Abstract

大吞细胞增多症是一种非特异性液相摄取途径，允许细胞通过大量内吞作用内吞化大细胞外货物，如蛋白质、病原体和细胞碎片。该途径在各种细胞过程中起着至关重要的作用，包括免疫反应和癌细胞代谢的调节。鉴于这种在生物学功能中的重要性，检查细胞培养条件可以通过识别该途径的调节因子并优化用于发现新治疗方法的条件来提供有价值的信息。该研究描述了一种使用标准实验室设备和细胞成像多模读板仪的自动成像和分析技术，用于快速定量贴壁细胞中的大旋囊细胞指数。该自动化方法基于高分子量荧光葡聚糖的摄取，可应用于96孔微孔板，以方便评估一个实验中的多种条件或安装在玻璃盖玻片上的固定样品。这种方法旨在最大限度地提高可重复性并减少实验变异，同时节省时间和成本效益。

Introduction

巨噬细胞增多症的非特异性内吞途径允许细胞通过大量摄取细胞外液及其成分来内化各种细胞外成分，包括营养素、蛋白质、抗原和病原体¹。虽然对许多细胞类型的生物学很重要，但越来越多地描述了巨细胞增多途径在肿瘤生物学中起着至关重要的作用，其中通过大囊泡摄取，肿瘤细胞能够在营养耗尽的微环境中存活和增殖^2，3。细胞外大分子（包括白蛋白和细胞外基质）以及坏死细胞碎片的摄取，通过大卵子体和溶酶体融合介导的货物分解代谢产生氨基酸、糖、脂质和核苷酸，为生物质生产提供了替代营养来源^{4，5，6，7，8}。

巨噬细胞增多症的诱导和调节是复杂的，并且可能因细胞环境而异。到目前为止，已经确定了几种大吞细胞增多症的诱导剂，包括配体，例如表皮生长因子（EGF），血小板衍生生长因子（PDGF），半乳糖凝集素-3和Wnt3A9，^1....

Protocol

1. 准备材料

1. 将标有FITC或四甲基罗丹明（TMR）的70 kDa葡聚糖溶解在PBS中，以获得20mg / mL溶液。将等分试样储存在-20°C。
2. 将DAPI溶解在ddH ₂ O中，以获得1mg / mL溶液。将等分试样储存在-20°C。
   注意:DAPI 是一种潜在的致癌物质，应谨慎处理。
3. 
   
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   ....

Results

当相应地遵循上述方案的步骤和调整时，最终实验结果应提供有关所研究的细胞培养条件或抑制剂是否诱导或减少目标细胞系中的巨噬细胞增多症的信息。为了加强这些发现的有效性，纳入控制条件将允许对结果进行仔细检查，以确定实验是否已成功完成。巨噬细胞增多症诱导对照将提供有关巨噬细胞增多症相对水平的信息。为此，配体EGF是最常用的¹³。在AsPC-1 PDAC细胞中，在加入葡聚糖之前以100ng / mL加入EGF5分钟激活巨噬细胞增多症（图5A）。此外，通过剥夺细胞的谷氨酰胺16-24小时，可以诱导自分泌EGF激活大吞细胞增多症（图5A）。或者，可以根据细胞类型和可用文献掺入其他诱导剂;这些可能包括PDGF或Wnt3A10^，11，12。并非所有细胞的行为都相似，KRAS突变细胞可能表现.......

Discussion

实验和数据采集的质量在很大程度上取决于试剂的质量、设置的优化以及盖玻片和微孔板的清洁度。最终结果应给出重复之间的最小差异;然而，生物变异确实是自然发生的，或者可能是由许多因素引起的。细胞密度可能导致细胞或多或少地对巨噬细胞增多诱导剂或抑制剂作出反应。因此，遵守协议中建议的80%汇合度至关重要。或者，微孔板制造商有充分的记录，即介质蒸发发生在96孔微孔板上。在这里，外孔相对于内孔受到更多的蒸发，从而可能影响巨细胞增多症。因此，可以选择不在分析中包括外井，而是用PBS填充这些井，以建立"缓冲壁"以保护内孔免受大量蒸发。

强烈建议目视检查每种情况的图像，以确定采集是否成功完成。这可以在第一组条件的成像过程中完成，以确定应用的设置确实是正确的，并允许在需要时进行干预。可能发生的具体问题如下:图像过度曝光（图7A），图像失焦（图7B），图像包含荧光葡聚糖（图7C）或残留物的斑点（

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 胰蛋白酶	康宁	25053CI	0.1% EDTA 的 HBSS 溶液，不含钙、镁和碳酸氢钠
1.5 mL 微量离心管	Fisherbrand	05-408-129
10 cm 组织培养皿	Greiner Bio-One	664160	CELLSTAR
15 mL 离心管	Fisherbrand	07-200-886
2 L 烧杯	Fisherbrand	02-591-33
24 孔组织培养板	Greiner Bio-One	662160	CELLSTAR
25 mL 试剂储液槽	Genesee Scientific Corporation	28-121
500 mL 烧杯	Fisherbrand	02-591-30
6 cm 组织培养皿	Greiner Bio-One	628160	CELLSTAR
8 通道吸液适配器	IntegraBiosciences	155503
用于标准吸头的 8 通道吸液适配器	Integra Biosciences 159024
95% 乙醇	Decon Laboratories Inc	4355226
无氨玻璃清洁剂	Sparkle	FUN20500CT
Black 96 孔高内涵筛选微孔板	PerkinElmer	6055300	CellCarrier-96 Ultra
棉签涂覆器	Fisherbrand	23-400-101
盖玻片	Fisherbrand	12-545-80	12 mm 直径
Cytation 5 细胞成像 多功能微孔板检测	Biotek	CYT5FW
DAPI	Millipore Sigma	5.08741
葡聚糖 70 kDa - FITC	Life Technologies	D1822	赖
氨酸固定葡聚糖 70 kDa - TMR	Life Technologies	D1819
DMSO	Millipore Sigma	D1435
DPBS	Corning	21031CV	无钙镁
镊子	精细科学工具	11251-20	Dumont #5
甲醛，37%	Ricca Chemical	RSOF0010-250A	ACS 试剂级
甘油	Fisher生物试剂	BP229-1
硬化荧光封片剂	Agilent Tech	S302380-2	DAKO
Hoechst 33342	Millipore Sigma	B2261
盐酸 （HCl）	Fisher Chemical	A144-212	认证 ACS Plus，36.5%–38.0%
无绒湿巾	Kimberly-Clark	34155	Kimwipes
Miscroscope 载玻片	Fisherbrand	12-544-1	高级普通玻璃
通道移液器	Gilson	FA10013	8 通道，0.5–10 µL
多通道移液器	Gilson	FA10012	12 个通道，20–200 和微量;L
多通道移液器	Gilson	FA10011	8 通道，20–200 和微量;L
Parafilm M	Pechiney	PM996
保鲜膜	Kirkland Signature	208733	Stretch-Tite
硅胶隔离器	Grace Bio Labs Inc	664107	13 mm 直径 X 0.8 mm 深度 ID，25 mm X 25 mm
滑动适配器	Biotek	1220548
洗瓶	Fisherbrand	FB0340922C