用于荧光标记巨胞饮体定量的自动化成像与分析

摘要

采用多孔微孔板的自动化检测方法具有显著优势，可通过单次实验评估多种条件，从而有效鉴定信号通路调控因子。本文中，我们将已建立的大胞饮囊泡成像与定量检测方案优化为适用于96孔微孔板的格式，并提供了利用多功能酶标仪进行自动化操作的全面流程说明。

摘要

巨胞饮作用是一种非特异性的液相内吞途径，可使细胞通过大量内吞作用摄取大分子胞外物质，例如蛋白质、病原体和细胞碎片。该途径在多种细胞过程中发挥关键作用，包括免疫应答调控和癌细胞代谢。鉴于其在生物学功能中的重要性，研究细胞培养条件可为识别该途径的调控因子以及优化条件以用于发现新型治疗策略提供有价值的信息。本研究描述了一种利用常规实验设备和细胞成像多功能酶标仪的自动化成像与分析技术，用于快速定量贴壁细胞的巨胞饮指数。该自动化方法基于高分子量荧光葡聚糖的摄取，可应用于96孔微孔板，以便在单次实验中评估多种条件，也可用于固定后置于玻璃盖玻片上的样品。该方法旨在最大限度提高可重复性、减少实验变异，同时兼具省时和经济高效的特点。

引言

巨胞饮作用作为一种非特异性的内吞途径，可使细胞通过大量摄取细胞外液体及其成分，内化多种细胞外物质，包括营养物质、蛋白质、抗原和病原体¹。尽管该过程在多种细胞类型的生物学中具有重要作用，但越来越多的研究表明，巨胞饮通路在肿瘤生物学中也发挥着关键作用：肿瘤细胞可通过巨胞饮摄取，在营养匮乏的微环境中维持存活并增殖^2,3。通过摄取细胞外大分子物质（如白蛋白和细胞外基质）以及坏死细胞碎片，可在巨胞饮体与溶酶体融合介导的货物降解过程中生成氨基酸、糖类、脂质和核苷酸，从而为生物大分子合成提供替代性营养来源^4,5,6,7,8。

巨胞饮作用的诱导与调控机制十分复杂，且可能因细胞环境的不同而有所差异。迄今为止，已鉴定出多种巨胞饮作用的诱导剂，包括表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、半乳糖凝集素-3（galectin-3）和Wnt3A等配体⁹

方案

1. 材料准备

1. 将70 kDa的FITC或四甲基罗丹明（TMR）标记的葡聚糖溶解于PBS中，配制成20 mg/mL的溶液。将分装样品储存于-20 °C。
2. 将DAPI溶解于ddH₂O中，配制成1 mg/mL的溶液。将分装样品储存于-20 °C。
   警告：DAPI为潜在致癌物，操作时应小心谨慎。
3. 在固定当天，用PBS新鲜配制3.7%的ACS级甲醛溶液。
   警告：甲醛为固定剂，已知具有致癌性，吸入后有毒。应在化学通风橱中配制以避免吸入，并小心操作。
4. 制备酸洗盖玻片。
   1. 使用500 mL烧杯和水浴，在100 mL的1 M HCl中加热28 g直径为12 mm、#1.5厚度的硼硅酸盐玻璃盖玻片，56 °C下持续24小时。用塑料封口膜密封烧杯，以防止过度蒸发。
      警告：HCl为强酸，具有强腐蚀性，应在化学通风橱中操作以避免吸入，并小心处理。
   2. 用蒸馏水清洗盖玻片，重复清洗4次。然后用95%乙醇清洗盖玻片，重复清洗4次。
   3. 将酸洗后的盖玻片置于细胞培养皿中，浸没于95%乙醇中以保持无菌，于室温下储存以备后续使用。用Parafilm封口膜密封培养皿，以防止过度蒸发。

2. 细胞的制备

1. 使用一个长满细胞的10 cm组织培养板，其中含有目标....

结果

若严格按照上述方案的步骤和调整进行操作，最终的实验结果应能提供有关所研究的细胞培养条件或抑制剂是否诱导或抑制目标细胞系巨胞饮作用的信息。为了增强这些发现的可靠性，设置对照条件有助于对结果进行严格评估，以确定实验是否成功完成。巨胞饮诱导对照可提供关于巨胞饮相对水平的信息。为此，最常用的配体是表皮生长因子（EGF）¹³。在AsPC-1胰腺导管腺癌（PDAC）细胞中，在加入葡聚糖前添加100 ng/mL EGF处理5分钟，可激活巨胞饮作用（图5A）。此外，通过将细胞在无谷氨酰胺培养基中培养16–24小时，可诱导自分泌EGF介导的巨胞饮激活（图5A）。根据细胞类型和现有文献，也可采用其他诱导剂，例如PDGF或Wnt3A^10,11,12。并非所有细胞的行为都相同，携带KRAS突变.......

讨论

实验质量和数据采集结果在很大程度上取决于试剂的质量、仪器参数的优化以及盖玻片和微孔板的清洁程度。最终结果应在重复样本之间表现出尽可能小的差异；然而，生物学变异可能自然发生，或由多种因素引起。细胞密度可能影响细胞对大胞饮诱导剂或抑制剂的反应程度。因此，严格遵循本方案中建议的80%汇合度至关重要。此外，微孔板制造商已有明确说明，在96孔微孔板中会发生培养基蒸发现象。其中，边缘孔的蒸发程度高于中心孔，从而可能影响大胞饮作用。因此，可选择不在分析中纳入边缘孔，而将这些孔中加入PBS，形成“缓冲屏障”，以减少中心孔的过度蒸发。

强烈建议对每种条件下的图像进行目视检查，以确定图像采集是否成功完成。可在采集第一组条件时即进行此项检查，以确认所用设置是否正确，并在必要时及时干预。可能出现的具体问题包括：图像过曝（图7A）、图像失焦（图7B）、图像中出现荧光葡聚糖斑块（图7C）或残留物（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Corning	25053CI	HBSS 中含 0.1% EDTA，不含钙、镁和碳酸氢钠
1.5 mL 微量离心管	Fisherbrand	05-408-129
10 cm 组织培养皿	Greiner Bio-One	664160	CELLSTAR
15 mL 离心管	Fisherbrand	07-200-886
2 L 烧杯	Fisherbrand	02-591-33
24 孔组织培养板	Greiner Bio-One	662160	CELLSTAR
25 mL 试剂储液槽	Genesee Scientific Corporation	28-121
500 mL 烧杯	Fisherbrand	02-591-30
6 cm 组织培养皿	Greiner Bio-One	628160	CELLSTAR
8 通道吸液适配器	Integra Biosciences	155503
适用于标准吸头的 8 通道吸液适配器	Integra Biosciences	159024
95% 乙醇	Decon Laboratories Inc	4355226
无氨玻璃清洁剂	Sparkle	FUN20500CT
黑色 96 孔高内涵筛选微孔板	PerkinElmer	6055300	CellCarrier-96 Ultra
棉签	Fisherbrand	23-400-101
盖玻片	Fisherbrand	12-545-80	直径 12 mm
Cytation 5 细胞成像多功能读板仪	Biotek	CYT5FW
DAPI	Millipore Sigma	5.08741
70 kDa 右旋糖酐-FITC	Life Technologies	D1822	可被赖氨酸交联固定
70 kDa 右旋糖酐-TMR	Life Technologies	D1819
DMSO	Millipore Sigma	D1435
DPBS	Corning	21031CV	不含钙和镁
镊子	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
甲醛，37%	Ricca Chemical	RSOF0010-250A	ACS 试剂级
甘油	Fisher BioReagents	BP229-1
硬化型荧光封片介质	Agilent Tech	S302380-2	DAKO
Hoechst 33342	Millipore Sigma	B2261
盐酸 (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	经认证的 ACS Plus，36.5%–38.0%
无尘擦拭纸	Kimberly-Clark	34155	Kimwipes
显微镜载玻片	Fisherbrand	12-544-1	优质普通玻璃
多通道移液器	Gilson	FA10013	8 通道，0.5–10 µL
多通道移液器	Gilson	FA10012	12 通道，20–200 µL
多通道移液器	Gilson	FA10011	8 通道，20–200 µL
Parafilm M 封口膜	Pechiney	PM996
塑料保鲜膜	Kirkland Signature	208733	Stretch-Tite
硅胶隔离器	Grace Bio Labs Inc	664107	内径 13 mm × 深度 0.8 mm，25 mm × 25 mm
载玻片适配器	Biotek	1220548
洗瓶	Fisherbrand	FB0340922C