采用多孔微孔板的自动化检测方法具有显著优势，可通过单次实验评估多种条件，从而有效鉴定信号通路调控因子。本文中，我们将已建立的大胞饮囊泡成像与定量检测方案优化为适用于96孔微孔板的格式，并提供了利用多功能酶标仪进行自动化操作的全面流程说明。
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摘要
摘要
巨胞饮作用是一种非特异性的液相内吞途径，可使细胞通过大量内吞作用摄取大分子胞外物质，例如蛋白质、病原体和细胞碎片。该途径在多种细胞过程中发挥关键作用，包括免疫应答调控和癌细胞代谢。鉴于其在生物学功能中的重要性，研究细胞培养条件可为识别该途径的调控因子以及优化条件以用于发现新型治疗策略提供有价值的信息。本研究描述了一种利用常规实验设备和细胞成像多功能酶标仪的自动化成像与分析技术，用于快速定量贴壁细胞的巨胞饮指数。该自动化方法基于高分子量荧光葡聚糖的摄取，可应用于96孔微孔板，以便在单次实验中评估多种条件，也可用于固定后置于玻璃盖玻片上的样品。该方法旨在最大限度提高可重复性、减少实验变异，同时兼具省时和经济高效的特点。
引言
巨胞饮作用作为一种非特异性的内吞途径，可使细胞通过大量摄取细胞外液体及其成分，内化多种细胞外物质，包括营养物质、蛋白质、抗原和病原体1。尽管该过程在多种细胞类型的生物学中具有重要作用，但越来越多的研究表明，巨胞饮通路在肿瘤生物学中也发挥着关键作用：肿瘤细胞可通过巨胞饮摄取，在营养匮乏的微环境中维持存活并增殖2,3。通过摄取细胞外大分子物质（如白蛋白和细胞外基质）以及坏死细胞碎片，可在巨胞饮体与溶酶体融合介导的货物降解过程中生成氨基酸、糖类、脂质和核苷酸，从而为生物大分子合成提供替代性营养来源4,5,6,7,8。
巨胞饮作用的诱导与调控机制十分复杂，且可能因细胞环境的不同而有所差异。迄今为止，已鉴定出多种巨胞饮作用的诱导剂，包括表皮生长因子（EGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、半乳糖凝集素-3（galectin-3）和Wnt3A等配体9,10,11,12,13此外，模拟肿瘤微环境的培养条件可触发该通路的活化。胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤处于营养匮乏状态，尤其缺乏氨基酸谷氨酰胺，这使得癌细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）均依赖巨胞饮作用以维持生存。7,13,14,15此外，肿瘤微环境中的应激因素（如缺氧和氧化应激）可激活这一清除通路16除了多种可诱导大胞饮作用的外在影响因素外，还有多种细胞内信号通路调控大胞饮体的形成。致癌性Ras介导的转化足以启动大胞饮机制，且多种癌症类型均表现出由致癌性Ras驱动的组成性大胞饮作用4,5,9,17或者，已发现野生型Ras激活以及Ras非依赖性通路可在癌细胞和癌症相关成纤维细胞（CAFs）中激活巨胞饮作用10,11,15,18. 各种方法的使用 体外 结合抑制剂处理的模型已鉴定出多个巨胞饮调节因子，包括钠氢交换体、小GTP酶Rac1、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、p21活化激酶（Pak）以及AMP活化蛋白激酶（AMPK）。4,13,15然而，鉴于目前已知的调控巨胞饮作用的因素和条件众多，很可能仍有许多调节因子和刺激信号尚未被发现。通过在单次实验中自动化评估多种条件，有助于发现新的调节因子和刺激物。该方法可揭示参与巨胞饮体形成的相关因素，并可能促进靶向此通路的新型小分子或生物制剂的发现。
此处，我们改进了先前建立的用于测定癌细胞中巨胞饮作用程度的实验方案 体外 96孔微孔板格式以及自动化成像与定量分析19,20该方案基于荧光显微镜技术，该技术已成为确定巨胞饮作用领域的标准方法。 体外 和 体内4,5,6,7,9,10,11,12,13,15,16,17,18,19,20,21,22巨胞饮体可通过其内化大分子物质的能力与其他内吞途径相区分，例如可内化高分子量的葡聚糖（如70 kDa）。2,3,4,20,21,22,23因此，可通过细胞对外源性荧光标记的70 kDa葡聚糖的摄取来定义巨胞饮体。结果表明，巨胞饮囊泡表现为细胞内荧光斑点的聚集，其大小范围为0.2-5 µm这些斑点可通过显微成像并进一步定量，以确定细胞中巨胞饮作用的程度——即“巨胞饮指数”。
本方案中观察贴壁细胞内巨胞饮泡的关键步骤 体外 使用标准实验室设备在96孔微孔板和盖玻片上进行的操作步骤 (图1)此外，本文提供了使用细胞成像多功能酶标仪自动进行图像采集及大胞饮指数定量的操作步骤。相较于我们此前描述的实验方案，该自动化方法可显著节省时间、降低成本并减少操作工作量。19,20此外，该方法可避免成像采集与分析过程中无意引入的偏差，从而提高实验的可重复性与可靠性。该方法可轻松适用于不同细胞类型或酶标仪，也可用于测定巨胞饮体的其他特征参数，如大小、数量和位置。本文所述方法特别适用于筛选诱导巨胞饮作用的细胞培养条件、鉴定新型调控因子，或优化已知抑制剂的药物浓度。
图1：测定贴壁细胞“大胞饮指数”的自动化检测示意图。 使用 BioRender 制作。 请点击此处查看此图的放大版本。
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方案
1. 材料准备
- 将70 kDa的FITC或四甲基罗丹明（TMR）标记的葡聚糖溶解于PBS中，配制成20 mg/mL的溶液。将分装样品储存于-20 °C。
- 将DAPI溶解于ddH2O中，配制成1 mg/mL的溶液。将分装样品储存于-20 °C。
警告：DAPI为潜在致癌物，操作时应小心谨慎。 - 在固定当天，用PBS新鲜配制3.7%的ACS级甲醛溶液。
警告：甲醛为固定剂，已知具有致癌性，吸入后有毒。应在化学通风橱中配制以避免吸入，并小心操作。 - 制备酸洗盖玻片。
- 使用500 mL烧杯和水浴，在100 mL的1 M HCl中加热28 g直径为12 mm、#1.5厚度的硼硅酸盐玻璃盖玻片，56 °C下持续24小时。用塑料封口膜密封烧杯，以防止过度蒸发。
警告：HCl为强酸，具有强腐蚀性，应在化学通风橱中操作以避免吸入，并小心处理。 - 用蒸馏水清洗盖玻片，重复清洗4次。然后用95%乙醇清洗盖玻片，重复清洗4次。
- 将酸洗后的盖玻片置于细胞培养皿中，浸没于95%乙醇中以保持无菌，于室温下储存以备后续使用。用Parafilm封口膜密封培养皿，以防止过度蒸发。
- 使用500 mL烧杯和水浴，在100 mL的1 M HCl中加热28 g直径为12 mm、#1.5厚度的硼硅酸盐玻璃盖玻片，56 °C下持续24小时。用塑料封口膜密封烧杯，以防止过度蒸发。
2. 细胞的制备
- 使用一个长满细胞的10 cm组织培养板，其中含有目标贴壁细胞，吸除培养基，并用5 mL预热至37 °C的DPBS冲洗细胞。
- 加入1.5 mL预热的0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育，使细胞从培养板上脱离。
注意：所需胰蛋白酶消化时间应通过实验确定，可通过在普通光学显微镜下观察细胞脱落情况来确认。 - 将细胞收集至15 mL离心管中，并加入4.5 mL完全培养基以中和胰蛋白酶活性。
- 在200 × g 条件下离心3 min使细胞沉淀，并吸除上清液。
- 用适量预热的完全培养基重悬细胞沉淀，制备单细胞悬液用于接种。
- 将细胞接种至含盖玻片的24孔板或96孔微孔板中（图1）。
注意：每种细胞系的接种细胞数量应通过实验确定，因为不同细胞系的增殖速率和细胞大小存在差异。本方案已针对在巨胞饮标记当天达到80%汇合度的贴壁癌细胞进行了优化。细胞汇合度可能影响巨胞饮能力，也应通过实验确定。- 24孔板含盖玻片格式
- 将盖玻片放入24孔组织培养板中，使用镊子从乙醇浴中夹取单个盖玻片，轻触板内壁以去除多余乙醇，然后将其平整放置于孔底。
- 待乙醇完全挥发后，用DPBS洗涤盖玻片两次。
- 通过向每孔加入500 µL细胞悬液，将细胞接种至盖玻片表面。将细胞置于37 °C、含5% CO2的细胞培养箱中培养，直至巨胞饮标记前一日细胞汇合度达到60%-80%。
- 巨胞饮标记前一日，吸除各孔中的培养基，向每孔加入500 µL预热的无血清培养基，并将细胞置于37 °C、含5% CO2的细胞培养箱中孵育16–24 h。
注意：根据研究条件的不同，建议使用无血清培养基以减少血清中通常存在的、可诱导巨胞饮的生长因子的影响。但需注意，血清饥饿可能影响其他细胞过程，如增殖和自噬。由于残留血清可能影响细胞的巨胞饮能力以及抑制剂的活性，可通过用500 µL预热的DPBS轻柔冲洗细胞1–2次，以更有效地去除血清。
- 96孔微孔板格式
- 将细胞悬液转移至25 mL试剂储液槽中。使用多通道移液器（8或12通道），向黑色96孔高内涵筛选微孔板（底部为光学透明的环烯烃共聚物或玻璃底）的每孔加入100 µL细胞悬液。
- 将细胞置于37 °C、含5% CO2的细胞培养箱中培养，直至巨胞饮标记前一日细胞汇合度达到60%-80%。
- 巨胞饮标记前一日，使用多通道移液器（8或12通道）或连接真空泵的标准吸头多通道吸液适配器，吸除并弃去每孔中的培养基。
- 使用试剂储液槽和多通道移液器（8或12通道），向每孔轻柔加入100 µL预热的无血清培养基。将细胞置于37 °C、含5% CO2的细胞培养箱中孵育16–24 h。
注意：根据研究条件的不同，建议使用无血清培养基以减少血清中通常存在的、可诱导巨胞饮的生长因子的影响。但需注意，血清饥饿可能影响其他细胞过程，如增殖和自噬。由于残留血清可能影响细胞的巨胞饮能力以及抑制剂的活性，可通过用100 µL预热的DPBS轻柔冲洗细胞1–2次，以更有效地去除血清。
- 24孔板含盖玻片格式
3. 大型胞饮泡标记
- 采用盖玻片格式的24孔板
- 吸去各孔中的液体，每孔重新加入200 µL含1 mg/mL荧光标记的高分子量（70 kDa）葡聚糖的无血清培养基。将细胞置于37 °C细胞培养箱中孵育30分钟。
注意：根据所研究的实验条件，可选择不使用新鲜培养基，而重复使用条件培养基进行葡聚糖负载，因其可能含有细胞分泌或额外添加的因子（如EGF或抑制剂化合物），这些因子可能影响细胞的大胞饮能力。 - 吸去培养基，使用预冷的冲洗瓶，用冰浴PBS快速而轻柔地洗涤细胞5次。每次洗涤时用手用力振荡培养板，以帮助去除粘附在盖玻片上的葡聚糖聚集体。
- 加入350 µL 3.7%甲醛固定细胞，孵育20分钟。随后吸去固定液，用PBS洗涤细胞两次。
- 用含2 µg/mL DAPI的PBS溶液350 µL对细胞核进行染色。20分钟后吸去DAPI溶液，用PBS洗涤细胞三次。
- 将硅胶隔离器并排粘附于显微镜载玻片上，以实现盖玻片的均匀间距和可重复定位，这是实现成像自动化的必要条件（图2A，B）。
注意：一张完整的显微镜载玻片最多可放置3个隔离器。 - 对于每一片盖玻片，在显微镜载玻片上隔离器的开放区域内滴加一滴硬化型荧光封片剂（图2C）。使用镊子夹取盖玻片，并用无绒擦拭纸轻轻敲击其侧面，以去除多余的PBS。
- 将盖玻片倒置于封片剂液滴上（图2D）。用闭合的镊子轻轻敲击盖玻片，以排除封片剂中的气泡（图2E）。
- 将载玻片置于避光环境中，在室温下静置使封片剂干燥，通常需16–24小时。载玻片现可用于成像，或在-20 °C保存最多2周。
- 成像前，从显微镜载玻片上移除隔离器。让载玻片恢复至室温，并使用蘸有无氨玻璃清洁剂的棉签清洁盖玻片表面。随后，使用蘸有70%乙醇的洁净棉签进行二次清洁，并使盖玻片自然干燥。
- 吸去各孔中的液体，每孔重新加入200 µL含1 mg/mL荧光标记的高分子量（70 kDa）葡聚糖的无血清培养基。将细胞置于37 °C细胞培养箱中孵育30分钟。
图 2：在载玻片上使用硅胶隔离器放置盖玻片。（A）将硅胶隔离器压紧并粘附到载玻片上。（B）整个载玻片上可放置总共3个隔离器，从而实现盖玻片的均匀间距和可重复定位。（C）对每个盖玻片，在隔离器的开放区域内，于载玻片上滴加一滴荧光封片介质。（D）使用镊子从24孔板中取出盖玻片，并将其倒置放置在封片介质液滴上。（E）当盖玻片与载玻片之间存在气泡时，使用闭合的镊子轻轻敲击盖玻片以去除气泡。使用 BioRender 制作。请点击此处查看该图的放大版本。
- 96孔微孔板格式
- 使用连接至真空泵的多通道吸液适配器吸除各孔中的液体，然后向各孔中加入40 µL含1 mg/mL荧光标记的高分子量（70 kDa）葡聚糖的无血清培养基。将细胞在37 °C细胞培养箱中孵育30 min。
注意：根据所研究的条件，可选择不使用新鲜培养基，而重复使用条件培养基进行葡聚糖加载，因其可能含有分泌或添加的因子（如EGF或抑制剂化合物），这些因子可能影响细胞的大胞饮能力。 - 通过手动将微孔板倒置并轻弹，将孔内液体排入一个空的5 L烧杯中（图3A）。
- 将微孔板以轻微倾斜的角度垂直缓慢浸入盛有冰浴PBS的2 L烧杯中，对细胞进行清洗（图3B），随后再次将微孔板倒置轻弹，将孔内PBS排入5 L烧杯中（图3C）。重复该清洗步骤2次。
注意：与成像用微孔板结合较弱的细胞可能在该过程中脱落。如有需要，也可使用多通道吸液适配器进行吸液，或使用多通道移液器以更温和的方式用PBS洗涤。处理一块96孔微孔板大约需要2 L冰浴PBS。若需分析更多微孔板，请使用更大的烧杯，每增加一块微孔板额外添加1 L冰浴PBS，或根据需要更换新的冰浴PBS。 - 最后一次清洗后去除PBS，使用25 mL试剂储液槽和多通道移液器向每孔加入100 µL含3.7%甲醛的PBS溶液，在室温下固定细胞20 min（图3D）。
- 移除固定液，使用上述浸入并轻弹的方法用PBS洗涤细胞两次。每孔加入100 µL含2 µg/mL DAPI的PBS溶液对细胞核进行染色。
- 20 min后，使用上述步骤3.2.3中所述的浸入并轻弹方法，用冰浴PBS清洗细胞3次。将微孔板倒置轻拍于无尘纸上以去除残留PBS，然后使用25 mL试剂储液槽和多通道移液器向每孔加入100 µL新鲜PBS。可立即成像，或在4 °C避光保存最多一周。
注意：作为替代方案，可使用PBS中的甘油溶液（而非PBS）进行成像和储存，以更好地稳定荧光信号（图4A）。 - 成像前，让微孔板恢复至室温。用无尘纸将微孔板外表面擦干。
- 使用连接至真空泵的多通道吸液适配器吸除各孔中的液体，然后向各孔中加入40 µL含1 mg/mL荧光标记的高分子量（70 kDa）葡聚糖的无血清培养基。将细胞在37 °C细胞培养箱中孵育30 min。
图3：清洗96孔微孔板以进行固定。 (A) 通过手动轻弹，将微孔板中的培养基弃入5 L烧杯中。(B) 将微孔板垂直并稍倾斜地缓慢浸入盛有冰浴PBS的2 L烧杯中。(C) 通过手动轻弹，将微孔板中的PBS弃入5 L烧杯中。重复步骤B中的清洗操作两次。(D) 最后一次弃去微孔板中的PBS后，使用多通道移液器向各孔中加入100 µL 3.7%甲醛。图示使用BioRender制作。 请点击此处查看此图的放大版本。
4. 大胞饮泡的自动化成像
巨胞饮体的图像可使用标准荧光显微镜进行采集，方法如前所述19,20。然而，在评估多种不同细胞培养条件时，通过自动化手段可显著提高该过程的效率。通过细胞成像多功能酶标仪实现图像采集的自动化，不仅可以减少操作步骤、降低工作量，更重要的是能够以无偏倚的方式获取图像，从而提高数据的可重复性和可靠性。目前市面上有多种成像系统可供选择，不同仪器的操作方法各不相同。本文以 Cytation 5 为例说明图像采集过程。但以下方案可根据不同仪器的特点，参照下列指导原则进行相应调整：
- 创建一个自动化程序，使用40倍空气物镜在葡聚糖荧光染料（FITC/TMR）和DAPI的波长通道下采集图像。
注意：常用的巨胞饮抑制剂 EIPA 在 FITC 通道中具有自发荧光，尤其在先前被 DAPI 通道激发后更为明显。其他正在测试的化合物也可能表现出自发荧光。为避免此问题，可将图像采集顺序设置为先采集激发波长较高的通道（FITC/TMR），再采集 DAPI 通道，以避免此类现象发生。 - 使用预计具有最高大胞饮作用水平的样本优化曝光设置，以避免过度曝光，过度曝光可能导致信号饱和并丢失强度数据。使用能够快速且一致地定位样本的聚焦设置，以获得高质量图像。
- 在每个孔或盖玻片上获取多张图像，以涵盖样本的变异性并获得对样本的准确表征。
- 确定成像参数后，在整个实验中对每个样本均使用相同的设置。
- 使用 Cytation 5 和 Gen5 软件进行巨胞饮泡成像时，请遵循以下说明：
- 24孔板，带盖玻片格式
- 启动酶标仪，使用载玻片架将显微镜载玻片倒置插入。
- 打开酶标仪和成像软件，通过点击新建实验方案 实验方案，和 新建. 双击 步骤 并选择板型。
注意：如果软件中没有该型号的酶标板，请通过点击添加板型至软件中 系统 > 培养皿类型 > 添加培养板，并使用制造商提供的板尺寸。为方便使用，已提供包含两个显微镜载玻片、使用硅胶隔离器分隔的三个盖玻片的模板 补充文件 1. - 要访问成像设置，请选择 操作步骤 > 图像 > 倒置显微镜 并单击 好的. 使用40x PL FL相差物镜 宽视场 和 自动对焦像素合并.
- 对于第一个通道，选择与葡聚糖荧光团标记（GFP 或 RFP）对应的 LED 立方体。取消选中 自动曝光 并单击显微镜图标按钮以优化曝光设置。当确定合适的曝光设置后，单击 保存设置.
注意：使用预计大胞饮作用水平最高的样品调整曝光设置，以避免图像过曝，否则可能导致信号饱和并丢失强度数据。 - 使用DAPI LED滤块对第二个通道重复上一步骤。
- 为每个荧光通道设置自动对焦参数，选择 焦点选项取消选择默认的聚焦方法并使用 可选扫描的自动对焦 和 无需可选扫描的自动对焦 分别为葡聚糖-荧光团和DAPI通道。单击 好的 以保存设置。
注意：扫描距离可缩短至 200 µm 以及增量到 20 µm 以提高自动对焦效率。对于荧光较弱的样本，需要进行可选扫描，以实现充分的自动对焦。当分析大胞饮作用较低的条件时，通常会出现荧光较弱的情况，例如大胞饮作用被抑制或本就不具备大胞饮作用时。 - 使用 定义信标 可选择在盖玻片的不同区域自动采集图像。单击显微镜图标，并通过在图像窗口中单击并移动载物台至下一个区域来添加标记点。当已选择适当数量的区域后，移动至下一个盖玻片并重复该过程。最后，单击 保存设置.
注意：为了在样品中良好地呈现巨胞饮作用，需在盖玻片上均匀选择约20个信标（图4B使用的信标可减少，但部分图像可能因质量差异而在采集后被排除在图像分析之外，例如图像失焦、含有气泡或荧光斑点与污迹等情况。 - 完成成像设置的调整后，单击 好的. 为了对盖玻片进行成像，选择 创建新实验并立即读取 来自 实验方案工具当系统提示时，保存实验方案和实验。
- 24孔板，带盖玻片格式
图 4：图像采集条件的优化。（A）在经 EGF 处理的 AsPC-1 细胞中测定，随着甘油浓度的增加，TMR-葡聚糖的荧光强度增强。（B）使用带盖玻片的 24 孔板格式进行自动图像采集时，成像信标的示例坐标。柱状图显示了 5 次实验的平均相对荧光强度及标准误（SEM）。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）相对于 PBS 组进行统计学显著性分析。** p < 0.01；*** p < 0.001。 请点击此处查看该图的高清版本。
- 96孔微孔板格式
- 启动酶标仪并插入微孔板。
- 打开微孔板读板仪和成像软件，点击Protocols，然后点击Create New以创建新方案。双击Procedure并选择微孔板类型。
注：如果软件中没有所需的微孔板类型，可通过点击System > Plate Types > Add Plate，并根据制造商提供的板尺寸信息添加新的板类型。为方便使用，PerkinElmer公司CellCarrier-96 Ultra微孔板的模板已提供在补充文件2中。 - 要访问成像设置，请选择Actions > Image > Inverted Imager，然后点击OK。使用40倍PL FL相位物镜，选择Wide FOV和Autofocus Binning。
- 对于第一通道，选择与葡聚糖荧光标记物（GFP或RFP）相对应的LED滤光立方体。取消勾选Auto Exposure，然后点击显微镜图标按钮以优化曝光设置。当确定合适的曝光参数后，点击Save Settings。
注：在优化曝光设置过程中，可能会发生明显的荧光淬灭。这可能导致在拍摄新视野时出现过度曝光。因此，应通过检查一个尚未曝光的视野来验证曝光设置，确保在所选设置下信号不会饱和。用于优化曝光设置的孔不应纳入巨胞饮作用的定量分析中，因为在优化过程中荧光已因淬灭而减弱。应使用预计巨胞饮活性最高的样本调整曝光设置，以避免图像过曝，防止信号饱和和强度数据丢失。 - 对第二通道使用DAPI LED滤光立方体，重复上述步骤。
- 为每个荧光通道设置自动对焦参数，选择Focus Options。取消默认的对焦方法，使用Laser Autofocus。在确定用于最佳观察巨胞饮体和细胞核的焦平面后，采集参考扫描图像。点击OK保存设置。
注：可将扫描距离减少至400 µm，步进增量设为3 µm，以提高自动对焦效率。为确保激光自动对焦功能正常工作，成像前需清洁微孔板底部，并用无绒布擦拭干燥。激光自动对焦是一种更优的对焦方法，因其寻找焦平面所需时间极短。也可使用其他对焦方法，但由于孔中未添加抗淬灭剂，这些方法可能导致样本发生显著荧光淬灭，从而对数据采集产生负面影响。 - 将水平和垂直偏移设为零，在Single Image下选择Montage，设置No Overlap，并根据分析所需包含的细胞数量使用3 × 3图像。
注：根据细胞大小和密度，可增加或减少拍摄图像数量，以获得对整个样本巨胞饮作用的代表性评估。在不同条件下对AsPC-1或MIA PaCa-2细胞进行巨胞饮作用评估时，2 × 2或4 × 4图像框的数据解读无显著差异，但拍摄图像较少时，重复样本之间的变异可能增加（图5A,B）。增大或减小图像框尺寸会影响扫描整块板所需的时间。根据曝光时间的不同，使用3 × 3图像框完全扫描一块96孔板大约需要1–1.5小时。使用2 × 2和4 × 4图像框分别会使扫描时间减半或加倍。 - 完成成像设置调整后，点击OK。
- 要对微孔板进行成像，请从Protocol Tools中选择Create a New Experiment and Read Now。系统提示时保存方案和实验。
图 5：评估胰腺导管腺癌（PDAC）细胞巨胞饮作用的对照条件。 （A）AsPC-1 细胞在 100 ng/mL EGF 刺激 5 分钟或缺乏谷氨酰胺 24 小时后表现出巨胞饮作用。为进行图像采集，分别采集了 4 × 4、3 × 3、2 × 3 或 2 × 2 的图像拼接框，以确定图像数量对数据质量的影响。（B）MIA PaCa-2 细胞表现出组成性巨胞饮作用，该作用可被 75 µM EIPA 处理 30 分钟或 10 µM EHop-016 处理 2 小时所抑制。图像拼接框的采集方式同 A。比例尺 = 25 µm。柱状图显示一次实验（4 个重复）的平均相对巨胞饮指数及其标准差（SD）。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）相对于 +Q 或溶剂对照组进行统计学显著性检验。*** p < 0.001 请点击此处查看本图的放大版本。
5. 确定巨胞饮指数
“大胞饮指数”是指通过显微成像定量每细胞摄取的荧光葡聚糖来确定细胞大胞饮作用的程度19。为此，利用获取的图像，通过测量内化葡聚糖的总荧光强度或荧光阳性面积，以及通过DAPI染色确定的细胞总数，来计算葡聚糖的摄取量。该分析可使用开源图像处理与分析软件（如Cell Profiler或FIJI/ImageJ）完成，方法如前所述19,20。然而，当使用多功能酶标仪时，仪器配套软件可能包含可用于计算大胞饮指数的内置分析程序。在某些情况下，内置软件的分析流程对用户而言可能不够透明。因此，建议在早期阶段通过与非自动化分析方法（如Cell Profiler或FIJI/ImageJ）进行比较，对软件进行验证。本方案可通过遵循以下通用说明，适配于其他图像处理与分析软件工具：
- 对DAPI及相应的葡聚糖图像，通过应用适当的函数（通常称为滚动球函数）减去背景。调整设置，使背景噪声最小化，同时对DAPI和葡聚糖信号的减除效应尽可能小或无影响。
- 使用一个葡聚糖信号较强的视野，确定强度信号设置（通常称为阈值函数），以选择细胞核，并确定仅选择巨胞饮小体所需的最低强度信号设置。
- 对于葡聚糖图像，计算在所创建的巨胞饮小体选区内总的荧光强度，或使用该选区确定葡聚糖阳性区域的总面积。
- 对于DAPI图像，使用该选区确定图像中细胞核的数量，以反映存在的细胞数量。
- 为确定巨胞饮指数，将葡聚糖总荧光强度或面积除以DAPI测定的细胞数。
- 对所有获取的图像重复上述分析步骤，并在整个过程中使用相同的数值设置。
- 使用Gen5软件确定巨胞饮指数时，请遵循以下说明：
注意：内置分析流程已通过验证，与Fiji/ImageJ的计算结果相比无显著差异（图6A）。- 成像完成后，选择一个巨胞饮水平较高的图像。去除背景信号，点击 处理 （补充图1A），选择 图像预处理 选项。
- 对于葡聚糖通道，取消选择 自动 ，使用5 µm的滚动球直径，优先选择精细结果，并以1个循环对图像进行平滑处理。
- 对于DAPI通道，使用 自动 预处理并设置1个平滑循环。点击“确定”并将图像预处理步骤添加到协议中；点击 添加步骤。接着，在 图像 下拉菜单下选择已处理的图像（补充图1B），点击 分析 按钮（补充图1C）。
- 在 分析设置 下，将 类型 设置为 细胞分析。选择DAPI通道，点击 选项 （补充图2A）。
- 对于初级掩膜，使用已处理的DAPI图像创建掩膜以选择单个细胞核。选择暗背景和 自动 选项。此外，确定哪些设置可实现单个细胞核的掩膜选择，完成后点击 应用 按钮，以确认掩膜是否正确应用。
注意：启用 分割接触对象 和 填充掩膜孔洞 选项可能更有利于选择单个细胞核。最小和最大对象尺寸需根据细胞系进行调整，通常设置在5–40 µm范围内。初级边缘对象 可包含在内，并应对整幅图像进行分析。可通过滑块调整掩膜选择以匹配信号强度。 - 接下来，应用次级掩膜以优化选择巨胞饮荧光点的设置。使用 在次级掩膜内测量 功能，并根据细胞大小将初级掩膜扩展40 µm。
- 使用 阈值 功能和 在掩膜内设阈值 方法选择葡聚糖阳性区域。点击 应用 以确认设置是否正确应用。
注意：为确定阈值，使用 查看线剖面 工具（补充图2B），在葡聚糖阳性区域上绘制一条线（补充图2C）。利用测得的强度确定最佳设置，以创建仅选择巨胞饮小体并排除背景信号的掩膜（补充图2D）。 - 在创建合适的掩膜以选择细胞核和巨胞饮小体后，点击 计算指标 选项卡，选择 选择或创建感兴趣的对象级指标。
- 移除所有现有指标，添加用于次级掩膜分析的 积分 和 面积 指标。点击 确定 ，并为新指标选择 计算 和 显示 。完成后，点击 确定 并选择 添加步骤 ，将分析和计算添加到协议中。
- 保存最终协议以供将来使用，点击 文件 和 另存为协议。
- 数据分析完成后，选择感兴趣的指标并导出数据以确定巨胞饮指数。巨胞饮指数的计算方法如下：
每细胞葡聚糖荧光强度 = Object Int_2[Dextran fluorophore]
每细胞葡聚糖面积 = Object Area_2[Dextran fluorophore]
注意：对于24孔板带盖玻片的格式，指标反映每张图像平均巨胞饮指数的均值。或者，可通过将所有图像的“面积”或“积分”总和除以总“细胞计数”来手动计算整个样本的巨胞饮指数。在大多数情况下，这两种方法在计算巨胞饮指数时差异极小。对于96孔微孔板格式，巨胞饮指数按整个样本的平均值计算。 - 保存用于成像及后续自动分析的协议。在未来的实验中，若使用相同的荧光染料，可重复使用该协议。
注意：当使用激光自动对焦功能时，若需分析不同的细胞系，则必须重新获取参考扫描，因为细胞核和巨胞饮小体可能位于不同的焦平面。每次使用先前确定的协议进行新实验时，必须优化该实验的曝光设置。
6. 添加处理因素
在实验方案的任何阶段均可引入细胞处理（小分子、生物制剂、生长因子、代谢物等），具体处理时间取决于研究的目标和目的。
- 按照第2节中的步骤准备细胞。
- 在添加待测处理因素之前，用无血清培养基将处理因素及其相应的对照配制为最终浓度两倍的溶液。配制的体积应等于待检测的重复孔数量所需的总体积。
注意：鉴于分泌因子在调控细胞功能中的作用，建议将待测处理因素稀释于条件培养基中。为此，在按照第2节所述方法制备细胞时，可额外接种若干培养皿（如6 cm或10 cm细胞培养皿），以收集条件培养基用于处理溶液的配制。 - 无需更换孔内原有培养基，直接向每孔加入一个孔体积的处理溶液。轻摇培养板以确保充分混匀。将细胞置于所需条件下孵育一定时间。
- 继续进行第3节的操作。
注意：在加入葡聚糖时，若使用新鲜培养基会清除已添加的处理因素，可能影响巨胞饮水平。因此，建议直接将葡聚糖加入孔中而不进行吸除操作，或选择重新添加处理因素，或使用条件培养基配制葡聚糖溶液。
图 6：对巨胞饮抑制剂进行剂量-反应曲线分析。 在新细胞系中测试已知巨胞饮抑制剂时获得的示例数据。PATU8998T 细胞用于 96 孔微孔板格式，并分别用指定浓度的（A）EHop-016 和（B）EIPA 处理 2 小时 30 分钟。通过 Gen5 软件或 ImageJ 进行图像分析所获得结果的比较显示，两种方法之间无显著差异，如（A）中的 ns 所示。比例尺 = 25 µm。柱状图显示单次实验（n = 4）的平均值及标准差（SD）。统计学显著性通过单因素或双因素方差分析（ANOVA）确定，并与未处理组进行比较。* p < 0.05；*** p < 0.001。 请点击此处查看该图的高清版本。
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结果
若严格按照上述方案的步骤和调整进行操作，最终的实验结果应能提供有关所研究的细胞培养条件或抑制剂是否诱导或抑制目标细胞系巨胞饮作用的信息。为了增强这些发现的可靠性，设置对照条件有助于对结果进行严格评估，以确定实验是否成功完成。巨胞饮诱导对照可提供关于巨胞饮相对水平的信息。为此，最常用的配体是表皮生长因子（EGF）13。在AsPC-1胰腺导管腺癌（PDAC）细胞中，在加入葡聚糖前添加100 ng/mL EGF处理5分钟，可激活巨胞饮作用（图5A）。此外，通过将细胞在无谷氨酰胺培养基中培养16–24小时，可诱导自分泌EGF介导的巨胞饮激活（图5A）。根据细胞类型和现有文献，也可采用其他诱导剂，例如PDGF或Wnt3A10,11,12。并非所有细胞的行为都相同，携带KRAS突变...
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讨论
实验质量和数据采集结果在很大程度上取决于试剂的质量、仪器参数的优化以及盖玻片和微孔板的清洁程度。最终结果应在重复样本之间表现出尽可能小的差异；然而，生物学变异可能自然发生，或由多种因素引起。细胞密度可能影响细胞对大胞饮诱导剂或抑制剂的反应程度。因此，严格遵循本方案中建议的80%汇合度至关重要。此外，微孔板制造商已有明确说明，在96孔微孔板中会发生培养基蒸发现象。其中，边缘孔的蒸发程度高于中心孔，从而可能影响大胞饮作用。因此，可选择不在分析中纳入边缘孔，而将这些孔中加入PBS，形成“缓冲屏障”，以减少中心孔的过度蒸发。
强烈建议对每种条件下的图像进行目视检查，以确定图像采集是否成功完成。可在采集第一组条件时即进行此项检查，以确认所用设置是否正确，并在必要时及时干预。可能出现的具体问题包括：图像过曝（图7A）、图像失焦（图7B）、图像中出现荧光葡聚糖斑块（图7C）或残留物（
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披露
C.C. 是一项已授权专利的发明人，该专利名为“与巨胞饮作用相关的癌症诊断、治疗及药物发现”，专利号：9,983,194。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助（R01CA207189，R21CA243701）支持，授予C.C.。KMO.G. 获得了加州烟草相关疾病研究计划博士后奖学金（T30FT0952）资助。BioTek Cytation 5 属于桑福德-伯纳姆-普雷比斯细胞成像中心的一部分，该中心获得了国家癌症研究所癌症中心支持基金（P30 CA030199）的财政支持。图1-3使用BioRender绘制。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶 | Corning | 25053CI | HBSS 中含 0.1% EDTA，不含钙、镁和碳酸氢钠 |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 10 cm 组织培养皿 | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
| 15 mL 离心管 | Fisherbrand | 07-200-886 | |
| 2 L 烧杯 | Fisherbrand | 02-591-33 | |
| 24 孔组织培养板 | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
| 25 mL 试剂储液槽 | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 mL 烧杯 | Fisherbrand | 02-591-30 | |
| 6 cm 组织培养皿 | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
| 8 通道吸液适配器 | Integra Biosciences | 155503 | |
| 适用于标准吸头的 8 通道吸液适配器 | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% 乙醇 | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| 无氨玻璃清洁剂 | Sparkle | FUN20500CT | |
| 黑色 96 孔高内涵筛选微孔板 | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| 棉签 | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| 盖玻片 | Fisherbrand | 12-545-80 | 直径 12 mm |
| Cytation 5 细胞成像多功能读板仪 | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| 70 kDa 右旋糖酐-FITC | Life Technologies | D1822 | 可被赖氨酸交联固定 |
| 70 kDa 右旋糖酐-TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | 不含钙和镁 |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| 甲醛，37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS 试剂级 |
| 甘油 | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
| 硬化型荧光封片介质 | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| 盐酸 (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | 经认证的 ACS Plus，36.5%–38.0% |
| 无尘擦拭纸 | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| 显微镜载玻片 | Fisherbrand | 12-544-1 | 优质普通玻璃 |
| 多通道移液器 | Gilson | FA10013 | 8 通道，0.5–10 µL |
| 多通道移液器 | Gilson | FA10012 | 12 通道，20–200 µL |
| 多通道移液器 | Gilson | FA10011 | 8 通道，20–200 µL |
| Parafilm M 封口膜 | Pechiney | PM996 | |
| 塑料保鲜膜 | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| 硅胶隔离器 | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 内径 13 mm × 深度 0.8 mm，25 mm × 25 mm |
| 载玻片适配器 | Biotek | 1220548 | |
| 洗瓶 | Fisherbrand | FB0340922C |
参考文献
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