方法文章

使用杆状病毒-昆虫细胞培养系统生产和纯化腺相关病毒（AAV）2载体的工艺开发

DOI：

10.3791/62829

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2022年1月13日

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1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

本文内容

摘要

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在该协议中，通过将 Spodoptera frugiperda（Sf9） 昆虫细胞与杆状病毒（BV）-AAV2-绿色荧光蛋白（GFP）或治疗基因和BV-AAV2-rep-cap感染的Sf9细胞在悬浮培养物中共同培养来产生AAV2载体。使用洗涤剂从细胞中释放AAV颗粒，澄清，通过亲和柱色谱纯化，并通过切向流过滤浓缩。

摘要

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腺相关病毒（AAV）是基因治疗应用的有前途的载体。在这里，AAV2载体是通过在无血清悬浮培养物中共培养 Spodoptera frugiperda（Sf9） 细胞与感染杆状病毒（BV）-AAV2-GFP（或治疗基因）和BV-AAV2-rep-cap的Sf9细胞共培养产生的。细胞在轨道振荡器或Wave生物反应器的烧瓶中培养。为了释放AAV颗粒，将生产者细胞裂解在含有洗涤剂的缓冲液中，随后通过低速离心和过滤进行澄清。使用AVB Sepharose柱色谱法从细胞裂解物中纯化AAV颗粒，其结合AAV颗粒。用PBS洗涤结合的颗粒以除去污染物，并使用柠檬酸钠缓冲液在pH 3.0下从树脂中洗脱。酸性洗脱液用碱性Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中和，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释，并用切向流动过滤（TFF）进一步浓缩。该协议描述了小规模的临床前载体生产与用于人类基因治疗应用的大规模临床级AAV制造相容。

引言

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腺相关病毒（AAV）是非包膜的人类细小病毒，含有4.6 kb的单链DNA。对于基因治疗应用，AAV载体比其他病毒载体具有几个优点1，2，3，4。AAV自然是复制无能的，因此，需要帮助病毒和主机进行复制。AAV不会引起任何疾病，并且在受感染的宿主3，5中具有低免疫原性。AAV可以感染静止和主动分裂的细胞，并且可以持续作为表观体而不整合到宿主细胞的基因组中（AAV很少整合到宿主基因组中）1，3。这些特性使AAV成为基因治疗应用的理想工具。

为了生成AAV基因转移载体，在两个内部末端重复序列（ITR）之间克隆转基因盒，包括治疗基因，这两个重复序列通常来自AAV血清型2。从5'ITR到3'ITR的最大尺寸，包括转基因序列，为4.6 kb6。不同的衣壳可能具有不同的细胞或组织向性。因此，应根据拟用AAV载体靶向的组织或细胞类型选择衣壳

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方案

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有关概述该协议的插图，请参见图 1。

1. 杆状病毒感染的TIPS细胞的产生

  1. 解冻一小瓶Sf9细胞，并立即将其接种在50 mL昆虫细胞培养基中。在轨道振荡器培养箱中以125rpm和28°C在圆底烧瓶中培养Sf9细胞，带有松散的盖子以交换空气8，9。在含有200mL培养基的1L烧瓶中繁殖细胞，以获得足够的细胞用于TIPS细胞的产生。
  2. 在两个烧瓶中以2×106 个细胞/ mL加入50 mL Sf9细胞:用0.5mL杆状病毒（BV）-AAV2-GFP（或治疗基因）感染一个Sf9细胞瓶，另一个用0.5mL BV-AAV2-rep-cap感染另一个细胞瓶。
    注:AAV载体质粒由Robert M. Kotin博士（NIH）慷慨提供。从Bacmid DNA（Bac-to-Bac系统）中产生杆状病毒已经在8，9中进行了描述。杆状病毒在传代过程中的稳定性是rAAV放大生产的关键问题。最好使用杆状病毒的较低通道数（最多为4号通道）。在TIPS细胞生产过程中，通过使用流式细胞术检查杆状病毒感染效率，根据经验确定杆状病毒上清液的最佳体积（

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结果

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这里展示了使用Sf9昆虫细胞系统生产和纯化AAV载体的工艺开发的代表性结果。该方法包括将Sf9细胞与杆状病毒感染的TIPS细胞共培养，用生长培养基喂养细胞，收获和裂解生产细胞以释放AAV颗粒，用核酸酶处理澄清细胞裂解物，离心和过滤，使用AVB Sepharose亲和色谱法纯化AAV，并用TFF浓缩（图1）。

TIPS细胞通过感染BV-AAV2-GFP或治疗基因和BV-AAV2-rep-cap分别进入Sf9细胞而产生。由于多轮感染，大多数Sf9细胞在3-4天内感染杆状病毒，由杆状病毒糖蛋白gp64表达（图2）和细胞直径增加（图3）证明。TIPS细胞在感染后3-4天收获并冷冻保存。Sf9细胞与在培养基中分泌杆状病毒颗粒的TIPS细胞共培养，这些颗粒感染幼稚的Sf9细胞。杆状病毒具有复制能力;因此，感染细胞的数量通过多次圆形感染而迅速增加，新产生的杆状病毒颗粒被分泌到培养基<.......

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讨论

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该协议中用于AAV载体生产，纯化和浓缩过程开发的参数可应用于基因治疗应用的AAV载体的小型和大规模制造。整个上游和下游过程可以在与当前良好生产规范（cGMP）兼容的封闭系统中执行。Sf9-杆状病毒系统的主要优点是可扩展性，能够以可承受的成本进行大规模的GMP级AAV生产。该系统不需要昂贵的质粒和转染试剂，而使用HEK293细胞生产AAV则需要这些质粒和转染试剂。据报道，HEK293细胞和Sf9细胞都产生相似质量的AAV载体（Eric D. Horowitz，ASGCT 2018，摘要#100）。主要挑战是，该系统需要产生杆状病毒和TIPS细胞，这需要大量的时间和精力。

在该协议中，使用两种类型的TIPS细胞（TwoBac系统）:一个含有具有AAV基因转移盒的杆状病毒的TIPS细胞和另一个含有AAV-rep-cap的TIPS细胞。OneBac系统2、16、17可以在单个杆状病毒中产生含有AAV基因转.......

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披露

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作者声明没有利益冲突。

致谢

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我们要感谢Robert M. Kotin博士（国家心脏，血液和肺部研究所，NIH）慷慨地为我们提供了AAV质粒，并感谢Danielle Steele和Rebecca Ernst（辛辛那提儿童医院）的技术援助。这项工作得到了辛辛那提儿童研究基金会（Cincinnati Children's Research Foundation）到M.N.的启动基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 N 氢氧化钠Sigma-Aldrich1.09137用于 Akta Avant 清洁
2 L 培养瓶ThermoFisher Scientific431281培养瓶
50 ml 锥形管ThermoFisher Scientific14-959-49A用于收集上清液
24 孔板ThermoFisher Scientific07-200-80贴壁细胞培养板
250 mL 培养瓶ThermoFisher Scientific238071培养瓶
配备 Unicorn 软件的 Akta Avant 150Cytiva28976337层析系统
AVB 琼脂糖凝胶高性能Cytiva28411210层析培养基
杆状病毒-AAV-2 GFP内部非目录AAV 转移载体
杆状病毒-AAV-2 rep-cap内部非目录AAV 包装载体
核酸酶Sigma-AldrichE1014DNA 和 RNA
封闭缓冲液Santa Cruz Biotechnologies516214封闭以防止非特异性抗体与细胞结合
细胞裂解缓冲液内部非目录项目20 mM Tris-HCl （pH 8.0），150 mM NaCl，0.5 % TitronX-100
细胞袋，2 L 和 10 LCytiva28937662生物反应器袋
清洁缓冲液内部非目录项目100 mM 柠檬酸 （pH 2.1） 
冻存管Thomas Scientific1222C24用于冻存
DMEMSigma-AldrichD6429细胞系生长培养基
洗脱缓冲液内部非目录项目50 mM 柠檬酸钠缓冲液 （pH 3.0）
乙醇Sigma-AldrichE7073用于层析消毒和储存
过滤装置 颇尔公司12941膜过滤器
HT1080 细胞系ATCCCCL-121成纤维细胞系
HyClone™SFX-昆虫培养基CytivaSH30278.02无血清昆虫细胞生长培养基
蠕动泵颇尔公司非目录项目TFF 泵
MaxQ 8000 轨道摇床培养箱 ThermoFisher Scientific非目录项用于悬浮培养的摇床
显微镜Nikon非目录项细胞监测和计数 
小鼠抗杆状病毒 gp64 PE 抗体Santa Cruz Biotechnologies65498 PE监测 Sf9 细胞中的杆状病毒感染
氧气罐Praxair非目录项目40 % Sf9 细胞生长需要氧气供应
PBSThermoFisher Scientific20012027洗涤缓冲液
银染试剂盒ThermoFisher ScientificLC6100染色 AAV衣壳蛋白
Sf9 细胞ThermoFisher Scientific11496-015昆虫细胞
Steile water内部非目录项目用于 Akta Avant 清洁
台式离心机ThermoFisher Scientific75253839/433607用于杆状病毒上清液
的澄清 切向流过滤 （TFF） 滤筒颇尔公司OA100C12TFF 小柱，用于浓缩 AAV
Tris-HCl，pH 8.0ThermoFisher15568025碱性缓冲液，用于中和洗脱的 AAV
WAVE 生物反应器系统 20/50Cytiva28-9378-00生物反应器
用于悬浮培养的 用于悬浮培养的 降解

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
  2. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes....

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AAV ProductionBaculovirus Insect SystemSf9 CellsAAV PurificationAVB Sepharose ChromatographyTangential Flow FiltrationCell Lysis BufferFlow CytometryGene Therapy VectorSuspension Cell Culture

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