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方法文章

利用杆状病毒-昆虫细胞培养系统进行腺相关病毒（AAV）2载体的生产与纯化工艺开发

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DOI：

10.3791/62829

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2022年1月13日

 ,  ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

本文内容

摘要

在本方案中，通过将Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫细胞与携带AAV2-绿色荧光蛋白（GFP）或治疗基因的杆状病毒（BV）-AAV2-GFP（或治疗基因）以及携带BV-AAV2-rep-cap的Sf9细胞在悬浮培养中共培养，以产生AAV2载体。随后使用去污剂从细胞中释放AAV颗粒，经澄清后，通过亲和柱色谱法纯化，并采用切向流过滤进行浓缩。

摘要

腺相关病毒（AAV）是基因治疗应用中有前景的载体。本文中，通过将Spodoptera frugiperda（Sf9）细胞与感染了携带GFP（或治疗基因）的杆状病毒（BV）-AAV2-GFP以及BV-AAV2-rep-cap的Sf9细胞在无血清悬浮培养条件下共培养，来生产AAV2载体。细胞可在摇床或Wave生物反应器中的培养瓶中进行培养。为释放AAV颗粒，使用含去垢剂的缓冲液裂解生产细胞，随后通过低速离心和过滤澄清裂解液。利用AVB Sepharose柱层析从细胞裂解物中纯化AAV颗粒，该介质可特异性结合AAV颗粒。结合的颗粒用PBS洗涤以去除杂质，并使用pH为3.0的柠檬酸钠缓冲液从树脂上洗脱。酸性洗脱液用碱性Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中和后，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，并通过切向流过滤（TFF）进一步浓缩。本方案描述了一种适用于临床前小规模AAV载体生产的流程，且可扩展至用于人类基因治疗的大规模临床级AAV生产。

引言

腺相关病毒（AAV）是一类无包膜的人类细小病毒，含有约4.6 kb的单链DNA。在基因治疗应用中，AAV载体相较于其他病毒载体具有多种优势1,2,3,4。AAV在自然界中不具备复制能力，因此需要辅助病毒和宿主细胞机制才能完成复制。AAV不会引起任何疾病，并且在感染宿主中具有较低的免疫原性3,5。AAV能够感染静止期和活跃分裂的细胞，并可在宿主细胞中以附加体形式长期存在，而无需整合到宿主基因组中（AAV极少整合至宿主基因组）1,3。这些特性使AAV成为基因治疗应用中理想的工具。

为了构建AAV基因转移载体，需将包含治疗性基因的转基因表达盒克隆至两个内部末端重复序列（ITRs）之间，这些ITRs通常来源于AAV2血清型。从5' ITR到3' ITR的总长度（包括转基因序列）最大为4.6 kb6。不同的衣壳蛋白可能具有不同的细胞或组织嗜性，因此应根据AAV载体拟靶向的组织或细胞类型来选择合适的衣壳7。

重组腺相关病毒（AAV）载体通常在哺乳动物细胞系中生产，例如通过瞬时转染人胚胎肾细胞HEK293，共转染AAV基因转移载体、AAV rep-cap 载体以及辅助病毒质粒2,3。然而，使用贴壁生长的HEK293细胞进行瞬时转染在大规模AAV生产中存在若干局限性。首先，需要大量细胞堆栈或滚瓶；其次，需要高质量的质粒DNA和转染试剂，这会增加生产成本；最后，在使用贴壁HEK293细胞时，通常需要添加血清以实现最佳产量，从而增加了下游纯化的复杂性1,2,3。另一种AAV生产方法是利用昆虫细胞系——草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf9细胞，并结合一种名为重组苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（recombinant Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV 或杆状病毒）的昆虫病毒8,9,10。Sf9细胞可在无血清悬浮培养体系中生长，易于放大，且适用于大规模符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的生产流程，该体系无需使用质粒或转染试剂。此外，采用Sf9-杆状病毒系统生产AAV的成本低于在HEK293细胞中通过质粒瞬时转染的方法11。

最初使用杆状病毒-Sf9细胞的rAAV生产系统需要三种杆状病毒：一种含有基因转移盒的杆状病毒，第二种含有rep基因的杆状病毒，第三种含有血清型特异性衣壳基因的杆状病毒12,13。然而，含有rep构建体的杆状病毒在多次传代过程中遗传不稳定，这阻碍了杆状病毒的大规模扩增，从而限制了AAV的大规模生产。为解决这一问题，开发了一种新型rAAV载体系统，该系统仅包含两种杆状病毒（TwoBac）：一种杆状病毒携带AAV基因转移盒，另一种杆状病毒同时携带AAV的rep和cap基因。该系统比原始系统遗传更稳定，且因使用TwoBac而非三种杆状病毒，使rAAV的生产更为便捷14,15。OneBac系统则将AAV基因转移盒和rep-cap基因整合于单一杆状病毒中，仅需一种杆状病毒即可生产rAAV，相比TwoBac或ThreeBac系统更加简便2,16,17。在本研究中，采用TwoBac系统进行优化。

杆状病毒系统在AAV生产中也存在局限性：杆状病毒颗粒在无血清培养基中长期储存时不稳定11，且若杆状病毒滴度较低，则需要使用大量上清液，这可能在AAV生产过程中对Sf9细胞的生长产生毒性（个人观察）。采用无需滴定的感染细胞保存与扩增（TIPS）细胞，即杆状病毒感染的昆虫细胞（BIIC），为AAV生产提供了良好选择，该方法预先制备并冻存杆状病毒感染的Sf9细胞，随后用于感染新鲜的Sf9细胞。另一优势在于，杆状病毒（BV）在Sf9细胞中经冷冻保存后稳定性提高10,11。

为实现AAV的生产，需制备两种类型的TIPS细胞：第一种通过用BV-AAV2-GFP或治疗性基因感染Sf9细胞获得，第二种通过用BV-AAV2-rep-cap感染Sf9细胞获得。TIPS细胞以小份、即用型分装形式进行冷冻保存。AAV载体在无血清悬浮培养体系中生产，将可产生杆状病毒的TIPS细胞与新鲜的Sf9细胞共同培养，培养容器为置于轨道摇床或Wave生物反应器中的培养瓶。Sf9细胞被携带AAV2-GFP载体和rep-cap序列的杆状病毒感染，从而生成AAV。感染后四至五天，当AAV产量达到最高时，使用去垢剂裂解生产细胞以释放AAV颗粒。细胞裂解液随后通过低速离心和过滤进行澄清。AAV颗粒通过AVB Sepharose柱层析从裂解液中纯化。最后，采用切向流过滤（TFF）对AAV载体进行浓缩。本方案描述了小规模AAV的生产流程，适用于科研及临床前研究。然而，该方法具有可扩展性，且适用于基因治疗应用中临床级AAV载体的生产。

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方案

有关该方案的示意图总结，请参见图1。

1. 杆状病毒感染的TIPS细胞的制备

  1. 解冻一管 Sf9 细胞，并立即将其接种于 50 mL 昆虫细胞培养基中。将 Sf9 细胞置于圆底烧瓶中，在 125 rpm、28 °C 条件下的轨道摇床培养箱中培养，烧瓶盖松开以利于空气交换8,9。在含有 200 mL 培养基的 1 L 烧瓶中扩增细胞，以获得足够数量的细胞用于 TIPS 细胞制备。
  2. 将浓度为 2 × 106 个细胞/mL 的 Sf9 细胞各 50 mL 分别加入两个烧瓶中：其中一个烧瓶接种 0.5 mL 杆状病毒（BV）-AAV2-GFP（或治疗性基因），另一个烧瓶接种 0.5 mL BV-AAV2-rep-cap。
    注：AAV 载体质粒由美国国立卫生研究院（NIH）Robert M. Kotin 博士慷慨提供。基于杆状病毒基因组 DNA（Bac-to-Bac 系统）的杆状病毒制备方法已有先前报道8,9。杆状病毒在传代过程中的稳定性是 rAAV 规模化生产中的关键问题，建议使用较低传代次数的杆状病毒（传代次数不超过 4 次）。在 TIPS 细胞制备过程中，通过流式细胞术检测杆状病毒感染效率，经验性地确定杆状病毒上清液的最佳用量（图 2）。
  3. 通过以下步骤，在感染后 3–4 天检测杆状病毒感染情况，即对感染的 Sf9 细胞中的杆状病毒 gp64 进行染色。
    1. 取 2 × 105 个 Sf9 细胞（包括未感染和杆状病毒感染的细胞），加入含荧光染料的鼠抗杆状病毒 gp64 抗体（1:200 稀释，0.5 µg）和 100 µL 封闭缓冲液，在室温下孵育 30 分钟进行染色。
    2. 用 1 mL PBS 洗涤细胞以去除未结合的抗体，然后将染色后的细胞重悬于含 0.5% 牛血清白蛋白的 300 µL PBS 中。
    3. 使用流式细胞术分析细胞表面杆状病毒 gp64 的表达（图 2）。
      注：流式细胞术的数据采集与分析门控策略需通过实验经验确定。共采集 10,000 个单个活细胞。Sf9 细胞表面 gp64 的表达表明已成功感染杆状病毒。感染后 3–4 天，大多数 Sf9 细胞均表现出 gp64 表达，表明已被杆状病毒感染（图 2）。
  4. 当细胞活力达 80%–90%，且细胞直径增大时（图 3），收集细胞，并将 1 × 107 个细胞用含 10% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜的 1 mL 昆虫细胞培养基重悬，置于程序降温冻存盒中于 -80 °C 冻存。次日，将含有 TIPS 细胞的冻存管转移至液氮罐中进行长期保存。
    ​注：细胞培养操作应在生物安全二级（BSL-2）条件下，于生物安全柜中按照标准无菌实验技术进行。

2. AAV 载体的制备

  1. 第1天：将Sf9细胞与感染杆状病毒的TIPS细胞共培养
    1. 在摇床培养箱中，于28 °C条件下，在多个含有400 mL昆虫细胞培养基的2 L培养瓶中，以1 × 106 个细胞/mL的密度培养未处理的Sf9细胞，用于AAV的生产。培养3–4天后，细胞密度增至5 × 106–6 × 106 个细胞/mL。
      注：CO2 和湿度对Sf9细胞的生长并非关键因素。
    2. 按以下方法将Sf9细胞接种至摇瓶或生物反应器中。
      1. 在轨道摇床培养箱中进行摇瓶AAV生产：使用移液器或蠕动泵，将400 mL、浓度为2 × 106 个细胞/mL的Sf9细胞培养物无菌接种至2 L培养瓶中。将轨道摇床设置为125 rpm、28 °C。
        ​注 根据AAV生产的规模选择使用蠕动泵或标准移液器。
      2. 在生物反应器中进行AAV生产：使用蠕动泵将1 L、浓度为2 × 106 个细胞/mL的Sf9细胞培养物无菌接种至10 L生物反应器袋中。将反应袋装入生物反应器系统，在28 °C下进行培养。向生物反应器袋中通入40%氧气，压力为0.1 psi。将生物反应器系统设置为20°倾斜角，并以25 rpm振荡反应袋。
    3. 解冻一管BV-AAV2-GFP（或治疗性基因）和一管BV-AAV2-rep-cap TIPS细胞。用20 mL昆虫细胞培养基稀释细胞，并使用台盼蓝染色法进行细胞活力计数。将两种TIPS细胞以1:10,000的比例接种至已在摇瓶或生物反应器中培养的未处理Sf9细胞中。
      ​注：由于冷冻保存的影响，TIPS细胞的存活率降低，使用台盼蓝染色测定细胞活力时，复苏率约为50%。在大规模生产rAAV前，应通过预实验经验性地确定TIPS细胞与未处理Sf9细胞的最佳接种比例。
  2. 第2天：培养监测
    1. 无菌采集1 mL Sf9细胞培养物，用台盼蓝染色分析细胞数量、活力和形态。
  3. 第3天：培养监测与补料
    1. 无菌采集1 mL Sf9细胞培养物，分析细胞数量、活力和形态。按照步骤1.3所述方法对Sf9细胞染色后，检查杆状病毒感染状态。
      注：细胞直径增大和出现细胞病变效应是杆状病毒感染的标志。细胞直径的增加早于细胞活力的下降，这些参数用于确定AAV生产过程中的细胞收获时间。最佳时间点需通过经验确定。
    2. 以1:5的比例无菌向Sf9细胞培养物中补充新鲜昆虫细胞培养基。
  4. 第4天：培养监测
    1. 无菌采集1 mL Sf9细胞培养物，分析细胞数量、活力和形态。断开生物反应器袋的氧气供应。
  5. 第5天：培养监测与收获
    1. 无菌采集1 mL Sf9细胞培养物，分析细胞数量、活力和形态。当Sf9细胞活力下降至约50%时，收获培养液和细胞（图4）。
    2. 在4 °C条件下，以2100 × g 离心15分钟。收集上清液和细胞沉淀，并于-80 °C保存。

3. 细胞裂解及AAV释放

  1. 解冻AAV生产细胞沉淀。向细胞沉淀中加入100 mL细胞裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM氯化钠，0.5% Triton-X-100），剧烈混匀，并在室温下孵育30分钟，以释放AAV颗粒。
  2. 在4 °C下以2100 × g离心30分钟，将细胞裂解液转移至新容器中。解冻后，将细胞裂解液与细胞培养上清液混合。
  3. 向细胞裂解液中加入20 U/mL核酸酶和10 mM MgCl2，以消化DNA和RNA。在37 °C下孵育2–4小时。
  4. 使用泵将裂解液通过0.8 µm和0.2 µm聚醚砜双级过滤系统进行过滤。
  5. 将澄清的细胞裂解液在4 °C下保存过夜，或立即进行AAV纯化。

4. 使用亲和柱层析系统纯化 AAV 载体

  1. 以50 mL/min的流速，依次用无菌水、1 N氢氧化钠、水和磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）冲洗色谱仪的样品管路和缓冲液管路。
  2. 将AVB Sepharose柱（10.0 mL）安装至色谱系统中，并以5 mL/min的流速运行100 mL PBS。
    注意：根据AAV生产的规模，可使用体积更小或更大的AVB Sepharose柱，并按照色谱柱或树脂生产商的建议设置流速（参见材料表）。
  3. 为收集含有AAV颗粒的柱穿透液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的各组分，在色谱仪的组分收集器插槽中插入收集管。
  4. 以5.0 mL/min的流速用PBS对色谱柱进行平衡。
  5. 使用配备样品泵的色谱仪，将含有AAV颗粒的过滤后细胞裂解液上样至 色谱柱中。以每分钟3.0 mL的流速运行样品。
  6. 以3.0 mL/min的流速将PBS通过AVB Sepharose柱，直至紫外（UV）吸收曲线（280 nm）恢复至基线并保持稳定。
  7. 以3.0 mL/min的流速用50 mM柠檬酸钠（pH 3.0）缓冲液从色谱柱中洗脱AAV颗粒（图5）。
    注意：当AAV颗粒从树脂上解离并通过紫外检测器时，可在色谱图上观察到蛋白质的洗脱峰。
  8. 立即向含有AAV的上清液中加入其体积五分之一的500 mM Tris-HCl（pH 8.0），使上清液的pH升至约5.5，以防止酸性洗脱缓冲液导致的pH介导降解。随后，再用PBS将AAV上清液稀释10倍，以完全中和pH。
    注意：中和重组AAV（rAAV）溶液后，pH值约为5.5。中和AAV后，用PBS（pH 7.4）将rAAV溶液稀释10倍，使AAV处于生理缓冲液环境中。
  9. 分别保存每次运行的1 mL柱穿透液样品、洗涤缓冲液以及100 µL洗脱后的AAV上清液，用于通过感染靶细胞来评估AAV的存在。
  10. 以5.0 mL/min的流速，用100 mL 100 mM柠檬酸（pH 2.1）和100 mL PBS（pH 7.4）清洗AVB Sepharose柱。再以5.0 mL/min的流速用20%乙醇冲洗色谱柱，并于4 °C保存。
  11. 将色谱仪管路置于离线状态，按第4.1节所述方法清洗管路。最后，以50.0 mL/min的流速用200 mL 20%乙醇冲洗整个色谱系统，并将系统保存在20%乙醇中。

5. 使用切向流过滤（TFF）对 AAV 载体进行浓缩和透析过滤

  1. 使用配备聚砜膜 cartridge（100 kDa 分子量截断值）的切向流过滤（TFF）系统对腺相关病毒（AAV）进行浓缩。
  2. 用 200 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）平衡 TFF 模块，持续 10 分钟。
  3. 通过调节泵的流速将 AAV 样品 加载至系统中，直至样品体积浓缩至目标体积，同时保持跨膜压力在 2–3 psi。
  4. 使用本研究中所用的 100 mL PBS 对截留物进行透析过滤，或根据经验确定 可支持 AAV 长期稳定性的其他缓冲液。
  5. 将 AAV 样品浓缩至目标体积后，收集样品，经 0.2 µm 聚醚砜滤膜过滤，分装，并于 -80 °C 保存。

6. 将 AAV 样品感染靶细胞以评估纯化步骤中 AAV 的存在

  1. 感染前一天，在24孔板中每孔接种7 × 104个HT1080细胞，每孔加入500 µL添加了1% L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠和10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
  2. 感染前对细胞进行计数。在层析柱运行前加入稀释后的未纯化AAV粗样品、层析柱流出液样品、洗涤缓冲液以及洗脱得到的纯化AAV样品。
    注意：使用血细胞计数板对台盼蓝染色的细胞进行计数。根据经验确定AAV样品的稀释倍数和加样体积（µL）。AAV滴度越高，所需稀释倍数越大。为测定AAV的感染性滴度，在将未纯化粗样品（层析柱运行前）、层析柱流出液样品和洗涤缓冲液中的杆状病毒颗粒加入靶细胞前，必须在50 °C下热灭活50分钟。
  3. 感染后两天，使用流式细胞仪分析细胞中蛋白的表达（例如GFP或治疗基因）。
  4. 根据感染时的细胞总数、稀释倍数和GFP阳性细胞百分比，使用以下公式计算AAV的感染性滴度：（细胞总数 × GFP阳性细胞百分比 × 稀释倍数）/ AAV体积（毫升）。
    注意： 例如，细胞数量为1 × 105，GFP阳性细胞百分比为3.4%，稀释倍数为100，加入的AAV体积为2 µL，则AAV滴度为1.7 × 108 感染单位（IU）/mL。25 mL洗脱组分中纯化AAV颗粒的总量为4.3 × 109 感染单位（IU）/mL（图6）。初始未纯化AAV颗粒总数为1.09 × 1010 IU/mL，纯化后AAV颗粒为4.3 × 109 IU/mL，因此回收率为39.4%。GFP阳性细胞百分比应介于1%–30%之间，此范围对应于计算AAV感染性滴度时的线性区间。若感染靶细胞的AAV载体颗粒浓度过高，可能导致多个AAV颗粒感染单个细胞，但该细胞仍被计为单个载体拷贝。因此，应将AAV载体上清液适当稀释，使靶细胞中载体感染率控制在1%–30%。若AAV载体不含报告基因，可使用带有荧光染料的抗体对AAV载体表达的转基因或治疗基因进行染色，并通过流式细胞仪检测和定量。并非所有AAV血清型均能高效感染HT1080细胞，因此在对其他AAV血清型进行感染性检测时，应选用不同的细胞系。在HT1080细胞上测定AAV2-GFP颗粒纯化前与纯化后的滴度，并通过流式细胞术检测GFP表达水平。回收率（%）按纯化后AAV颗粒数量与纯化前AAV颗粒数量之比乘以100计算得出。

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结果

此处展示了利用Sf9昆虫细胞系统进行AAV载体生产和纯化工艺开发的代表性结果。该方法包括将Sf9细胞与杆状病毒感染的TIPS细胞共培养，用生长培养基对细胞进行补料，收获并裂解生产细胞以释放AAV颗粒，通过核酸酶处理、离心和过滤对细胞裂解液进行澄清，采用AVB Sepharose亲和层析纯化AAV，以及通过TFF进行浓缩（图1）。

TIPS 细胞通过分别感染 BV-AAV2-GFP 或治疗基因以及 BV-AAV2-rep-cap 到 Sf9 细胞中而生成。由于多轮感染，大多数 Sf9 细胞在 3–4 天内被感染，这可通过杆状病毒糖蛋白 gp64 的表达来证实图2）且细胞直径增大（图3). TIPS 细胞在感染后 3–4 天收获并进行冻存。将 Sf9 细胞与 TIPS 细胞共培养，后者向培养基中分泌杆状病毒颗粒，从而感染未接触过病毒的 Sf9 细胞。杆状病毒具有复制能力，因此随着新产生的杆状病毒颗粒不断分泌至...

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讨论

本方案中用于腺相关病毒（AAV）载体生产、纯化和浓缩工艺开发的参数，可适用于基因治疗应用中AAV载体的小规模和大规模生产。整个上游和下游工艺均可在符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的封闭系统中进行。Sf9-杆状病毒系统的主要优势在于能够以较低成本实现大规模GMP级AAV的可扩展生产。该系统无需使用HEK293细胞生产AAV时所需的昂贵质粒和转染试剂。已有报道显示，HEK293细胞和Sf9细胞产生的AAV载体质量相似（Eric D. Horowitz，ASGCT 2018，摘要号#100）。该系统面临的主要挑战是需要构建杆状病毒和TIPS细胞，耗时较长且工作量较大。

在本实验方案中，使用了两种类型的 TIPS 细胞（TwoBac 系统）：一种 TIPS 细胞含有携带 AAV 基因转移盒的杆状病毒，另一种 TIPS 细胞含有 AAV 的 rep-cap 基因。OneBac 系统2,16,17 可...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所的 Robert M. Kotin 博士慷慨提供 AAV 质粒，感谢辛辛那提儿童医院的 Danielle Steele 和 Rebecca Ernst 提供的技术支持。本研究由辛辛那提儿童研究基金会为 M.N. 提供的启动资金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 N 氢氧化钠Sigma-Aldrich1.09137用于 Akta Avant 清洗
2 L 锥形瓶ThermoFisher Scientific431281悬浮培养用锥形瓶
50 ml 离心管ThermoFisher Scientific14-959-49A用于收集上清液
24 孔板ThermoFisher Scientific07-200-80贴壁细胞培养板
250 mL 锥形瓶ThermoFisher Scientific238071悬浮培养用锥形瓶
Akta Avant 150 配 Unicorn 软件Cytiva28976337层析系统
AVB Sepharose High PerformanceCytiva28411210层析介质
Baculovirus-AAV-2 GFP本实验室制备非目录产品AAV 转移载体
Baculovirus-AAV-2 rep-cap本实验室制备非目录产品AAV 包装载体
核酸酶Sigma-AldrichE1014降解 DNA 和 RNA 的酶
封闭缓冲液Santa Cruz Biotechnologies516214封闭以防止抗体非特异性结合细胞
细胞裂解缓冲液本实验室制备非目录产品20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Triton X-100
Cellbag，2 L 和 10 LCytiva28937662生物反应器袋
清洗缓冲液本实验室制备非目录产品100 mM 柠檬酸 (pH 2.1) 
冻存管Thomas Scientific1222C24用于冷冻保存
DMEMSigma-AldrichD6429细胞系生长培养基
洗脱缓冲液本实验室制备非目录产品50 mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH 3.0)
乙醇Sigma-AldrichE7073用于层析柱的消毒和保存
过滤装置 Pall Corporation12941膜过滤器
HT1080 细胞系ATCCCCL-121成纤维细胞系
HyClone™ SFX-Insect 培养基CytivaSH30278.02无血清昆虫细胞生长培养基
蠕动泵Pall Corporation非目录产品TFF 泵
MaxQ 8000 摇床培养箱 ThermoFisher Scientific非目录产品用于悬浮培养的摇床
显微镜Nikon非目录产品细胞监测与计数 
小鼠抗杆状病毒 gp64 PE 抗体Santa Cruz Biotechnologies65498 PE监测 Sf9 细胞中的杆状病毒感染
氧气瓶Praxair非目录产品Sf9 细胞生长需要 40% 氧气供应
PBSThermoFisher Scientific20012027洗涤缓冲液
银染试剂盒ThermoFisher ScientificLC6100染色 AAV 衣壳蛋白
Sf9 细胞ThermoFisher Scientific11496-015昆虫细胞
去离子水本实验室制备非目录产品用于 Akta Avant 清洗
台式离心机ThermoFisher Scientific75253839/433607用于澄清杆状病毒上清液
切向流过滤 (TFF) 滤芯Pall CorporationOA100C12用于浓缩 AAV 的 TFF 滤芯
Tris-HCl, pH 8.0ThermoFisher15568025碱性缓冲液，用于中和洗脱的 AAV
WAVE 生物反应器系统 20/50Cytiva28-9378-00生物反应器

参考文献

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AAV Sf9 AAV AVB Sepharose
利用杆状病毒-昆虫细胞培养系统进行腺相关病毒（AAV）2载体的生产与纯化工艺开发
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