本实验方案描述了一种利用人工培养基从刺吸式口器昆虫中收集足量唾液的方法。该方法便于收集昆虫唾液，可用于研究唾液在昆虫取食行为及虫媒病毒传播中的功能。
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摘要
摘要
水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）在东亚地区对农业造成严重的经济损失，其在寄主水稻间的有效传播完全依赖于昆虫介体。Laodelphax striatellus（小褐飞虱，SBPH）是该病毒的主要昆虫介体，通过刺吸韧皮部汁液实现RSV的水平传播。唾液在昆虫的取食行为中发挥重要作用。本文介绍了一种适用于研究具有刺吸式口器昆虫唾液的简便方法。该方法中，将昆虫置于两层拉伸的石蜡膜之间，使其取食夹在其中的人工饲料。每天收集含有唾液的饲料，经过滤和浓缩后用于进一步分析。最后，通过蛋白质染色和免疫印迹检测所收集唾液的质量。本研究以检测SBPH唾液中RSV及一种黏蛋白样蛋白的存在为例，验证了该方法的有效性。这种人工饲喂与唾液收集方法将为深入研究昆虫唾液中与取食行为及病毒传播相关的因子奠定基础。
引言
水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）是一种属于负链RNA病毒属的病毒 水稻条纹病毒属在中国台湾及东亚其他地区对水稻生产造成严重病害1,2,3水稻植株间水稻条纹病毒（RSV）的传播依赖于昆虫介体，主要为 Laodelphax striatellus 以持续增殖性方式传播RSV。灰飞虱通过取食感染RSV的植株获得病毒。病毒进入昆虫体内后，于取食后一天感染中肠上皮细胞，随后穿过中肠屏障进入血淋巴。此后，RSV扩散至不同组织 通过 血淋巴，随后在体内扩散。在获毒后约10-14天的潜伏期后，病毒可通过唾液腺传播至健康的寄主植物。 通过 褐飞虱从韧皮部吸食汁液时分泌的唾液4,5,6,7,8,9,10高效的....
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方案
1. SBPH 的保种
- 在实验室中，将携带病毒和无水稻条纹病毒（RSV）的褐飞虱（SBPH）个体分别饲养于玻璃培养皿（65 × 200 mm）内，每个玻璃培养皿中放置5-6株水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）幼苗。水稻植株在25 °C、16小时光照/8小时黑暗光周期条件下培养。
注：携带病毒和无RSV的SBPH个体最初采自中国江苏省。 - 使用针对RSV核糖核蛋白（RNPs）制备的兔源RSV特异性多克隆抗体（见材料表），通过点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）检测SBPH中的RSV。
注：为确保后代高感染率，将携带病毒的雌虫单独饲养，并随机选取其15%的后代进行RSV感染检测。dot-ELISA的具体操作步骤详见1.3–1.7。 - 将单头SBPH在20 µL包被缓冲液（0.05 M Na2CO3-NaHCO3，pH 9.5）中匀浆，取3 µL点样于尼龙膜（见材料表）上，室温下自然干燥。
- 将膜置于15 mL封闭缓冲液（PBS + 3%脱脂奶粉）中，室温孵育30分钟。
- 将膜与稀释的一抗（兔抗RSV抗体，1:10000）在15 mL PBS中室温孵育1小时，随后用PBS洗涤3次，每次孵育5分钟。
- 将膜与1.5 µ....
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结果
人工饲喂装置与唾液采集示意图
图1A 展示用作取食室以收集唾液的玻璃圆筒（15 cm × 2.5 cm）。首先，将褐飞虱若虫饥饿处理数小时以提高采集效率，随后通过低温处理5分钟使其固定。将昆虫转移至玻璃圆筒后，取食室两端开口均覆盖拉伸的石蜡膜。在一端， 200 µL 5% 蔗糖溶液被夹在两层石蜡膜之间，石蜡膜被拉伸至约原始面积的两倍图1B）。用锡箔纸包裹饲养室，但人工饲料一端暴露于光照下。由于SBPH具有趋光性，饥饿的昆虫会聚集在光照端，并通过拉伸的内层石蜡膜摄食人工饲料溶液。基于此原理，昆虫的唾液可释放到人工饲料中，并每日收集。每天更换一次Parafilm-饲料装置。通过这种方式，连续收集人工饲料5天至2周，然后将全部样品浓缩至终体积 100 µL 使用10 KD离心滤器（图1C）。在收集唾液过程中，统计了取食5%蔗糖的SBPH的存活率。前4天内，超过80%的SBPH存活。但从第5天开始th 从.......
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讨论
1962年，Mittler 和 Dadd 首次报道了利用石蜡膜技术维持人工饲料成功饲养昆虫的方法29,30。此后，该方法已被广泛应用于昆虫生物学与行为学研究的多个方面，例如营养补充、dsRNA 喂养以及病毒获取等。根据唾液分析的要求，本研究采用5%蔗糖作为灰飞虱（SBPH）唾液采集的通用人工饲料。为成功采集唾液，以下几个关键步骤需特别注意：首先，在将实验昆虫引入饲养室前进行饥饿处理，以确保唾液采集的效率；其次，为模拟口针所处的环境，需制备双层石蜡夹心结构。当灰飞虱取食人工饲料时，唾液鞘在朝向饲料内侧的末端形成，随后分泌出水样唾液。第三，应适时收集并更换人工培养基，以减少样品中的微生物污染。最后，在更换人工饲料时，将昆虫在4 °C条件下麻醉5分钟，对于防止昆虫丢失至关重要。
与大多数含有氨基酸、维生素和碳水化合物的人工饲料相比，5%蔗糖培养基的优点十分显著。首先，其制备简便；其次，饲料成分简单，意味着对唾液中各种因子的后续分析干扰物质较少。然而，使用5%蔗糖作为通用人.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家重点研发计划（编号：2019YFC1200503）、国家自然科学基金（编号：32072385）以及中国科学院青年创新促进会（编号：2021084）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10-KD 离心过滤器 | Merck Millipore | R5PA83496 | 用于浓缩 |
| 10x 蛋白质转膜缓冲液（湿转） | macGENE | MP008 | 用于 Western 印迹的转膜缓冲液 |
| 10x TBST 缓冲液 | Coolaber | SL1328-500mL×10 | 用于 Western 印迹的洗涤缓冲液 |
| Azure c600 生物系统成像仪 | Azure Biosystems | Azure c600 | 用于 Western 印迹和银染成像的成像系统 |
| 彩色预染蛋白 Marker | GenStar | M221-01 | 用于 Western 印迹的蛋白标准品 |
| ECL Western 印迹检测试剂 | GE Healthcare | RPN2209 | 用于 Western 印迹检测 |
| 增强型 HRP-DAB 显色试剂盒 | TIANGEN | #PA110 | 用于显色反应 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体 | Sigma | 401393-2ML | 用于 Western 印迹的多克隆二抗 |
| Immobilon(R)-P 聚偏二氟乙烯膜 | Merck Millipore | IPVH00010 | 用于 Western 印迹的转膜膜 |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | 用于定量实时 PCR（qRT-PCR） |
| KIT, iSCRIPT cDNA 合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708891 | 用于逆转录 PCR（RT-PCR） |
| Millex-GP 过滤器，0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | 用于过滤 |
| Mini-PROTEAN TGX 凝胶 | Bio-Rad | 4561043 | 用于 SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | 用于检测蛋白浓度 |
| 尼龙膜 | PALL | T42754 | 用于点印迹 ELISA 的膜 |
| Parafilm M 封口膜 | Sigma | P7793-1EA | 用于制作人工饲料三明治 |
| 兔抗 LssgMP 多克隆抗体（针对 LssgMP 肽段） | Genstript | 用于 Western 印迹的兔源抗 LssgMP 多克隆一抗 | |
| 兔抗 RSV 多克隆抗体 | Genstript | 用于 Western 印迹和点印迹 ELISA 的兔源抗 RSV 多克隆一抗 | |
| RNAprep pure Micro 试剂盒 | TIANGEN | DP420 | 用于 RNA 提取 |
参考文献
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Vir....
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