双层膜三明治法用于Laodelphax striatellus唾液采集

摘要

本实验方案描述了一种利用人工培养基从刺吸式口器昆虫中收集足量唾液的方法。该方法便于收集昆虫唾液，可用于研究唾液在昆虫取食行为及虫媒病毒传播中的功能。

摘要

水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）在东亚地区对农业造成严重的经济损失，其在寄主水稻间的有效传播完全依赖于昆虫介体。Laodelphax striatellus（小褐飞虱，SBPH）是该病毒的主要昆虫介体，通过刺吸韧皮部汁液实现RSV的水平传播。唾液在昆虫的取食行为中发挥重要作用。本文介绍了一种适用于研究具有刺吸式口器昆虫唾液的简便方法。该方法中，将昆虫置于两层拉伸的石蜡膜之间，使其取食夹在其中的人工饲料。每天收集含有唾液的饲料，经过滤和浓缩后用于进一步分析。最后，通过蛋白质染色和免疫印迹检测所收集唾液的质量。本研究以检测SBPH唾液中RSV及一种黏蛋白样蛋白的存在为例，验证了该方法的有效性。这种人工饲喂与唾液收集方法将为深入研究昆虫唾液中与取食行为及病毒传播相关的因子奠定基础。

引言

水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）是一种属于负链RNA病毒属的病毒 水稻条纹病毒属在中国台湾及东亚其他地区对水稻生产造成严重病害^1,2,3水稻植株间水稻条纹病毒（RSV）的传播依赖于昆虫介体，主要为 Laodelphax striatellus 以持续增殖性方式传播RSV。灰飞虱通过取食感染RSV的植株获得病毒。病毒进入昆虫体内后，于取食后一天感染中肠上皮细胞，随后穿过中肠屏障进入血淋巴。此后，RSV扩散至不同组织 通过 血淋巴，随后在体内扩散。在获毒后约10-14天的潜伏期后，病毒可通过唾液腺传播至健康的寄主植物。 通过 褐飞虱从韧皮部吸食汁液时分泌的唾液^{4,5,6,7,8,9,10}高效的取食过程以及唾液中的多种因子对于水稻条纹病毒（RSV）从昆虫传播到寄主植物至关重要。

由唾液腺分泌的昆虫唾液被认为在昆虫、病毒和寄主植物之间的相互作用中起介导作用。半翅目昆虫通常产生两种类型的唾液：凝胶状唾液和水样唾液^11,12,13胶状唾液主要分泌到质外体中，以维持口针在寄主细胞间的移动，同时也与克服植物抗性及免疫反应有关^14,15,16,17在取食的探针阶段，昆虫间歇性地分泌凝胶状唾液，该唾液迅速被氧化，形成表面凸缘。随后，单根或分枝的鞘状结构包裹住口针，以保留一个管状通道。^18,19,20表皮上的表面凸缘被认为可作为锚定点，有助于口针的刺入，而口针周围的鞘状结构可能提供机械稳定性和润滑作用。^16,21,22,23Nlshp被鉴定为褐飞虱唾液鞘形成和成功取食的关键蛋白Nilaparvata lugens，良性前列腺增生（BPH）。抑制蚜虫分泌的结构鞘蛋白（SHP）的表达 Acyrthosiphon pisum 通过破坏其从寄主筛管中取食的行为，抑制了其繁殖²⁴此外，在某些昆虫物种中，凝胶状唾液因子被认为可通过形成所谓的植食性节肢动物相关分子模式（HAMPs）来触发植物免疫反应。在 N. lugensNlMLP是一种与鞘形成相关的黏蛋白样蛋白，可诱导植物产生防御反应以抵抗取食，包括细胞死亡、防御相关基因的表达以及胼胝质沉积 ^25,26此外，一些蚜虫凝胶状唾液因子已被证实可触发植物防御反应 通过 类似于病原体相关分子模式的基因间相互作用^12,15,27.

为了研究对昆虫取食和/或病原体传播至关重要的唾液因子，有必要分析分泌的唾液。本文描述了人工喂食和唾液收集方法，以获取足量唾液用于后续分析。使用仅含单一营养成分的培养基，通过银染和蛋白质印迹法收集并分析了多种唾液蛋白。该方法将有助于进一步研究灰飞虱传播水稻条纹病毒（RSV）过程中唾液中关键因子的作用。

方案

1. SBPH 的保种

1. 在实验室中，将携带病毒和无水稻条纹病毒（RSV）的褐飞虱（SBPH）个体分别饲养于玻璃培养皿（65 × 200 mm）内，每个玻璃培养皿中放置5-6株水稻（Oryza sativa cv. Nipponbare）幼苗。水稻植株在25 °C、16小时光照/8小时黑暗光周期条件下培养。
   注：携带病毒和无RSV的SBPH个体最初采自中国江苏省。
2. 使用针对RSV核糖核蛋白（RNPs）制备的兔源RSV特异性多克隆抗体（见材料表），通过点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）检测SBPH中的RSV。
   注：为确保后代高感染率，将携带病毒的雌虫单独饲养，并随机选取其15%的后代进行RSV感染检测。dot-ELISA的具体操作步骤详见1.3–1.7。
3. 将单头SBPH在20 µL包被缓冲液（0.05 M Na₂CO₃-NaHCO₃，pH 9.5）中匀浆，取3 µL点样于尼龙膜（见材料表）上，室温下自然干燥。
4. 将膜置于15 mL封闭缓冲液（PBS + 3%脱脂奶粉）中，室温孵育30分钟。
5. 将膜与稀释的一抗（兔抗RSV抗体，1:10000）在15 mL PBS中室温孵育1小时，随后用PBS洗涤3次，每次孵育5分钟。
6. 将膜与1.5 µL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（见材料表）在15 mL PBS中孵育，随后用PBS洗涤3次，每次孵育5分钟。
7. 根据生产商提供的说明书，使用增强型HRP-DAB显色试剂盒（见材料表）进行免疫印迹显色。

2. 取食室和人工饲料的制备

1. 称取 2 g 蔗糖粉末，溶于 40 mL ddH₂O 中，配制 5% 蔗糖水溶液作为人工饲料。
2. 使用 0.22 µm 滤膜（见材料表） 过滤该溶液，以去除细菌污染和杂质。
3. 在将 200 头 3^rd-5^th 龄 SBPH 幼虫引入饲喂室前，饥饿处理 3–5 小时。
   注：每个饲喂室准备 200 头 SBPH；若需多个饲喂室，应相应增加 SBPH 数量。
4. 将玻璃圆筒准备为饲喂室（图 1A）。在引入实验昆虫前，用一层石蜡膜（见材料表）封住圆筒的一端开口。
   注：每个圆筒长 15.0 cm，直径 2.5 cm。这些玻璃圆筒根据实验需求定制。
5. 将昆虫转移至玻璃圆筒中。
6. 用拉伸的石蜡膜（特指 Parafilm M）封住饲喂室的另一端，然后加入 200 µL 人工饲料，最后再覆盖一层拉伸的石蜡膜以封闭液体。
   注：石蜡膜需拉伸至约原面积的两倍。
7. 用铝箔包裹饲喂室，但使装有人工饲料的一端暴露于光照下。

3. 检集SBPH唾液

1. 分别在24小时结束后，收集无RSV和带毒的褐飞虱的人工饲料。
2. 将装置置于4 °C冷却，以固定昆虫。
3. 揭开外层膜，用无菌移液器将人工饲料液体收集至1.5 mL无菌离心管中。收集的唾液样品保存于-80 °C，直至分析使用。
   注意：收集的唾液可在-80 °C保存长达1年。
4. 用50 µL新鲜人工饲料轻柔吹打冲洗内层膜三次，按步骤3.3所述方法收集冲洗用的人工饲料。将新的人工饲料置于内层膜上，并在其上方覆盖一张新拉伸的石蜡膜。
5. 重复步骤3.2和3.3，持续5天至2周。
   注意：统计人工饲养褐飞虱的存活率，并根据存活率及时补充足够数量的新鲜褐飞虱。
6. 将收集的样品通过0.22 µm滤器 过滤，以去除微生物及其他污染物。

4. 收集唾液的浓缩

1. 将收集的唾液样本转移至0.5 mL 10 kD离心过滤器中（参见 材料表) 并以 5,500 x g 4 °C 下孵育 20 分钟。收集上清液，并将终体积调至 100 µL。
2. 使用适当的紫外-可见分光光度计，按照步骤 4.3–4.6 测定所收集唾液的浓度。
3. 打开分光光度计，并用ddH₂O将支架清洗三次₂O.
4. 在屏幕上按正确顺序选择以下选项： 蛋白质 | 蛋白质 A280 | 选择类型 | 1 Abs = 1 mg/mL然后，勾选复选框 340 nm 基线校正.
5. 加入2 µL 5%蔗糖水溶液作为空白对照，轻触 空白 在屏幕底部。
6. 设定标准后，取2 µL收集的唾液进行检测。读取并记录蛋白质浓度。
   ​注意：最终至少共收集到1 mg唾液蛋白质。

5. 唾液蛋白质的银染

1. 使用样品上样缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 6.8，10%甘油，2% SDS，0.1%溴酚蓝和1% β-巯基乙醇）从昆虫唾液样品中提取蛋白质。然后通过10% SDS-PAGE进行分离（参见材料表）。将经同样处理的5%蔗糖水溶液作为阴性对照上样。
2. 将20 µL样品等分试样与预染蛋白标记物一同上样至SDS-PAGE凝胶中。先以90伏电压电泳15分钟，然后以140伏电压继续电泳50分钟。
3. 电泳结束后，将凝胶置于含30%（体积/体积）乙醇和10%（体积/体积）乙酸的固定液中固定至少30分钟。
4. 分别用20%（体积/体积）乙醇和水各冲洗凝胶两次，每次10分钟。
5. 将凝胶在0.8 mM硫代硫酸钠中敏化1分钟，然后用纯水冲洗两次，每次1分钟。
6. 将凝胶浸入12 mM硝酸银溶液中至少1小时，然后在转移至显影液前用去离子水浸泡10秒。
7. 当凝胶背景开始变暗时，将凝胶浸入终止液（5%乙酸）中至少30分钟，以终止反应。
8. 用纯水洗涤凝胶两次，每次30分钟。使用检测系统显影图像（参见材料表）。

6. 蛋白质的 Western 印迹检测

1. 分别使用特异性抗体通过蛋白质印迹法检测褐飞虱（SBPH）的唾液黏蛋白样蛋白（LssgMP）和水稻条纹病毒（RSV）。
2. 按照步骤5.1处理昆虫唾液样品。
3. 取20 µL样品与预染蛋白标记物及20 µL未感染RSV的唾液样品（作为阴性对照）一同上样至10% SDS-PAGE凝胶，先以90伏电压电泳15分钟，再以140伏电压电泳50分钟。
4. 将100 mL 10x蛋白转膜缓冲液（湿转法）（见 材料表） 与900 mL ddH₂O混合配制成工作液（1x），然后使用1x蛋白转膜缓冲液将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
5. 用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（含0.01 M Tris缓冲盐水和0.05% Tween 20）在室温下封闭膜1小时。
   注意：本实验方案中，将100 mL 10x TBST（见 材料表） 与900 mL ddH₂O混合配制成工作液。
6. 将膜与针对RSV或LssgMP的兔源一抗（均按1:10000稀释于TBST中）在室温下孵育至少2小时。
   注意：针对RSV的一抗制备方法前文已提及；兔抗LssgMP多克隆抗体由生物技术公司针对LssgMP肽段GIQFDSYSASDLTRC制备而成。
7. 用TBST缓冲液洗涤膜三次，每次孵育10分钟。
8. 将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗按1:10000稀释于TBST中进行孵育。
9. 使用增强型化学发光Western Blot检测系统显影免疫印迹膜。

7. 检测LssgMP在SBPH中的表达模式

1. 将昆虫置于 4 °C 环境中固定 5 分钟。
2. 用 75% 乙醇和 ddH₂O 逐个清洗昆虫，然后在预冷的 TBS（0.01 M Tris 缓冲盐水）中解剖昆虫。
3. 从腹部开始解剖昆虫，同时用镊子在基节-转节关节处切断褐飞虱的前足；用 TBS 清洗中肠和唾液腺各两次，以去除血淋巴的任何污染。
4. 将五个组织样本放入一个 1.5 mL 无 RNase 的离心管中用于 RNA 提取。每个离心管视为一个独立样本。
5. 按照试剂盒制造商的说明书进行 RNA 提取和反转录 PCR（RT-PCR）（参见材料表）。
6. 进行定量实时 PCR（qRT-PCR），以检测LssgMP在L. striatellus整体或不同组织提取物中的相对转录表达水平。
   注意：基因扩增所用的引物对为LssgMP-q-F/LssgMP-q-R，SYBR Green 法 qPCR 按照制造商说明书进行。使用引物对ef2-q-F/ef2-q-R 对L. striatellus 翻译延伸因子 2（ef2）的转录水平进行定量，用于 cDNA 模板的标准化。引物序列如下：LssgMP-q-F：TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG；LssgMP-q-R：GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC；ef2-q-F：GTCTCCACGGATGGGCTTT；ef2-q-R：ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT。

结果

人工喂养装置与唾液采集示意图
图1A 展示用作取食室以收集唾液的玻璃圆柱管（15 cm × 2.5 cm）。首先，将褐飞虱若虫饥饿数小时以提高采集效率，随后通过低温处理5分钟使其固定。将昆虫转移至玻璃圆柱管后，用拉伸的石蜡膜封住取食室两端开口。在一端，将200 µL的5%蔗糖溶液夹在两层石蜡膜之间，石蜡膜被拉伸至约原面积的两倍图1B）。用锡箔纸覆盖整个小室，仅留人工饲料端暴露于光照下。由于褐飞虱具有趋光性，饥饿的昆虫会聚集在受光端，并通过拉伸的内层石蜡膜摄食人工饲料溶液。在此过程中，唾液可分泌至人工饲料中，并每日收集。每天更换新的石蜡膜-饲料装置。通过此方法，连续收集人工饲料5天至2周，随后使用10 KD离心过滤器将全部样品浓缩至终体积100 µL。图1C）。在收集唾液期间，统计了取食5%蔗糖的SBPH的存活率。前4天内，超过80%的SBPH存活。但从第5天起^th 从第4天开始，死亡率迅速上升至4...

讨论

1962年，Mittler 和 Dadd 首次报道了利用石蜡膜技术维持人工饲料成功饲养昆虫的方法^29,30。此后，该方法已被广泛应用于昆虫生物学与行为学研究的多个方面，例如营养补充、dsRNA 喂养以及病毒获取等。根据唾液分析的要求，本研究采用5%蔗糖作为灰飞虱（SBPH）唾液采集的通用人工饲料。为成功采集唾液，以下几个关键步骤需特别注意：首先，在将实验昆虫引入饲养室前进行饥饿处理，以确保唾液采集的效率；其次，为模拟口针所处的环境，需制备双层石蜡夹心结构。当灰飞虱取食人工饲料时，唾液鞘在朝向饲料内侧的末端形成，随后分泌出水样唾液。第三，应适时收集并更换人工培养基，以减少样品中的微生物污染。最后，在更换人工饲料时，将昆虫在4 °C条件下麻醉5分钟，对于防止昆虫丢失至关重要。

与大多数含有氨基酸、维生素和碳水化合物的人工饲料相比，5%蔗糖培养基的优点十分显著。首先，其制备简便；其次，饲料成分简单，意味着对唾液中各种因子的后续分析干扰物质较少。然而，使用5%蔗糖作为通用人...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10-KD 离心过滤器	Merck Millipore	R5PA83496	用于浓缩
10x 蛋白质转膜缓冲液（湿转）	macGENE	MP008	用于 Western 印迹的转膜缓冲液
10x TBST 缓冲液	Coolaber	SL1328-500mL×10	用于 Western 印迹的洗涤缓冲液
Azure c600 生物系统成像仪	Azure Biosystems	Azure c600	用于 Western 印迹和银染成像的成像系统
彩色预染蛋白 Marker	GenStar	M221-01	用于 Western 印迹的蛋白标准品
ECL Western 印迹检测试剂	GE Healthcare	RPN2209	用于 Western 印迹检测
增强型 HRP-DAB 显色试剂盒	TIANGEN	#PA110	用于显色反应
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体	Sigma	401393-2ML	用于 Western 印迹的多克隆二抗
Immobilon(R)-P 聚偏二氟乙烯膜	Merck Millipore	IPVH00010	用于 Western 印迹的转膜膜
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725125	用于定量实时 PCR（qRT-PCR）
KIT, iSCRIPT cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad	1708891	用于逆转录 PCR（RT-PCR）
Millex-GP 过滤器，0.22 µm	Merck Millipore	SLGP033RB	用于过滤
Mini-PROTEAN TGX 凝胶	Bio-Rad	4561043	用于 SDS-PAGE
NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONEC-W	用于检测蛋白浓度
尼龙膜	PALL	T42754	用于点印迹 ELISA 的膜
Parafilm M 封口膜	Sigma	P7793-1EA	用于制作人工饲料三明治
兔抗 LssgMP 多克隆抗体（针对 LssgMP 肽段）	Genstript		用于 Western 印迹的兔源抗 LssgMP 多克隆一抗
兔抗 RSV 多克隆抗体	Genstript		用于 Western 印迹和点印迹 ELISA 的兔源抗 RSV 多克隆一抗
RNAprep pure Micro 试剂盒	TIANGEN	DP420	用于 RNA 提取