快速高效地定量细胞内结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的生长对于开发更有效的结核病（TB）治疗方案至关重要。本方案描述了一种基于液体培养基的比色检测方法，利用自动化液体培养系统来定量经候选宿主导向疗法处理的巨噬细胞中结核分枝杆菌（Mtb）的生长情况。
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摘要
摘要
Mycobacterium tuberculosis（Mtb）是结核病（TB）的致病菌，在新冠疫情出现之前，曾是全球最致命的传染病病原体。Mtb 已经进化出在宿主细胞内长期存活、逃避免疫系统防御的能力，并对多种抗结核药物产生了耐药性。解决耐药问题的一种策略是寻找已获批准的 现有药物，这些药物能够增强宿主对 Mtb 的免疫应答。这些药物随后可被重新用于作为辅助性的宿主导向疗法（HDT），以缩短治疗周期并帮助克服抗生素耐药性。
在巨噬细胞内定量结核分枝杆菌（Mtb）的生长是评估潜在宿主导向疗法（HDT）的关键环节。测量Mtb生长的金标准是在琼脂平板上计数菌落形成单位（CFU）。该方法耗时较长且劳动强度大，不适合药物的快速筛选。本方案中，采用了一种自动化的液体培养系统——该系统通常用于临床标本中Mtb的检测——并将其改进用于宿主导向疗法的临床前筛选。本研究评估了该液体培养检测系统用于研究经HDT处理后巨噬细胞内Mtb生长的能力。所测试的HDT包括全反式维甲酸（AtRA），分别以游离形式和包载于聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）微粒中的形式，以及干扰素-γ与利奈唑胺的联合用药。相较于CFU法，这种自动化液体培养技术的优势包括操作简便、制备过程劳动强度低，以及获得结果更快（5–12天，而琼脂平板法需21天或更长时间）。
引言
Mycobacterium tuberculosis（Mtb）是结核病的致病菌，2019年在全球范围内是导致死亡人数最多的传染病1。为了逃避宿主免疫防御，Mtb会破坏巨噬细胞和树突状细胞（DCs）等天然免疫细胞的抗分枝杆菌活性，从而在细胞内长期存活并进行复制2。目前尚无有效预防成人肺结核的疫苗，且耐药菌株不断出现，凸显了开发新疗法的紧迫性。
辅助性宿主导向疗法（HDT）可缩短治疗时间并有助于克服耐药性3HDT候选药物的临床前评估 体外 确定巨噬细胞内分枝杆菌杀菌活性通常依赖于在固体琼脂平板上通过菌落形成单位（CFU）定量结核分枝杆菌（Mtb）的生长。该方法耗时长、劳动强度大，不适用于药物的快速筛选。目前，商业化的自动化液体培养基微生物检测系统在临床微生物学实验室中更为常用，用于临床标本中结核分枝杆菌及其他分枝杆菌物种的检测及其药物敏感性试验。4。这些仪器通过检测细菌代谢活性引起的培养基物理变化（如CO₂浓度变化）来间接测量细菌生长。2 或 O2 随时间监测的水平或压力5检测读数为阳性出现时间（TPP），既往研究已表明其与结核病患者痰标本中结核分枝杆菌（Mtb）菌落形成单位（CFU）在治疗过程中的变化相关6,7 以及感染小鼠肺和脾脏裂解物中的8此外，液体培养检测系统已被用于评估常规靶向病原体疗法对无菌培养及感染巨噬细胞中分枝杆菌生长的影响。9,10该仪器还被用于研究树突状细胞和肺泡巨噬细胞在控制结核分枝杆菌（Mtb）胞内生长方面的固有能力。11,12本实验方案表明，液体培养诊断系统可被改造用于在培养的巨噬细胞中进行结核病宿主导向治疗（HDT）的临床前筛选。与菌落形成单位（CFU）计数法相比，该技术的主要优势在于显著减少了定量检测胞内分枝杆菌生长/存活所需的实验工作量和时间。该技术依赖于使用自动化培养仪器，可用于评估经多种靶向细胞功能以增强宿主免疫的药理试剂处理后的免疫细胞内分枝杆菌的存活情况。
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方案
本方案中所述实验使用结核分枝杆菌（Mtb）的减毒H37Ra菌株进行，该菌株可在生物安全二级（Containment Level 2）实验室中操作。所有活分枝杆菌的操作均在II级生物安全柜（BSC）中进行。实验流程设计旨在尽量减少气溶胶的产生。真核细胞培养（THP-1细胞）同样在II级生物安全柜中进行。实验室已开展风险评估，并确保所有操作均符合机构及国家的生物安全法规。本方法采用人单核细胞THP-1细胞系进行（步骤1）。在感染分枝杆菌前，细胞经佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）刺激后分化为巨噬细胞。
1. 细胞培养
- 在添加了10%白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）增补剂和0.05%聚山梨酯80的Middlebrook 7H9（MB）液体培养基中，将H37Ra种子液扩增至对数生长期。将H37Ra菌种以1 mL分装量储存于-80 °C 可保存于冷冻机中长达1年。
- 解冻一支1 mL的Mtb-H37Ra冻存管，将其转移至含有9 mL添加补充剂的MB培养基的T25培养瓶中，瓶口配备滤膜盖，操作时间约为计划实验前1周。置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育。 37 °C 在静态培养箱中培养5-7天。
- 在T75培养瓶中，使用添加了未灭活的10%胎牛血清（完全RPMI）的RPMI-1640培养基，在CO₂培养箱中培养THP-1细胞2 5% CO₂湿润培养箱2/37 °C 每周传代两次，以维持密度低于 1 x 106 cells/mL
- 感染前3天，将THP-1细胞在T75培养瓶中用血清移液管轻轻吹打数次以分散细胞团块，并转移至50 mL锥形管中，诱导其分化为巨噬细胞。
- 300 x g 离心细胞 g 室温孵育10分钟，倾去上清液，将沉淀物轻轻重悬于2 mL RPMI培养基中。进行细胞计数以估算每毫升细胞数。
- 在12孔组织培养板中，以每毫升100,000个细胞的密度将2 mL THP-1巨噬细胞接种于含100 ng/mL PMA的cRPMI培养基中，培养72小时。在感染Mtb前，移除含PMA的培养基，并补充新鲜的cRPMI培养基。
- 为每个所需时间点分别设置单独的培养皿。
- 以相同密度（100,000 个细胞/mL）将种子细胞接种于 2 孔玻璃培养板中，以确定感染复数（MOI）。
- 置于5% CO₂环境中2 37°C 的加湿培养箱中培养 3 天 37 °C.
2. 结核分枝杆菌摄取量的定量分析
- 巨噬细胞对结核分枝杆菌（Mtb）摄取的测定（感染复数，MOI）
- 在感染当天设置II级生物安全柜（BSC），并在操作区域铺两层纸巾以吸收可能的溢出物。根据当地法规设置废弃物弃置容器。
- 从T25培养瓶中取出6-8 mL分枝杆菌培养物，转移至15 mL聚丙烯离心管中。
注意：对于小规模实验可使用更小体积的离心管。 - 在室温下，使用台式离心机以2890 × g 离心10分钟。
- 小心将离心管从离心机中取出并转移至生物安全柜内，静置1分钟，使细菌沉淀。
- 将上清液倒入含消毒剂的废液容器中，盖上管盖，通过轻弹管壁将残留培养基中的细菌重新悬浮。静置1分钟使细菌再次沉淀。
- 加入2 mL预温的cRPMI培养基，轻轻混匀，然后转移至50 mL锥形离心管中。
- 使用25 G针头和5 mL注射器极其小心地重悬分枝杆菌。操作时，将菌液吸入注射器，然后沿管壁缓慢推出，以最大限度减少气溶胶产生。重复此操作6-8次。
注意：由于这是高密度的分枝杆菌培养物，操作需格外谨慎。为避免针刺伤，应尽可能使用钝头针头和Luer锁式注射器。 - 将针头和注射器丢弃至BSC内的锐器盒中。
- 将菌悬液转移至2 mL带螺口盖的微量离心管中，在室温下以100 × g 离心3分钟，以沉淀残留的菌团。将离心管放回安全柜，静置1分钟使细菌沉淀。
- 取上层1-1.5 mL上清液转移至新管中。将原管弃入含消毒剂的废液桶中。充分混匀后，取不同体积的分枝杆菌悬液（如5、25、50、150 µL）加入2孔玻璃培养腔室载玻片中，在37 °C、CO2 培养箱中孵育3小时。
- 抗酸杆菌（AFB）染色
注意：孵育3小时后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗巨噬细胞，并用多聚甲醛固定以灭活分枝杆菌。随后使用改良金胺O染色试剂盒（见材料表）对载玻片进行染色，以评估每个细胞吞噬的分枝杆菌数量。由于分枝杆菌具有蜡质细胞壁，经酸性乙醇洗涤后仍可保留金胺染料。随后用Hoechst对巨噬细胞核进行复染。该方法可用于计数每个细胞内吞噬的细菌数量，从而确定巨噬细胞的感染复数（MOI）。- 用移液器反复吹打3次后，吸除玻璃腔室载玻片中的培养基，以去除未被吞噬的细菌。
- 用2 mL室温PBS洗涤一次。
- 将4%多聚甲醛溶于PBS中，分装后于-20 °C保存，可稳定6个月。使用前立即取出一份分装液，用PBS稀释至2%多聚甲醛，每孔加入2 mL。
- 室温孵育10分钟。此时可将玻璃腔室载玻片从安全柜中取出进行染色。
- 用轻柔的自来水流冲洗载玻片。
- 使用塑料移液器滴加足量金胺染液覆盖细胞，在避光条件下室温孵育1分钟（可用铝箔覆盖）。
- 用自来水洗去多余染液，加入脱色剂/淬灭剂，在避光条件下孵育1分钟。
- 用自来水洗去脱色剂，随后在避光条件下用Hoechst 33342（10 µg/mL溶于PBS）室温孵育15分钟。
- 用自来水洗去Hoechst染液，取下腔室，沥干多余水分，滴加一滴抗荧光淬灭剂，加盖盖玻片，自然晾干。
- 在荧光显微镜下使用100倍油镜观察载玻片。在FITC滤光片下，分枝杆菌呈绿色荧光；在DAPI滤光片下，细胞核呈蓝色荧光（图1C）。
- 通过计数每个细胞内吞噬的分枝杆菌数量及感染细胞百分比，确定MOI。
- 根据培养板每孔的表面积计算达到所需MOI所需的分枝杆菌悬液体积；例如，本实验所用玻璃腔室载玻片每孔表面积为4 cm2。对于持续数天的实验（如5天），建议采用较低MOI（约1-2个杆菌/细胞）。
- 巨噬细胞感染
- 充分混匀分枝杆菌悬液，根据已确定的所需MOI体积，将适量菌液加入12孔板中的细胞上。
- 在37 °C孵育3小时，使分枝杆菌被细胞吞噬。
- 用温热的RPMI或HBSS多次洗涤孔板，以去除细胞外细菌。
- 裂解其中一个孔的巨噬细胞（3小时样本），以测定初始接种物的阳性检出时间百分比（TTP，见下文第3步说明）。
- 向其余孔中加入新鲜cRPMI及所需药物剂量或溶剂对照，将培养板置于37 °C、CO2 培养箱中孵育至所需时间（根据实验设计而定，通常为1至8天之间的多个时间点）。
3. 为液体培养检测系统收集样品
注意：感染当天，通过洗涤去除细胞外分枝杆菌，并通过裂解一孔巨噬细胞（3小时样本）收集细胞内分枝杆菌，以确定初始吞噬量，作为感染的基线对照。在后续时间点，将培养基、细胞裂解液和洗涤液合并，以测定分枝杆菌的总生长量。如有需要，也可分别评估细胞外和细胞内的生长情况。
- 采集3小时样本以确定TTP
- 按照步骤2.3.3所述，在初始感染3小时后，洗去所有孔中的胞外分枝杆菌。向3小时对照孔中加入1 mL新鲜培养基，使裂解液体积与后续时间点的体积相等。
注意：如果分析中需排除胞外分枝杆菌，请参见步骤3.2.7。
- 按照步骤2.3.3所述，在初始感染3小时后，洗去所有孔中的胞外分枝杆菌。向3小时对照孔中加入1 mL新鲜培养基，使裂解液体积与后续时间点的体积相等。
- 样本采集
- 将MB培养基和仪器用培养瓶预温，使其达到室温。
- 将12孔板中的培养基转移至相应标记的锥形管中。
- 向每孔加入500 µL无菌裂解缓冲液（含0.1% Triton X-100的PBS，经无菌0.2 µm滤膜过滤），作用10分钟。
- 用无菌细胞刮轻轻刮下孔内细胞，并与相应锥形管中的培养基混合。
- 用0.5 mL无菌PBS清洗孔板，并将洗液转移至相应管中。
- 将每个样本用针头和注射器（25 G）轻轻吹打6–8次，以打散细胞团块。用MB培养基将样本稀释1:10；即100 µL样本 + 900 µL MB培养基。
- 在规定的时间/天数（通常为1至8天之间），按照上述步骤3.2.1–3.2.6采集剩余样本。
注意：研究者可能希望在分析中排除胞外分枝杆菌，此时在上述步骤3.2.2中，应弃去每孔的培养基，并在加入裂解缓冲液前多次洗涤巨噬细胞。
- 接种并装载仪器用培养瓶
注意：液体培养仪器及相关耗材的详细信息见材料表。- 用浸有70%酒精的纸巾擦拭仪器用培养瓶的橡胶帽，并静置晾干。
注意：此步骤需在生物安全柜（BSC）中进行。 - 将所有样本所需的营养补充剂（0.5 mL/瓶）转移至一个锥形管中进行预混。使用针头和注射器向仪器用培养瓶中注入0.5 mL营养补充剂。
- 用移液器将500 µL稀释样本（1:10）加入1 mL V型底管中。
- 使用针头和注射器将500 µL样本注入指定的仪器用培养瓶中。
- 用浸有70%酒精的纸巾擦拭仪器用培养瓶的橡胶帽，并静置晾干。在从生物安全柜中取出前，用浸有70%酒精的纸巾擦拭瓶身。
- 小心地将培养瓶从生物安全柜转移至仪器进行装载。
- 按下自动微生物检测系统的装载按钮。
- 扫描仪器用培养瓶上的条形码，并将瓶子放入检测系统孵育器中，在37 °C下孵育最长42天。从仪器屏幕上读取并记录达到阳性所需的时间。
注意：条形码可使仪器识别培养瓶，并将反射光读数与特定培养瓶关联。 - 通过比较初始胞内接种物（第0天）与在指定时间培养的巨噬细胞的TTP，计算阳性时间百分比变化（TTP%）。TTP%的正值变化表示分枝杆菌生长13。
例如，第3天：
阳性时间百分比变化 =
- 用浸有70%酒精的纸巾擦拭仪器用培养瓶的橡胶帽，并静置晾干。
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结果
本研究中使用的自动液体培养仪可监测CO2 每10分钟检测一次水平。通过比色法测量仪器瓶底部传感器的颜色变化，并以反射率单位表示。随后，仪器软件应用检测算法计算阳性所需时间（TTP），即从接种之日起至培养物被标记为阳性所需的天数图1A）。TTP 与 log 之间呈负相关关系10菌落形成单位（通过琼脂平板法测定）12 初始接种物中的情况如图所示 图1B当在存在或不存在药理学抑制剂的条件下，以感染复数（MOI）1-2 至 5-10 感染巨噬细胞后，结核分枝杆菌（Mtb）在巨噬细胞内的生长情况图1C采用自动化培养法与固体琼脂平板菌落计数法进行比较时，两种方法所得结果之间存在显著相关性（图1D）。为了直观显示结核分枝杆菌（Mtb）的生长情况，根据上述公式计算TTP的百分比变化，即将感染巨噬细胞后最多8天内的TTP值与初始...
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讨论
作者已采用本方案中所述的液体培养法，监测结核分枝杆菌（Mtb）在单核细胞来源的巨噬细胞、肺泡巨噬细胞以及经PMA诱导分化的THP-1细胞中的生长情况11,16,17。该技术也可经修改后用于非贴壁细胞12。最近，该仪器还被用于临床前研究，以评估吸入性全反式维甲酸（AtRA）作为结核病宿主导向治疗（HDT）的效果17。本方案中的关键步骤包括：（1）通过抗酸染色（AFB染色）控制Mtb的摄取，以消除因药物预处理导致的吞噬作用差异等因素的影响，并尽量减少细胞死亡，而较低的感染复数（MOI）下细胞死亡的可能性较小；（2）根据MOI的不同，细胞裂解液可能需要稀释，以最大化检测的动态范围。将TTP控制在约5–12天范围内，可获得可重复的实验结果。
在本实验方案中，减毒的结核分枝杆菌H37Ra被用作毒力菌株Mtb的替代...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由爱尔兰科学基金会（SFI 08/RFP/BMT1689）、爱尔兰卫生研究委员会 [HRA-POR/2012/4 和 HRA-POR-2015-1145] 以及都柏林皇家城市医院信托基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| IX51 荧光显微镜 | Olympus, Japan | N/A | 抗酸杆菌检测与成像 |
| 2 mL 微量离心管，平底，螺口盖，无菌 | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染 |
| 5 mL 注射器，鲁尔锁扣 | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染/菌落形成单位 |
| 50 mL 管，无菌 | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染 |
| 全反式维甲酸（ATRA）≥98%（HPLC） | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | 宿主导向治疗候选药物 |
| BacT/ALERT 3D 微生物检测系统 | Biomerieux (Hampshire, UK) | 247001 | 基于肉汤的比色检测系统 |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP 营养补充剂 | Biomerieux (Hampshire, UK) | 414997 | 基于肉汤的比色检测实验 |
| BACT/ALERT MP 培养瓶 | Biomerieux (Hampshire, UK) | 419744 | 基于肉汤的比色检测实验 |
| BD BBL Middlebrook ADC 增菌液，20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | 分枝杆菌液体培养 |
| BD BBL Middlebrook OADC 增菌液，20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | 菌落形成单位 |
| 细胞刮刀，25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | 收集巨噬细胞裂解物 |
| Corning 注射器滤器，0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | 裂解缓冲液的灭菌 |
| 盖玻片（硼硅酸盐），24 × 50 mm，#1.5 厚度 | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| 放线菌酮（Cycloheximide），来源于微生物 | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | 菌落形成单位 |
| Dako 荧光封片介质 | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | 抗荧光淬灭封片剂 |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染 |
| 胎牛血清，Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | 巨噬细胞培养 |
| 甘油，Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | 菌落形成单位 |
| Hoescht 33342（双苯并咪唑 H 33342 三盐酸盐） | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | 细胞核染色剂 |
| IFNγ，重组人源 | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | 宿主导向治疗候选药物 |
| Labtek 2 孔腔室载玻片，无菌，Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染 |
| L-天冬酰胺，无水 | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | 菌落形成单位 |
| 利奈唑胺 | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | 抗生素 |
| Microlance 25 G 皮下注射针头 | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染/菌落形成单位 |
| Middlebrook 7H10 琼脂基础培养基 | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | 菌落形成单位 |
| Middlebrook 7H9 肉汤基础培养基 | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | 分枝杆菌液体培养 |
| 改良金胺 O 染色液及脱色剂 | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | 抗酸杆菌染色 |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染 |
| 培养皿，92 × 16 mm（每袋20个） | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | 菌落形成单位 |
| 佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA） | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | 巨噬细胞培养 |
| 吐温 80，Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | 分枝杆菌液体培养 |
| RPMI-1640，Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | 巨噬细胞培养 |
| 无菌细胞涂布棒，L 形 | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | 菌落形成单位 |
| T25 细胞培养瓶，斜颈，带滤膜盖，无菌，Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | 分枝杆菌液体培养 |
| THP-1 细胞系 | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | 巨噬细胞培养 |
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