快速高效地定量细胞内结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的生长对于开发更有效的结核病（TB）治疗方案至关重要。本方案描述了一种基于液体培养基的比色检测方法，利用自动化液体培养系统来定量经候选宿主导向疗法处理的巨噬细胞中结核分枝杆菌（Mtb）的生长情况。
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摘要
摘要
Mycobacterium tuberculosis（Mtb）是结核病（TB）的致病菌，在新冠疫情出现之前，曾是全球最致命的传染病病原体。Mtb 已经进化出在宿主细胞内长期存活、逃避免疫系统防御的能力，并对多种抗结核药物产生了耐药性。解决耐药问题的一种策略是寻找已获批准的 现有药物，这些药物能够增强宿主对 Mtb 的免疫应答。这些药物随后可被重新用于作为辅助性的宿主导向疗法（HDT），以缩短治疗周期并帮助克服抗生素耐药性。
在巨噬细胞内定量结核分枝杆菌（Mtb）的生长是评估潜在宿主导向疗法（HDT）的关键环节。测量Mtb生长的金标准是在琼脂平板上计数菌落形成单位（CFU）。该方法耗时较长且劳动强度大，不适合药物的快速筛选。本方案中，采用了一种自动化的液体培养系统——该系统通常用于临床标本中Mtb的检测——并将其改进用于宿主导向疗法的临床前筛选。本研究评估了该液体培养检测系统用于研究经HDT处理后巨噬细胞内Mtb生长的能力。所测试的HDT包括全反式维甲酸（AtRA），分别以游离形式和包载于聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）微粒中的形式，以及干扰素-γ与利奈唑胺的联合用药。相较于CFU法，这种自动化液体培养技术的优势包括操作简便、制备过程劳动强度低，以及获得结果更快（5–12天，而琼脂平板法需21天或更长时间）。
引言
Mycobacterium tuberculosis（Mtb）是结核病的致病菌，2019年在全球范围内是导致死亡人数最多的传染病1。为了逃避宿主免疫防御，Mtb会破坏巨噬细胞和树突状细胞（DCs）等天然免疫细胞的抗分枝杆菌活性，从而在细胞内长期存活并进行复制2。目前尚无有效预防成人肺结核的疫苗，且耐药菌株不断出现，凸显了开发新疗法的紧迫性。
辅助性宿主导向疗法（HDT）可缩短治疗时间并有助于克服耐药性3HDT候选药物的临床前评估 体外 确定巨噬细胞内分枝杆菌杀菌活性通常依赖于在固体琼脂平板上通过菌落形成单位（CFU）定量结核分枝杆菌（Mtb）的生长。该方法耗时长、劳动强度大，不适用于药物的快速筛选。目前，商业化的自动化液体培养基微生物检测系统在临床微生物学实验室中更为常用，用于临床标本中结核分枝杆菌及其他分枝杆菌物种的检测及其药物敏感性试验。4。这些仪器通过检测细菌代谢活性引起的培养基物理变化（如CO₂浓度变化）来间接测量细菌生长。2 或 O2 随时间监测的水平或压力5检测读数为阳性出现时间（TPP），既往研究已表明其与结核病患者痰标本中结核分枝杆菌（Mtb）菌....
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方案
本方案中所述实验使用结核分枝杆菌（Mtb）的减毒H37Ra菌株进行，该菌株可在生物安全二级（Containment Level 2）实验室中操作。所有活分枝杆菌的操作均在II级生物安全柜（BSC）中进行。实验流程设计旨在尽量减少气溶胶的产生。真核细胞培养（THP-1细胞）同样在II级生物安全柜中进行。实验室已开展风险评估，并确保所有操作均符合机构及国家的生物安全法规。本方法采用人单核细胞THP-1细胞系进行（步骤1）。在感染分枝杆菌前，细胞经佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）刺激后分化为巨噬细胞。
1. 细胞培养
- 在添加了10%白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC）增补剂和0.05%聚山梨酯80的Middlebrook 7H9（MB）液体培养基中，将H37Ra种子液扩增至对数生长期。将H37Ra菌种以1 mL分装量储存于-80 °C 可保存于冷冻机中长达1年。
- 解冻一支1 mL的Mtb-H37Ra冻存管，将其转移至含有9 mL添加补充剂的MB培养基的T25培养瓶中，瓶口配备滤膜盖，操作时间约为计划实验前1周。置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育。 37 °C 在静态培养箱中培养5-7天。
- 在T75培养瓶中，使用添加了未灭活的10%胎牛血清（完全RPMI）的RPMI-1640培养基，在CO₂培养箱中培养THP-1细胞2 5% CO₂湿润培养箱2/37 °C 每周传....
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结果
本研究中使用的自动液体培养仪可监测CO2 每10分钟检测一次水平。通过比色法测量仪器瓶底部传感器的颜色变化，并以反射率单位表示。随后，仪器软件应用检测算法计算阳性所需时间（TTP），即从接种之日起至培养物被标记为阳性所需的天数图1A）。TTP 与 log 之间呈负相关关系10菌落形成单位（通过琼脂平板法测定）12 初始接种物中的情况如图所示 图1B当在存在或不存在药理学抑制剂的条件下，以感染复数（MOI）1-2 至 5-10 感染巨噬细胞后，结核分枝杆菌（Mtb）在巨噬细胞内的生长情况图1C采用自动化培养法与固体琼脂平板菌落计数法进行比较时，两种方法所得结果之间存在显著相关性（图1D）。为了直观显示结核分枝杆菌（Mtb）的生长情况，根据上述公式计算TTP的百分比变化，即将感染巨噬细胞后最多8天内的TTP值与初始.......
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讨论
作者已采用本方案中所述的液体培养法，监测结核分枝杆菌（Mtb）在单核细胞来源的巨噬细胞、肺泡巨噬细胞以及经PMA诱导分化的THP-1细胞中的生长情况11,16,17。该技术也可经修改后用于非贴壁细胞12。最近，该仪器还被用于临床前研究，以评估吸入性全反式维甲酸（AtRA）作为结核病宿主导向治疗（HDT）的效果17。本方案中的关键步骤包括：（1）通过抗酸染色（AFB染色）控制Mtb的摄取，以消除因药物预处理导致的吞噬作用差异等因素的影响，并尽量减少细胞死亡，而较低的感染复数（MOI）下细胞死亡的可能性较小；（2）根据MOI的不同，细胞裂解液可能需要稀释，以最大化检测的动态范围。将TTP控制在约5–12天范围内，可获得可重复的实验结果。
在本实验方案中，减毒的结核分枝杆菌H37Ra被用作毒力菌株Mtb的替代.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由爱尔兰科学基金会（SFI 08/RFP/BMT1689）、爱尔兰卫生研究委员会 [HRA-POR/2012/4 和 HRA-POR-2015-1145] 以及都柏林皇家城市医院信托基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| IX51 荧光显微镜 | Olympus, Japan | N/A | 抗酸杆菌检测与成像 |
| 2 mL 微量离心管，平底，螺口盖，无菌 | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染 |
| 5 mL 注射器，鲁尔锁扣 | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染/菌落形成单位 |
| 50 mL 管，无菌 | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染 |
| 全反式维甲酸（ATRA）≥98%（HPLC） | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | 宿主导向治疗候选药物 |
| BacT/ALERT 3D 微生物检测系统 | Biomerieux (Hampshire, UK) | 247001 | 基于肉汤的比色检测系统 |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP 营养补充剂 | Biomerieux (Hampshire, UK) | 414997 | 基于肉汤的比色检测实验 |
| BACT/ALERT MP 培养瓶 | Biomerieux (Hampshire, UK) | 419744 | 基于肉汤的比色检测实验 |
| BD BBL Middlebrook ADC 增菌液，20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | 分枝杆菌液体培养 |
| BD BBL Middlebrook OADC 增菌液，20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | 菌落形成单位 |
| 细胞刮刀，25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | 收集巨噬细胞裂解物 |
| Corning 注射器滤器，0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | 裂解缓冲液的灭菌 |
| 盖玻片（硼硅酸盐），24 × 50 mm，#1.5 厚度 | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| 放线菌酮（Cycloheximide），来源于微生物 | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | 菌落形成单位 |
| Dako 荧光封片介质 | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | 抗荧光淬灭封片剂 |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染 |
| 胎牛血清，Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | 巨噬细胞培养 |
| 甘油，Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | 菌落形成单位 |
| Hoescht 33342（双苯并咪唑 H 33342 三盐酸盐） | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | 细胞核染色剂 |
| IFNγ，重组人源 | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | 宿主导向治疗候选药物 |
| Labtek 2 孔腔室载玻片，无菌，Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染 |
| L-天冬酰胺，无水 | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | 菌落形成单位 |
| 利奈唑胺 | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | 抗生素 |
| Microlance 25 G 皮下注射针头 | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染/菌落形成单位 |
| Middlebrook 7H10 琼脂基础培养基 | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | 菌落形成单位 |
| Middlebrook 7H9 肉汤基础培养基 | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | 分枝杆菌液体培养 |
| 改良金胺 O 染色液及脱色剂 | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | 抗酸杆菌染色 |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | 巨噬细胞的结核分枝杆菌感染 |
| 培养皿，92 × 16 mm（每袋20个） | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | 菌落形成单位 |
| 佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA） | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | 巨噬细胞培养 |
| 吐温 80，Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | 分枝杆菌液体培养 |
| RPMI-1640，Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | 巨噬细胞培养 |
| 无菌细胞涂布棒，L 形 | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | 菌落形成单位 |
| T25 细胞培养瓶，斜颈，带滤膜盖，无菌，Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | 分枝杆菌液体培养 |
| THP-1 细胞系 | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | 巨噬细胞培养 |
参考文献
- WHO. Global Tuberculosis Report. World Health Organization. , Geneva. (2020).
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N.
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重印与许可
