转座子插入测序作为解析Burkholderia gladioli在绒毛丽金龟（Lagria villosa）体内共生定植因子的工具

摘要

这是一种用于鉴定候选昆虫定植因子的改良方法 伯克霍尔德菌属 有益共生菌。通过转座子突变构建的随机突变文库感染甲虫宿主，比较定植后的文库复杂性与对照组培养的文库复杂性 体外.

摘要

通过操控基因活性来推断其功能，是理解大多数生物过程遗传基础的重要工具。分子微生物学的进步催生了多种用于基因操控的诱变技术。其中，转座子插入测序（Tn-seq）是一种有价值的非靶向方法，可同时评估大量候选基因的功能性。该技术在鉴定 多种致病微生物及少数有益共生菌在真核宿主中定植的分子机制

在此，Tn-seq 被确立为一种用于鉴定共生定植因子的方法 洋葱伯克霍尔德菌 甲虫的共生体 Lagria villosa通过接合，Tn5转座子介导的抗生素抗性盒插入 在基因组的随机位点进行 B. gladioli为了确定基因破坏对细菌定植甲虫宿主能力的影响，对所获得的突变菌株进行了体内竞争实验。 B. gladioli 转座子突变文库接种于甲虫卵上，同时培养对照组 体外 在液体培养基中。在给予足够时间定植后，从其中提取DNA 体内 和 体外 扩增文库。根据DNA文库构建方案，对DNA样本进行转座子插入测序的准备。筛选包含转座子插入端及侧翼细菌DNA的DNA片段，并通过从转座子插入端向外测序来确定突变位点。最后，通过分析和比较各突变体在不同样本间的频率 体内 和 体外 通过文库分析，可以预测特定共生菌基因在甲虫定植过程中的重要性。

引言

洋葱伯克霍尔德菌 可与……形成共生关系 Lagria villosa 甲虫，在抵御昆虫宿主的微生物拮抗物方面发挥着重要作用^4,5,6雌性甲虫体内携带多种菌株 B. gladioli 在生殖系统附属的特化腺体中。雌性在产卵时涂抹 B. gladioli 卵表面产生抗菌化合物的细胞 B. gladioli 抑制昆虫病原真菌感染^4,6在胚胎发育晚期或幼虫孵化后初期，细菌会定植于幼虫背侧表皮的内陷结构中。尽管共生菌具有这种特异性的定植位置和垂直传播途径， L. villosa 可能也能够获得 B. gladioli 从环境中水平方向⁴此外，至少有三种菌株 B. gladioli 已发现与……相关联 L. villosa^4,6. 其中 B. gladioli Lv-StA 是唯一可进行培养的菌株 体外.

B. gladioli Lv-StA 的基因组大小为 8.56 Mb⁶，包含 7,468 个基因。在这些基因中，哪些对 B. gladioli 细菌定植甲虫宿主至关重要？为回答这一问题，我们采用了转座子插入测序（Tn-seq），这是一种用于鉴定条件性必需微生物基因的探索性方法^1,2,3。我们利用 Tn5 转座子构建了 B. gladioli Lv-StA 的突变体文库。通过从 Escherichia coli 供体细胞向 B. gladioli Lv-StA 的接合转移，携带 Tn5 转座子以及两侧为反向重复序列所包围的抗生素抗性盒的 pRL27 质粒得以转移（图 1）。由此，我们获得了一组突变体，各自独立地破坏了 3,736 个共生菌基因（图 2）。

突变体库被感染至甲虫卵以鉴定定植因子，同时作为对照也进行了培养 体外 在KB培养基中。在给予足够时间定植后，收集孵化的幼虫并混合进行DNA提取。含有转座子插入片段及侧翼基因组区域的DNA片段 B. gladioli 使用改良的DNA文库构建方案对Lv-StA进行筛选以用于测序。经测序读段质量处理后，采用DESeq2进行分析，以鉴定对特定基因发挥关键作用的基因 B. gladioli Lv-StA 定植于结肠 L. villosa 通过卵表面传播时的幼虫

方案

1. 培养基与缓冲液的配制

1. 按照表1配制KB和LB培养基及琼脂平板，并在121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟。
   1. 在接种E.coli WM3064 + pRL27前，向已灭菌的LB液体培养基中加入50 µg/mL过滤除菌的卡那霉素和300 µM过滤除菌的2,6-二氨基庚二酸（DAP）。
   2. 向已灭菌的KB琼脂培养基中加入50 µg/mL过滤除菌的卡那霉素，用于制备筛选成功的B. gladioli Lv-StA接合子所需的平板。
2. 通过混合以下组分配制1×磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 8 g/L，KCl 0.201 g/L，Na₂HPO₄ 1.42 g/L，KH₂PO₄ 0.272 g/L。将盐类溶解于蒸馏水中，使用前在121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟。室温保存。
3. 通过将以下组分溶解于蒸馏水中，配制2×结合与洗涤缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和2 M NaCl。使用前经滤膜除菌。室温保存。
4. 将10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和0.1 mM EDTA溶解于重蒸水中，配制1×低TE缓冲液。在121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟以灭菌。室温保存。

2. 接合生成转座子突变文库

图 1：接合实验操作步骤。 接合受体菌 Burkholderia gladioli Lv-StA（红色）和携带 pRL27 质粒的供体菌 Escherichia coli（粉色）分别在添加了卡那霉素和 DAP 的 KB 琼脂和 LB 培养基中培养。在 30 °C 下进行 12–18 小时的接合质粒转移后，将转接合子 B. gladioli 细胞在含有卡那霉素的 KB 培养基上筛选并合并收集。缩写：DAP = 2,6-二氨基庚二酸；Kan = 卡那霉素。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 在无菌操作台中，将含有卡那霉素和DAP的10 mL LB培养基接种新鲜的Escherichia coli WM3064 + pRL27供体菌株；将5 mL KB培养基接种Burkholderia gladioli Lv-StA受体菌。在30 °C、250 rpm条件下振荡培养过夜。
2. 过夜培养后，分别取4 mL上述两种菌液，在9,600 × g条件下离心6分钟以收集菌体，弃去上清液。
3. 在无菌操作台中，用含DAP的KB培养基洗涤菌体沉淀，并最终分别重悬于4 mL KB + DAP培养基中。
4. 在新的15 mL离心管中，混合250 µL洗涤后的E. coli供体菌液与1 mL洗涤后的B. gladioli Lv-StA受体菌液。
5. 取10 µL上述接合菌液混合物点种于含DAP的KB琼脂平板上。将平板置于无菌操作台中室温静置1小时，随后将接合点朝上，在30 °C培养12–18小时。
   注意：可根据目标菌种调整接合时间。然而，较长的接合时间会增加双插入或质粒整合到基因组的风险。对于生长缓慢的细菌，可适当延长接合时间。
6. 培养结束后，在无菌操作台中向平板中加入2–4 mL 1× PBS，使用细胞刮刀将生长的细菌接合斑从琼脂表面刮下，并将菌液转移至2 mL微量离心管中。
7. 在9,600 × g条件下离心2分钟以收集菌体，弃去上清液；用1 mL 1× PBS通过吹打方式洗涤菌体沉淀两次，最后将最终菌体沉淀重悬于1200 µL 1× PBS中。若混合菌液中细胞数量超过1 × 10⁴，则在涂板前进行适当稀释。
8. 充分混匀后，取200 µL菌液均匀涂布于添加卡那霉素的大尺寸KB琼脂平板（如需要，可使用6个或更多平板），30 °C过夜培养。
   注意：目标突变菌落在选择性琼脂平板上通常在30小时内出现。由于抗生素抗性标记的存在，只有发生突变的菌落才能在选择性平板上生长，因此所有出现的菌落均预期为成功的接合子。
9. 统计三个平板上的接合子菌落总数，并据此推算所有平板中获得的突变体总数。为提高获得代表性突变文库的可能性，应确保菌落总数显著高于基因组中基因总数的若干倍。为验证接合是否成功，可按照第3节所述方法，对10–20个菌落进行PCR检测插入盒的存在。
   注意：理想情况下，菌落数量应至少达到全基因组基因数的10倍，本例中即>75,000个突变体。然而，准确估算一个完全代表性文库所需的菌落数通常具有挑战性。目前尚无法明确已突变的独特基因数量，因为必需基因的突变无法被检出，同一基因可能存在多个不同的突变位点，且Tn5转座子诱导的突变并非完全随机。
10. 在无菌操作台中，向琼脂平板中加入1–2 mL 1× PBS，刮取平板上的菌落，并将所有刮取的菌液合并至50 mL离心管中。充分涡旋混匀文库后，将4 mL混合菌液分装至多个冻存管中，每管加入1 mL 70%甘油，于-80 °C保存。

3. PCR 和凝胶电泳验证 B. gladioli Lv-StA 中插入片段的成功整合

1. 为确认插入片段的存在，从步骤2.9的筛选平板中挑取单个突变菌落，并使用表2中所列引物对插入盒进行PCR扩增。按照表3配制PCR预混液，并根据表4设定PCR仪的反应条件。
2. 将PCR产物通过电泳在1.6%琼脂糖凝胶上进行检测（250 V，40分钟），以确认扩增的DNA片段长度是否为预期的1580 bp。

4. 蚕卵突变体文库感染

1. 文库洗涤步骤
   1. 将制备好的突变文库分装样品置于冰上解冻。在2,683 × g 10分钟，弃去上清液。在无菌操作台中，用4 mL 1×PBS洗涤细胞，以去除残留的培养基。将细胞重悬于4 mL 1×PBS中。
   2. 使用细胞计数板对文库的等分试样进行细胞计数。将文库的一部分稀释至 2 × 10⁶ 细胞/µL，溶于1× PBS中。
   3. 涡旋混匀文库分装液，确保整个文库均匀混合，再取所需体积。
2. 卵块消毒与 在体 感染
   1. 选择一个 L. villosa 卵块。统计卵的数量，若卵块包含的卵超过100个，则继续后续操作。
   2. 对整个卵块进行灭菌。
      1. 加入 200 µL 70% 乙醇，轻柔清洗卵子 5 分钟。移除乙醇，用高压灭菌水清洗卵子两次。
      2. 加入200 µL 12%次氯酸钠（NaOCl）溶液，轻轻漂洗卵30秒。立即去除次氯酸钠溶液，并用200 µL高压灭菌水将卵再漂洗三次。
   3. 感染 2 × 10⁶ 每枚卵接种2.5 µL经洗涤的突变体文库，细胞浓度为每微升若干细胞。
   4. 感染的甲虫幼虫孵化两天后，收集100条2龄幼虫^nd 每1.5 mL离心管分装一定龄期幼虫，于-80 °C保存。
3. 体外 突变文库对照
   1. 在无菌操作台中，接种 250 µL 的 2 × 10⁶ 含卡那霉素的10 mL KB培养基中，每微升含有洗涤后的突变文库细胞。
   2. 孵育 体外 30 °C 下培养突变株 20 小时。
      注意：计算孵育时间，使其与野生型（WT）的大致世代数相匹配 B. gladioli Lv-StA 体内 在定植期间。
   3. 孵育20小时后，加入等体积的70%甘油 体外 突变体培养物在 -80 °C 保存。

5. 感染的甲虫和 体外 突变体文库DNA提取

注意：DNA 提取采用 DNA 和 RNA 纯化试剂盒，具体操作步骤简要概述如下，严格按照试剂盒生产商提供的方案进行。

1. 将收集的幼虫（每微量离心管最多4 mg）加入1–2 mL液氮，用研杵研磨匀浆。
2. 解冻 体外 从甘油菌种中在冰上培养突变株菌液。在9,600 × g 在细胞裂解前孵育10分钟。
3. 加入 300 µL 组织与细胞裂解液至 体外 和 体内 样品中加入5 µL浓度为10 mg/mL的蛋白酶K，混匀后于60 °C孵育15分钟，随后置于冰上3–5分钟。
4. 加入150 µL蛋白质沉淀试剂至裂解液中，充分涡旋混匀。在9,600 × g 10 分钟。
5. 将上清液转移至1.5 mL离心管中。向上清液中加入500 µL异丙醇，轻轻倒置管子至少40次，然后在-20 °C孵育1小时或过夜。
6. 通过在 9,600 × g 条件下离心沉淀 DNA g 10分钟。弃上清，向DNA沉淀中加入预冷的70%乙醇。
7. 在 ≥10,000 × g 条件下离心 g 5分钟。弃去上清液，将样品在空气中干燥至少1小时。
8. 将DNA从 体外 和 体内 100 µL低TE缓冲液中的样品
9. 将样品在 -20 °C 下保存。

6. 测序文库制备

注意：DNA文库构建的实验方案及试剂根据DNA文库构建试剂盒制造商提供的说明书进行过调整和修改。

图2：DNA文库构建步骤示意图。在DNA片段化和接头连接之后，改进的实验流程包含链霉亲和素磁珠筛选步骤，用于富集含有插入盒的DNA片段。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 将样品稀释至浓度为 20 ng/µL、体积为 100 µL，并置于冰上保存。
2. 使用超声波破碎仪对体内（in vivo）和体外（in vitro）样品的 DNA 进行剪切。将超声波破碎仪设置为 70% 功率。短暂涡旋混匀样品后，剪切 1 分 30 秒。
   注意：不同型号的超声波破碎仪其设置参数可能有所不同。本实验中，DNA 片段大小为 200–400 bp，适用于 150 bp 双端测序方法（参见步骤 9.1）。可根据实验需求调整剪切参数。
3. 检测 DNA 是否被剪切至目标片段大小范围（本实验中为 200–400 bp）。取 5 µL 未剪切和已剪切的 DNA，与上样缓冲液按 1:1 比例混合后，加样至 1.6% 琼脂糖凝胶中，在 250 V 条件下电泳 40 分钟（图 3A、B）。
4. 准备用于接头连接的片段末端
   1. 向 50 µL 剪切后的 DNA 中加入文库构建试剂盒提供的末端修复试剂：3 µL 酶混合液和 7 µL 反应缓冲液，用移液器充分混匀。将热循环仪设置为带加热盖模式（加热盖温度 ≥ 75 °C），先在 20 °C 孵育 30 分钟，再在 65 °C 孵育 30 分钟，最后保持在 4 °C。
5. 接头连接
   1. 进行接头连接时，向末端修复产物中加入以下试剂：30 µL 连接主混合液（Ligation Master Mix）、1 µL 连接增强剂（Ligation Enhancer）和 2.5 µL 稀释后的接头（Adapter）。用移液器充分混匀，将样品在热循环仪中于 20 °C 孵育 15 分钟，孵育期间关闭加热盖。
   2. 孵育 15 分钟后，加入 3 µL 酶（尿嘧啶 DNA 糖基化酶 + DNA 糖基化酶-裂解酶 Endonuclease VIII）（参见材料表）。用移液器充分混匀，将样品在热循环仪中于 37 °C 孵育 15 分钟，加热盖温度设置为 ≥ 47 °C。
      注意：本步骤可暂停，样品可在 -20 °C 条件下保存。
6. 对连接接头的 DNA 进行片段大小选择，目标片段大小为 250 bp
   1. 涡旋混匀磁珠溶液（参见材料表），使用前于室温放置 30 分钟。
   2. 向 96.5 µL 接头连接产物中加入 0.3 倍体积的磁珠，充分移液混匀。将磁珠混合物孵育 5 分钟。
      注意：磁珠溶液中的盐和聚乙二醇有助于 DNA 片段在磁珠表面沉淀。较低的磁珠与 DNA 比例可使仅较大的 DNA 片段结合至磁珠。本实验中，长度大于 250 bp 的 DNA 片段会结合到磁珠上。
   3. 将离心管置于磁力架上使磁珠沉降，去除不需要大小的 DNA 片段。静置 5 分钟后，将上清液转移至新的微量离心管中（保留上清液）。
   4. 向上清液中加入 0.15 倍体积的新鲜磁珠，充分移液混匀。孵育 5 分钟后，将离心管置于磁力架上使目标 DNA 结合的磁珠沉降。等待 5 分钟后弃去上清液（保留磁珠）。
      注意：该磁珠与 DNA 的比例可使目标大小（250 bp）的片段有效结合。
   5. 将磁珠置于磁力架上，加入 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇，静置 30 秒。小心移除乙醇洗涤液，避免扰动磁珠。重复此步骤一次。
   6. 最后一次洗涤后，彻底去除残留乙醇，然后将磁珠在空气中干燥约 2 分钟，直至磁珠表面呈现光泽但未完全干透。切勿过度干燥。
   7. 将离心管从磁力架上取下，加入 17 µL 10 mM Tris-HCl 或 0.1x TE（低 TE 缓冲液）。用移液器吹打约 10 次混匀，室温孵育 2 分钟。
   8. 将离心管重新置于磁力架上，静置 5 分钟。待磁珠完全沉降后，将 DNA 上清液转移至新的离心管中。
7. 第一轮 PCR（PCR I），用于为含有插入盒的 DNA 片段添加生物素标签
   1. 使用转座子特异性的生物素化引物（表 5）和索引引物（index primer），为含有 Tn5 插入盒的 DNA 片段添加生物素标记。按照表 6配制 PCR 主混合液，并根据表 7列出的热循环仪程序进行扩增。
8. 第一轮 PCR 产物纯化（不进行片段大小选择）
   1. 涡旋混匀 0.9 倍体积的磁珠，纯化前于室温放置至少 30 分钟。
   2. 向 PCR 产物中加入 0.9 倍体积的磁珠，充分混匀。
   3. 将磁珠置于磁力架上使其沉降。
   4. 移除上清液，用 200 µL 新鲜配制的 80% 乙醇洗涤磁珠结合的 DNA 两次。
   5. 洗涤后去除乙醇，将磁珠在空气中干燥至表面有光泽但不过度干燥。
   6. 加入 32 µL 10 mM Tris-HCl 或 0.1X TE（低 TE 缓冲液），孵育 5 分钟。将混合物重新置于磁力架上，将上清液转移至新的微量离心管中。
9. 将生物素化 DNA 片段结合至链霉亲和素磁珠
   1. 将 32 µL 链霉亲和素磁珠重悬于 1x 结合与洗涤缓冲液（Bind-and-wash buffer）中。在磁力架上用该缓冲液洗涤磁珠三次。
   2. 加入 32 µL 2x 结合与洗涤缓冲液并重悬磁珠。向其中加入 32 µL 经纯化的第一轮 PCR 产物。充分混匀后，室温孵育 30 分钟。
   3. 将磁珠-DNA 混合物置于磁力架上 2 分钟。移除上清液，因为含有插入边缘的生物素标记 DNA 已结合至磁珠表面的链霉亲和素。
   4. 用 500 µL 1x 结合与洗涤缓冲液洗涤磁珠一次，再用 200 µL 低 TE 缓冲液洗涤一次。将结合 DNA 的磁珠重悬于 17 µL 低 TE 缓冲液中。
10. 第二轮 PCR（PCR II），为含有插入盒边缘的片段添加接头
    1. 根据表 8所示配制主混合液，使用表 5中列出的索引引物和修饰的通用 PCR 引物。向 PCR 混合液中加入上一步获得的 15 µL DNA 结合磁珠。热循环仪程序参见表 7。
11. 按照本方案第 6.8 步所述方法对 PCR 产物进行纯化（不进行片段大小选择）。将最终 DNA 产物洗脱于 30 µL 分子生物学级水中。
12. 将样品储存于 -20 °C，用于后续测序。

7. 测序与分析

1. 使用高通量测序技术对文库进行测序。根据转座子文库的大小调整测序深度，如下所述。使用 FastQC⁷ 评估读段质量。选择在读段 5' 端包含 Tn5 插入边界的读段，并使用 Cutadapt⁸ 和/或 Trimmomatic⁹ 去除插入边界序列。
   注意：本实验采用双端测序策略，每条读段目标长度为 150 bp，总共 800 万条读段。为获得具有代表性的数据集，需确保测序读段总数超过文库中可能存在的突变体最大数量，即步骤 2.9 中估算的总菌落数。作为参考，本方案的目标测序深度为文库最大可能大小的 40 倍。其他使用 Tn-seq 实现类似目的的成功研究中，测序读段总数约为相应突变体文库中唯一插入事件实际数量的 25 倍^22,23。
2. 考虑到基因末端的突变通常不具备功能破坏性，从参考基因组 GFF 文件的基因注释两端各截去 5%。使用 Bowtie2¹⁰ 将修剪后的读段比对至参考基因组。
3. 根据比对生成的 BAM 文件中唯一的 5' 位置数量，计算插入事件的总数。
4. 使用 FeatureCounts¹¹，获取每个重复样本中被插入的基因数量。
5. 在 RStudio 中使用 DESeq2¹² 软件包，计算不同条件下突变体丰度的差异。

结果

宿主相关细菌可利用多种因子建立与宿主的关联，包括介导黏附、运动性、趋化性、应激反应或特异性转运蛋白的因子。尽管已有研究报道了多种细菌中参与病原体-宿主相互作用的重要因子^{13,14,15,16,17,18}，包括伯克霍尔德菌属（Burkholderia）中的部分菌种^19,20，但针对有益共生菌定植所依赖的分子机制的研究仍较为有限^21,22,23。本研究采用转座子插入测序技术，旨在鉴定使B. gladioli定植于L. villosa甲虫的分子因子。

使用携带Tn5转座子及由反向重复序列侧翼包围的卡那霉素抗性盒的pRL27质粒，进行转座子介导的诱变。将该质粒导入目标菌株中 B. gladioli 通过与质粒供体接合的Lv-StA细胞 大肠杆菌 WM3064 菌株（如图所示） 图1。结合完成后，含有结合产物的混合物 B. gladioli 受体和 E. coli 将供体细胞接种于含有卡那霉素的选择性琼脂平板上。平板中缺乏二氨基庚二酸（DAP）导致供体细胞无法生长 E. coli 细胞，卡那霉素的存在用于筛选成功转化的细胞 B. gladioli Lv-StA 转接合子。混合的 B. gladioli 使用改良的DNA文库制备试剂盒和定制引物，对从100,000个接合子菌落中收集获得的Lv-StA突变体文库进行测序文库制备。 图2 重点介绍了DNA文库构建步骤。测序获得400万对读长，共检测到7,468个基因中的3,736个基因 B. gladioli Lv-StA 被破坏。

为了鉴定在宿主中定植能力缺陷的突变株， B. gladioli Lv-StA突变体文库被感染于甲虫卵上并进行培养 体外 在KB培养基中作为对照。 体内 定植瓶颈大小在实验前进行计算。已知数量的 B. gladioli Lv-StA细胞被用于感染甲虫卵，并通过将每头初孵一龄幼虫的悬浮液进行涂板，计数每头幼虫的菌落形成单位，以获得定植细胞的数量。这些计算旨在确保定植细胞的数量足以评估文库中全部或高比例突变体在宿主中定植的能力。此外，两次生长间隔时间 体外 和 体内 基于细菌世代数对不同条件下的样本进行了归一化处理，以确保这些样本具有可比性。

卵孵化后，共在13个池中收集到1,296条幼虫。相应的 体外 突变菌株培养后以甘油菌形式保存。提取突变菌株的DNA 体内 和 体外 提取并使用超声波破碎仪对突变文库进行片段化处理。 图3 显示剪切后DNA的片段大小分布，大多数片段长度在100至400 bp之间，符合预期。随后按照改良的DNA文库构建流程进行测序。在实验流程的每一步均检测残留DNA浓度，以确保操作正确并追踪DNA损失情况。质量检测（见 材料表) 在测序前发现，DNA文库中含有出乎意料的大片段（>800 bp）的DNA片段，且这一现象在 体内 文库。鉴于在测序通道中优化片段聚类的难度较大，有必要将测序深度增加至1000万对读长 体内 文库中获得所需的读段数量。测序结果分析显示，平均每个样本产生400万条读段。 体内 文库和3.1百万条reads 体外 文库在Read-1的5'端含有转座子末端表9），这对本实验而言是可接受的。24,224个唯一插入位点在全基因组中的分布情况 B. gladioli 原始文库中的基因组显示在 图4使用DESeq2进行的分析显示，271个突变体的丰度在两组之间存在显著差异 体内 和 体外 条件。

图3：突变体和DNA文库的琼脂糖凝胶。 (A) 琼脂糖凝胶电泳图，第x泳道为未剪切的突变体DNA，以及1 kbp DNA ladder作为分子量标准。B) 含剪切DNA文库的凝胶。第一泳道中DNA分子量标准的条带大小在左侧标示。前三个泳道a、b和c含有剪切后的DNA片段 体内 文库. 泳道 d、e、f 和 g 含有剪切的 DNA 片段 体外 文库 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 4：原始文库中在Burkholderia gladioli Lv-StA 基因组四个复制子上的唯一插入位点位置。 横轴上的每一条竖线代表一个插入位点，纵轴上竖线的高度表示与该位点相关的测序读段数量。请注意，两条染色体和两个质粒均按全长展示，因此横轴的比例尺各不相同。请点击此处查看该图的放大版本。

King’s B 培养基/琼脂
蛋白胨（大豆）	20 g/L
K2HPO4	1.5 g/L
MgSO4·7H2O	1.5 g/L
琼脂	15 g/L
溶于蒸馏水中
LB 培养基/琼脂
胰蛋白胨	10 g/L
酵母提取物	5 g/L
NaCl	10 g/L
溶于蒸馏水中

表1：培养基成分。

编号	引物	序列		PCR 退火温度 (°C)
1	tpnRL17–1RC	5’-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3’		58.2
2	tpnRL13–2RC	5’-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3’

表2：用于验证接合成功与否的引物。

组分	体积 (μL)
HPLC纯化水	4.92
10x Buffer S（高特异性）	1
MgCl2 (25 mM)	0.2
dNTPs (2 mM)	1.2
引物1 (10 pmol/µL)	0.8
引物2 (10 pmol/µL)	0.8
Taq (5 U/µL)	0.08
总Mastermix	9
模板	1

表3：用于验证接合反应成功与否的PCR预混液。 缩写：HPLC = 高效液相色谱；dNTPs = 脱氧核苷三磷酸。

步骤	温度 °C	时间	循环数
初始变性	95	3 min	1
变性	95	40 s
退火	58.2	40 s	30 至 35
延伸	72	1-2 min
最终延伸	72	4 min	1
保存	4	∞

表4：用于确认接合成功与否的PCR条件。

引物	序列		Tm °C	使用	来源
转座子特异性生物素化引物	5’-生物素-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3’		63.5	6.7.1. PCR I	自定义
修饰型通用PCR引物	5’- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3’		62	6.10.1. PCR II	自定义
索引引物	参考制造商手册			6.7.1. PCR I & 6.10.1. PCR II	NEBNext Illumina 多重引物（Index 引物试剂盒 1）
衔接器	参考制造商手册			6.5. 接头连接	NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒（适用于Illumina）

表5：DNA文库构建过程中PCR I和PCR II所用的引物与接头。

PCR 混合液	(µL)
接头连接的 DNA 片段	15
NEBNext Ultra II Q5 主混合液	25
Index 引物 (10 pmol/ µL)	5
转座子特异性生物素标记引物 (10 pmol/ µL)	5
总体积	50

表6：DNA文库构建——第一轮PCR主混合液。

步骤	温度	时间	循环次数
初始变性	98 °C	30 s	1
变性	98 °C	10 s	6 至 12
退火	65 °C	30 s
延伸	72 °C	30 s
最终延伸	72 °C	2 min	1
保存	16 °C	∞

表7：DNA文库构建——PCR I和II反应条件。

PCR 反应体系	(µL)
磁珠筛选后的 DNA	15
NEBNext Ultra II Q5 预混液	25
Index 引物	5
修饰的通用 PCR 引物	5
总体积	50

表8：DNA文库制备——PCR II主混合液。

文库		Invivo-1	Invivo-2	Invivo-3	Invitro-1	Invitro-2	Invitro-3	原始文库
读段数量（双端）		56,57,710	39,19,051	30,65,849	35,73,494	28,83,440	36,61,956	46,09,410
在Read-1的5'端含有转座子（Tn）边界的读段数量		54,15,880	37,31,169	29,36,247	33,00,499	27,35,705	33,50,402	41,53,270
Bowtie2总体比对率（%）（仅Read-1）		95.53%	83.71%	89.87%	80.79%	78.00%	73.06%	74.92%
唯一插入位点数量		8,539	4,134	7,183	18,930	18,421	20,438	24,224
被插入的基因数量		1575	993	1450	2793	2597	3037	3736

表9：各文库测序产出及转座子插入频率汇总。 缩写：PE = 双端测序。

讨论

为鉴定L. villosa甲虫与B. gladioli细菌共生互作中的重要宿主定植因子，构建了B. gladioli转座子突变体文库。本实验方案的主要步骤包括接合转化、宿主感染、DNA文库构建及测序。

由于许多伯克霍尔德菌（Burkholderia）菌株可通过接合转移进行遗传改造^24,25，携带转座子和抗生素插入盒的质粒已成功从大肠杆菌（E. coli）接合转入目标菌株B. gladioli Lv-StA。此前尝试通过电转化进行转化时，获得的B. gladioli转化子数量极低，甚至几乎无法获得。建议针对目标生物优化转化技术，以高效获得大量转化子。

一次接合反应及40个接合位点使 B. gladioli Lv-StA 中的3,736个基因发生中断。回顾来看，要中断大多数的7,468个基因并获得饱和文库，需要进行多轮接合反应。值得注意的是，接合过程中的孵育时间不得超过12–18小时，此时间点为 B. gladioli 指数生长期的末期。若使接合过程超过细菌细胞的指数生长期，将降低获得接合子的成功概率²⁶。因此，接合时间应根据细菌物种的生长特性进行调整。

为了成功开展涉及宿主中突变体文库感染的实验，重要的是在定植过程中评估细菌群体瓶颈大小，以及在感染前评估文库中突变体的多样性。^1,2,27在实验准备阶段，我们估算了必须感染的最少甲虫数量，以确保文库中的每种突变体都有较大概率被取样并成功定植。大致 体内 细菌世代时间 并计算了实验持续期间的传代次数。 体外 随后通过调整培养时间，使培养物生长至相近的传代次数。对于在其他非模式宿主中进行类似的感染实验，理想情况是能够维持实验室培养体系并持续获得宿主生物材料。

突变体文库培养完成后 体内 和 体外 并进行样品采集后，采用了一种改良的转座子插入测序DNA文库构建方案。该方案的修改之处在于设计了定制的PCR引物，并增加了PCR步骤，以富集含有插入盒的DNA片段。由于该方案经过定制，额外增加的PCR循环可能导致过度扩增，并在最终文库中产生接头-接头杂交片段。因此，建议在两次PCR之后进行一次最终纯化步骤（无需片段大小选择），以去除这些非特异性片段。尽管DNA文库的片段大小分布仍比预期更宽，但通过提高测序深度，可在生物信息学分析过程中过滤获得足够数据，最终得到满意的结果。

由于转座子介导的诱变在单次实验中可产生数千个随机插入，因此有可能构建一个饱和的突变体文库，其中包含除那些关键生长基因被破坏以外的所有突变体。鉴于其他关于伯克霍尔德菌属（Burkholderia sp.）必需基因研究的估算结果^28,29，我们很可能并未获得一个饱和的突变体文库。然而，非饱和文库仍有助于通过靶向诱变进一步研究多个候选基因。在开展实验前还需注意，某些转座子具有特定的插入靶位点，会导致基因组中某些位点的突变体富集³⁰。例如，Mariner转座子倾向于插入AT位点³¹，而Tn5转座子则表现出GC偏好性^32,33。在生物信息学分析过程中加入识别转座子插入热点的步骤，将有助于评估插入分布是否存在偏倚。

尽管容易遇到挫折，但设计良好的转座子插入测序实验可在单次实验中有效鉴定出细菌中大量条件性重要的基因。例如，通过结合转座子诱变与基因组学方法，已鉴定出Burkholderia seminalis中约十几个对抑制兰花叶坏死具有重要作用的基因³⁴。除Burkholderia外，利用转座子插入诱变方法，已在Apis mellifera（蜜蜂）的共生菌Snodgrassella alvi中鉴定出多个与黏附、运动性及转运相关的基因，这些基因被证实为重要的定植因子²²；同样，在Euprymna scolopes（夏威夷短尾乌贼）的共生菌Vibrio fischerii中也鉴定出类似的重要定植相关基因²³。

作为一种替代方法，转座子诱变后可使用选择性培养基对单个突变体进行筛选，而非测序。通过表型筛选或生物测定来鉴定缺陷性状（如运动能力、生物活性次级代谢产物的产生或特定营养缺陷型）是可行的。例如，对一种Burkholderia insecticola（已重新归类至Caballeronia属³⁵）的转座子突变体文库进行筛选，关键揭示了该共生菌利用运动相关基因在其昆虫宿主Riptortus pedestris中定植的机制³⁶。此外，通过转座子诱变结合表型筛选，已在Burkholderia caryophylli中鉴定出生物活性次级代谢产物caryoynencin的生物合成基因簇³⁷。在对Burkholderia pseudomallei进行转座子诱变和筛选后，发现了一株营养缺陷型突变体，该突变体可能是针对类鼻疽病（一种对人类和动物具有高度危险性的疾病）的减毒疫苗候选株³⁸。因此，转座子诱变结合测序是研究细菌分子特性的重要方法，尤其适用于解析病原性或互惠性共生关系中细菌与其宿主相互作用的关键机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,6-二氨基庚二酸	Alfa Aesar	B22391	用于 E.coli WM3064+ pRL27
琼脂	Roth	5210
琼脂糖	Biozym	840004
AMPure XP磁珠（磁珠 + 聚乙二醇 + 盐）	Beckman Coulter	A63880	第6.6步中的片段大小选择
次氯酸钠（NaOCl）12%	Roth	9062
Bowtie2 v.2.4.2			用于测序读段比对的生物信息学工具。参见正文参考文献10。
Buffer-S	Peqlab	PEQL01-1020	用于PCR
细胞刮刀	Sarstedt	83.1830
Cutadapt v.2.10			用于去除测序读段中特定接头序列的生物信息学工具。参见正文参考文献8。
DESeq2			RStudio软件包，用于分析突变体丰度差异。通常用于RNA测序分析。参见正文参考文献12。
DNA分子量标准（100 bp）	Roth	T834.1
dNTPs	Life Technology	R0182	用于验证接合转化成功的PCR
EDTA 二钠盐	Roth	8043
Epicentre MasterPure 完整DNA和RNA纯化试剂盒	Lucigen	MC85200
溴化乙锭	Roth	2218.1
FastQC v.0.11.8			用于评估测序数据质量的生物信息学工具。参见正文参考文献7。
FeatureCounts v.2.0.1			用于获取每个基因组特征读段计数的生物信息学工具。参见正文参考文献11。
甘油	Roth	7530
K2HPO4	Roth	P749
硫酸卡那霉素	Serva	26899
KCl	Merck	4936
KH2PO4	Roth	3904
MgSO4·7H2O	Roth	PO27
Na2HPO4	Roth	P030
NaCl	Merck	6404
NEBNext Illumina多重寡核苷酸接头（Index引物组1）	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒（适用于Illumina）	New England Biolabs	E7645S
蛋白胨（大豆）	Roth	2365	用于 Burkholderia gladioli Lv-StA KB培养基
peqGOLD 'Hot' Taq DNA聚合酶	VWR	PEQL01-1020	用于验证接合转化成功的PCR
培养皿 - 145 × 20 mm	Roth	XH90.1	用于筛选转接合子
培养皿 - 90 × 16 mm	Roth	N221.2
Qiaxcel（StarSEQ GmbH，德国）			DNA文库构建后的质量检测
链霉亲和素磁珠	Roth	HP57.1
Taq DNA聚合酶	VWR	01-1020
Trimmomatic v.0.36			用于剪切低质量读段及接头序列的生物信息学工具。参见正文参考文献9。
Tris-HCl	Roth	9090.1
胰蛋白胨	Roth	2366	用于 Escherichia coli WM3064+pRL27 LB培养基
超声破碎仪	Bandelin	GM 70 HD	用于DNA片段化
USER酶（尿嘧啶DNA糖基化酶 + DNA糖基化酶-裂解酶Endonuclease VIII）	New England Biolabs	E7645S	连接步骤6.5.2
酵母提取物	Roth	2363