三维细胞外囊泡的直接随机光学重建显微镜成像

摘要

直接随机光学重建显微镜（dSTORM）可用于突破光学显微镜的典型衍射极限，从而在纳米尺度下观察外泌体。该技术可在二维和三维条件下用于外泌体的表征。

摘要

所有细胞类型均可释放细胞外囊泡（EVs），其在细胞信号传导和稳态维持中发挥重要作用。由于EVs直径较小（40–250 nm），低于常规光学显微镜的衍射极限，因此对其成像通常需要借助间接方法。我们开发了一种基于超分辨率显微镜的EVs可视化技术，可在二维和三维空间中突破衍射极限。利用该方法，我们能够以XY轴方向±20 nm、Z轴方向±50 nm的分辨率解析EVs的三维形态。综上所述，我们建议将超分辨率显微镜作为EVs（包括外泌体）以及包膜病毒的一种表征方法予以考虑。

引言

细胞外囊泡（EVs）是由所有细胞类型释放的膜结合囊泡。它们含有脂质、蛋白质、代谢物和核酸，并可在细胞之间以及组织和器官之间局部或远距离传递这些物质。EVs主要有三种亚型：凋亡小体、微囊泡和外泌体^1,2。本文将重点讨论外泌体及其相关蛋白质。

外泌体是由早期内体向多泡体（MVB）内陷出芽而产生的分泌性囊泡。随后，MVB 与细胞膜融合，将外泌体释放到细胞外空间，使其能够迁移至其他细胞^3,4。外泌体的大小范围介于 40 至 150 nm 之间，富含源自内体的跨膜蛋白，称为四跨膜蛋白（tetraspanins，如 CD9、CD63、CD81）、参与运输所需的膜结合型内体分选复合物（ESCRT）以及脂筏相关蛋白^{1,2, 5,6,7}。

对细胞外囊泡（exosome）的生化组成进行表....

方案

1 细胞系的传代与维持

1. 获取人骨肉瘤细胞（U2OS），并将细胞置于添加了10%无外泌体胎牛血清和1×青霉素/链霉素溶液的生长培养基中。
   注意：无外泌体胎牛血清的制备方法参照McNamara等²⁶所描述的方案。
2. 将U2OS细胞在37 °C、5% CO₂条件下，置于铜涂层培养箱中培养，并在T175培养瓶中进行传代^26,27。细胞必须保持在对数生长期中期，以防止亚群的出现或在静止期期间凋亡碎片的积累。

2 外泌体的分离与纯化

1. 将U2OS细胞系在10个独立的T175培养瓶中培养至完全汇合，每个培养瓶加入50 mL培养基。收集细胞上清液，并依次通过0.45 µm和0.22 µm的真空过滤装置进行过滤。
2. 将上清液在配备750 kDa中空纤维滤柱的过滤系统上进行切向流过滤（也称为交叉流过滤），以去除较小的蛋白质或代谢物²⁸。
   1. 在保持截留压力<20 psi的条件下，以恒定的前向压力30 psi将上清液通过切向流过滤装置，使压差Δ达到10 psi或更高。在截留液储罐中放入磁力搅拌子，并设置转速为150 rpm

结果

本研究旨在评估超分辨率显微镜在三维（3-D）空间中以纳米级分辨率可视化单个细胞外囊泡（EV）的有效性。为了分析单个EV的形态和大小，我们采用光可切换染料，将EV与远红光、可插入膜结构的染料共同孵育，并通过色谱法去除过量染料²⁹。随后，在超分辨率显微镜下使用640 nm激发激光观察经亲和捕获的抗CD81抗体结合且呈红色染色的EV。在完成显微镜校准后，其在XY轴上的平均误差为16 nm，Z轴上的平均误差为38 nm（图1A、B），纯化的U2OS EV成功实现了最高达XY轴20 nm、Z轴50 nm的分辨率成像。

通过dSTORM技术对单个细胞外囊泡（EVs）进行三维成像，在10,000帧曝光过程中随着激光功率的增加实现光开关，这些EVs在所获得的图像中清晰可见图 2A、B）。对采集后图像的Z平面、光子计数、标准差及重构图像的定位精度进行校正，实现了细胞外囊泡在三维空间中的清晰分辨。

讨论

由于细胞外囊泡（EVs）在多种细胞内过程及细胞间信号传导中发挥重要作用，已成为当前研究的热点领域^1,30。然而，由于其体积微小，低于光学显微镜的衍射极限，对其进行可视化观察具有较大挑战性。直接随机光学重建显微技术（dSTORM）是一种突破衍射极限的直接可视化方法，其通过随时间捕获单个荧光分子的光开关事件，并基于这些闪烁事件重建图像^21,31。超分辨率显微技术已成功实现对多种细胞结构的三维成像，例如肌动蛋白丝、微管、质膜中嵌入的受体以及感染细胞中的病毒蛋白^{32,33,34,35,36}。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 个 µ-Slide 8 孔板	Ibidi	80827
1× PBS	Gibco	14190-144
1× 青霉素-链霉素溶液	Gibco	15140-122
50 mL 圆底离心管	Thermo Fisher	339652
500 mL 0.22 µm 真空过滤装置	Genesee	25-227
750 kDa 中空纤维截留滤芯	Cytiva	29-0142-95
AKTA Flux S	Cytiva	29-0384-37
AKTA Start	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
抗 CD81 磁珠	Thermo Fisher	10616D
B-cubed 缓冲液	ONI	BCA0017
CellMask Red	Thermo Fisher	C10046
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher	10566016
胎牛血清	VWR	97068-085
Frac 30 组分收集器	Cytiva	29022094-ECOMINSSW
甘氨酸 pH=2.0	Thermo Fisher	BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 柱	Cytiva	17548151
分子生物学级水	Corning	9820003
Nanoimager	Oxford Nanoimaging	定制
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710
聚乙二醇	Thermo Fisher	BP233-1
RNase A	Promega	A797C
T175 培养瓶	Genesee	25-211
Tetraspek 微球	Invitrogen	T7279
Tris-HCl pH=7.5	Thermo Fisher	BP153-1
Unicorn V	Cytiva	29022094-ECOMINSSW