制备负载编码RNA适配体和核糖开关质粒DNA的多功能丝素微胶囊

摘要

该方案描述了用于多重检测的坚固且生物相容的载DNA微胶囊的制备方法 体外 能够追踪多种配体的生物传感器

摘要

我们介绍一种通过在可牺牲球形核心上采用逐层自组装（Layer-by-Layer, LbL）方法制备载DNA丝素蛋白微胶囊的方案。在吸附初始层和DNA质粒后，通过对单层丝素蛋白进行快速脱水，诱导丝素二级结构中β-折叠的形成，从而促进稳定微胶囊的构建。因此，层状结构的形成依赖于多重氢键和疏水相互作用。在多层壳结构吸附完成后，核-壳结构可进一步功能化修饰金纳米颗粒（AuNPs）和/或抗体（IgG），用于远程传感和/或靶向递送。通过调节在二氧化硅微球上依次沉积关键大分子过程中的多个关键参数，如聚合物引物的存在、DNA和丝素蛋白的浓度以及吸附层数，可获得具有可变通透性和DNA负载量的生物相容性载DNA微胶囊。在二氧化硅核心溶解后，该方案成功制备出中空且稳定的微胶囊，其中DNA质粒被固定于胶囊膜的内表面。在DNA质粒与外部环境之间构建一层选择性通透的生物相容性膜，可在长期储存过程中保护DNA，并对空间受限质粒产生的输出响应增强起到重要作用。DNA模板的活性及其可及性在以下过程中进行了检测 体外 无细胞转录和翻译反应。编码RNA发光适体和核糖开关的DNA质粒在壳膜中通过相应的分析物成功激活，并通过荧光标记的RNA转录本或GFPa1蛋白的定位可视化。

引言

合成生物学领域通过利用微生物进化出的天然机制来监测其环境及潜在威胁，为开发传感功能提供了独特的机会。重要的是，这些传感机制通常与保护微生物免受有害暴露的响应相关联，通过调控基因表达以减轻负面影响或阻止有毒物质的摄入。目前已有大量研究致力于改造这些微生物，利用这些天然响应机制构建全细胞传感器，但将其重新设计以识别新的目标分子和/或产生可测量的信号（通常是荧光）用于定量分析^1,2。然而，由于基因改造微生物（GMOs）在环境或人体中应用时存在全细胞或部分遗传物质泄漏的风险，即使其被封装在聚合物基质中，人们对此仍存有担忧，因此有必要探索利用这些传感策略的替代方法³。

一种无需担忧转基因生物（GMOs）释放问题即可利用微生物传感优势的有效方法是使用 体外 转录/翻译（IVTT）系统。从实际角度来看，IVTT系统包含大多数处于活性状态的细胞组分混合物，该混合物已被 "提取的" 通过超声处理、珠磨或其他不同方法从细胞中提取⁴该过程的最终产物是一种已优化的生化反应混合物，可用于转录和翻译，能够用于测试不同的传感器 "敞口容器" 形式，且不受使用完整细胞（如膜扩散、转化效率、细胞毒性等）相关限制的影响。重要的是，可定量添加不同的传感器....

方案

1. 质粒载体的构建。

1. 构建质粒载体（pSALv-RS-GFPa1，3.4 kb），通过扩增来自pJ201:23976-RS-GFPa1载体（由DNA2.0设计并构建）中茶碱核糖开关（ThyRS）与GFPa1融合的编码序列，并将其插入 E. coli 表达载体，pSAL¹³. 使用上游引物（5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3'）和下游引物（5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3'）扩增与 GFPa1 融合的 ThyRS 编码序列，并进行 PCR 反应 50 µL 按照制造商方案，使用DNA聚合酶扩增体积¹⁴.
2. 准备1%琼脂糖凝胶，使用0.5 g琼脂糖、50 mL TAE缓冲液（40 mM Tris乙酸盐，1 mM EDTA，pH 8.0）以及 3 µL DNA染料
3. 混合 5 µL PCR扩增产物的等分试样 5 µL 无RNase/DNase水 2 µL 加入6x上样缓冲液，通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。使用DNA分子量标准（0.1–10.0 kb）作为参照。以120 V电压电泳，直至染料前沿接近凝胶底部。
4. 使用紫外透射成像系统观察DNA片段，以确认DNA片段大小是否正确¹⁵.
5. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造....

结果

本研究探讨了编码不同传感器设计（两种类型的RNA调控的转录/翻译元件）的DNA模板在丝蛋白微胶囊封装后的功能表现。微胶囊通过模板化逐层自组装（Layer-by-Layer, LbL）关键组分制备而成，主要包括：底层、编码传感器设计的DNA质粒以及丝素蛋白生物聚合物（图2）。大分子以分层方式沉积，可基于吸附层之间的分子间和分子内相互作用以及壳层厚度，调控胶囊膜的渗透性。该系统可调节的渗透性为控制必需小分子的扩散、同时限制大分子等不需要的物质穿过胶囊膜提供了可能²⁰。

当严格按照方案操作时，可制备出尺寸均一（4.5 µm）、结构稳定的丝素蛋白微胶囊，其在水合状态下的壳层厚度约为500 nm（20层）（图3）²¹。通过逐层自组装（LbL）方法，可根据质粒的初始浓度调节DNA模板的载量。通过将DNA模板的初始浓度调节在50–200 ng/µL范围内，可实现最佳DNA载量。

讨论

选择性透过的水凝胶微胶囊可按照本方案制备，其中装载有多种类型的DNA编码传感器设计。逐层自组装（LbL）方法的一个显著特征是在自下而上的构建过程中可调控微胶囊的复杂性，该过程通常始于分子物种在牺牲模板上的吸附。通过精确调节初始组分的浓度、pH条件以及层数，可制备出具有不同DNA载量参数、功能特性及可调渗透性的微胶囊。²³为了增强胶囊的多功能性，可通过在壳层表面进一步功能化修饰金纳米颗粒（AuNPs）和免疫球蛋白G（IgG），从而开发出可用于生物相容性传感载体的系统 体内 诊断。这两种替代途径均依赖于丝素蛋白独特的分子结构。原位还原金³⁺ 由于存在酪氨酸残基（5.3% mol.），在合适的还原缓冲液条件下可实现金属离子的还原。特异性抗体可与功能化蛋白微胶囊表面的金纳米颗粒（AuNPs）进行偶联 通过 碳二亚胺活化化学的实施。这两个步骤都需要仔细开发和优化实验方案，以确保生物传感器胶囊在后续应用中具备适当的功能。例如，若要将这些微胶囊用作 "智能" 递送系统，其中分子载荷在特定刺激（如pH或化学信号）下释放，应表征并优化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基苯亚甲基)-2-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-咪唑-5(4H)-酮 (DFHBI-1T)	Lucerna	DFHBI-1T
5× T4 DNA 连接酶缓冲液	ThermoFisher Scientific	46300-018
6× 蓝色凝胶上样染料	New England BioLabs	B7021S
96 孔板，黑色圆形	Corning	3601
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539	生物试剂，用于分子生物学，低电渗（EEO）
氨苄青霉素钠盐	Sigma-Aldrich	A0166	粉末或晶体，生物试剂，适用于细胞培养
BlpI 限制性内切酶	New England BioLabs	R0585S
Corning 一次性真空过滤/储存系统	FisherScientific	09-761-1
二甲基亚砜，DMSO	Sigma-Aldrich	472301	ACS 试剂，≥99.9%
质粒 DNA，pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb)，BrocApt.	Addgene	质粒 #66788
DyLightTM550 抗体标记试剂盒（Invitrogen）	ThermoFisher Scientific	84530
用于环状 DNA 的大肠杆菌 S30 提取物系统	Promega	L1020
Falcon 圆锥形离心管，15 mL	FisherScientific	14-959-53A
Falcon 圆锥形离心管，50 mL		14-432-22
Fisherbrand 微量离心管，1.5 mL	FisherScientific	05-408-129
氢氟酸，HF	Sigma-Aldrich	695068	ACS 试剂，48%
硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	60615	卡那霉素 A（主要成分）与卡那霉素 B 和 C 的混合物
KpnI 限制性内切酶	New England BioLabs	R0142S
添加 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板	Sigma-Aldrich	L5667	预浇注含 100 µg/mL 氨苄青霉素的琼脂平板
添加 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板	Sigma-Aldrich	L0543	预浇注含 50 µg/mL 卡那霉素的琼脂平板
LB 肉汤（Lennox 级）	Sigma-Aldrich	L3022
溴化锂，LiBr	Sigma-Aldrich	213225	ReagentPlus，≥99%
高效感受态大肠杆菌 DH5-α 菌株	ThermoFisher Scientific	18258012
甲醇	MilliporeSigma	322415	无水，99.8%
MilliQ 水	EMD MilliPore		Milli-Q Reference 水纯化系统
MinElute PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004
N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐，EDC	Sigma-Aldrich	E1769
PBS（磷酸盐缓冲液）	ThermoFisher Scientific	10010023	1× PBS，pH 7.4
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530S
支化聚乙烯亚胺	Sigma-Aldrich	408727	平均分子量 ~25,000
PURExpress 体外蛋白质合成试剂盒	New England BioLabs	E6800S
QIAEX II 凝胶回收试剂盒	Qiagen	20021
QIAprep Spin 质粒小提试剂盒	Qiagen	27104
Quick-Load 2-Log DNA 标准品（0.1–10.0 kb）	New England BioLabs	N0469S
SiO? 二氧化硅微球，4.0 µm	Polysciences, Inc.	24331-15	10% 水溶液
Slide-A-Lyzer G2 透析夹，3.5K 截留分子量，15 mL	ThermoFisher Scientific	87724
碳酸钠，Na?CO?	Sigma-Aldrich	222321	ACS 试剂，无水，≥99.5%，粉末
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 透析装置	FisherScientific	08-607-008	Spectrum G235058
SYBR Safe DNA 凝胶染色剂	ThermoFisher Scientific	S33102
T4 DNA 连接酶（5 U/µL）	ThermoFisher Scientific	EL0011
茶碱	Sigma-Aldrich	T1633	无水，≥99%，粉末
Tris 乙酸盐-EDTA 缓冲液（TAE 缓冲液）	Sigma-Aldrich	T6025	含 40 mM Tris-乙酸盐和 1 mM EDTA，pH 8.3。
UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水	FisherScientific	10-977-023
ZymoPURE II 质粒大提试剂盒	ZymoResearch	D4202