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使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

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DOI：

10.3791/62865

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2021年8月31日

 ,  ,  ,  , 
1Neurophotonics and Mechanical Systems Biology, Institut de Ciències Fotòniques, ICFO, 2Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 3Institut de Ciències Fotòniques, ICFO, 4Universitat Pompeu Fabra (UPF)

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。

摘要

在多细胞生物的发育过程中，一个受精的单细胞通过分裂产生多种具有不同功能的组织。组织形态发生伴随着单个细胞水平上的分子和结构变化，导致亚细胞力学特性的差异。因此，即使在同一细胞内，不同的细胞器和区室对机械应力的抵抗能力也各不相同；而机械转导通路可主动调节这些力学特性。细胞适应组织微环境的能力，部分依赖于其感知和响应机械应力的能力。我们近期提出了一种新的机械感知范式，其中细胞核的形变与定位使细胞能够测量其所处的三维物理环境，并赋予细胞一种本体感受能力，以解码细胞形态的变化。本文中，我们描述了一种在活细胞内测量塑造细胞核的力和材料特性的新方法，并以贴壁细胞和机械受限细胞为例进行了说明。该测量可通过细胞内的光镊无创进行，且通过无需校准的光动量检测可直接获取作用力。这种方法使得细胞核力学特性的测量独立于细胞表面的形变，从而能够区分外部感知（exteroceptive）和内部感知（interoceptive）的机械转导通路。重要的是，光镊实验可与光学显微镜结合，利用细胞骨架、钙离子或细胞核形态的荧光成像，研究细胞响应及亚细胞动态过程。所介绍的方法操作简便，可与商用的力测量系统兼容，并可轻松拓展用于研究其他亚细胞区室（如线粒体、应力纤维和内体）的力学特性。

引言

组织形态发生是一个复杂的过程，其中生化信号与物理力在时空上协调作用。在发育中的胚胎中，生化信号因子的浓度梯度决定细胞命运的特化，并确保组织模式的正确建立。1,2同时，内在力和外在力在胚胎结构的构建中起着重要作用3,4在此背景下，细胞皮层力学的影响已得到广泛研究5,6形态发生过程中机械与化学过程之间的紧密相互关联，依赖于单个细胞感知其组织微环境中机械力并作出响应的特性。细胞由此解码机械信号 通过 存在对力敏感的亚细胞和分子元件，可将机械信息转导为特异性信号通路，从而调控细胞行为、细胞命运及细胞力学特性。

发育过程的一个显著特征是细胞以群体形式组织，从而构建多细胞结构。因此，单个细胞很少独立地重排和移动，而是紧密地聚集在特定的微环境中，表现出诸如超细胞迁移7、（解）阻塞转变8,9或胚泡压缩10等集体行为。细胞内部及细胞之间产生的机械力作为重要信号，调控着细胞的集体动态行为7,11。即使在细胞单独移动的情况下，例如前体细胞在组织层之间或狭窄的组织生态位中挤过时，它们在穿越三维环境的过程中也会经历强烈的各向异性机械力。这些施加在细胞上的机械应力对细胞行为具有深远影响12,13。已有多种机制被研究，这些机制均指向细胞核作为主要的力传导元件14,15，在致密的三维组织环境中迁移时，细胞核可作为被动或主动的机械组分发挥作用15,16。

我们近期提出了一种机制，该机制使细胞能够利用细胞核作为弹性细胞内力学传感器来测量形态形变12。细胞核是细胞中最大的细胞器，当细胞发生极化、迁移，或在机械拉伸、空间受限或渗透压应激条件下改变其形态时，细胞核会经历显著的形变16,17,18,19。我们发现，核膜的拉伸以及细胞核在细胞内的位置为细胞提供了有关细胞形变程度和类型的信息（例如细胞压缩与细胞肿胀之间的区别）。细胞核的拉伸伴随着内核膜（INM）的展开，从而促进内核膜上钙依赖性cPLA2（胞质磷脂酶A2）的脂酶活性，随后释放花生四烯酸（AA），并快速激活细胞皮层的肌球蛋白II。这导致细胞收缩力增强，并在皮层收缩力超过某一阈值时促进类阿米巴型细胞迁移6。这种对细胞形变的力学敏感反应在不到一分钟内即可发生，并且在解除空间限制后可逆，表明细胞核在机械应力条件下作为细胞本体感知的应变传感器，调控细胞的适应性行为。该力学敏感通路在斑马鱼胚胎来源的前体干细胞中已被证实具有活性，无论是在多能性细胞还是谱系定向细胞中均如此12，且在不同物种和细胞系中具有保守性20。

除了细胞核作为细胞力学感受器的核特性外，核结构和力学特性在发育过程中以及响应细胞命运决定时也受到内在调控21，从而调节细胞的力学敏感性22,23。其结果可能是核顺应性的改变，使得细胞形态发生变化，并实现从非迁移状态向迁移状态的转变，或反之8。

已有多种技术被用于测量细胞核的力学特性，例如原子力显微镜24,25、微吸管抽吸26,27、微流控技术28和微针技术29。然而，其中许多技术具有侵入性，需要对整个细胞进行形变，从而限制了对细胞核自身力学特性和力依赖性响应的测量。为了规避细胞表面及其机械敏感性细胞皮层30同时发生形变的问题，研究人员在不同背景下对分离的细胞核进行了研究31,32。然而，不能排除细胞核分离过程本身可能伴随细胞核力学性质及其调控机制的改变（参考文献24及本研究未发表的观察结果）。

光镊（OTs）是一种多功能技术，已实现了大量细胞力学生物学实验，并在理解分子机器如何将化学 能转化为机械能方面发挥了关键作用33,34。光镊利用高度聚焦的激光束对折射率高于周围介质的介电粒子施加光力33。这种力的大小可达数百皮牛（pico-Newtons），可使粒子在激光捕获焦点区域内被有效束缚，从而实现对被捕获粒子的三维操控。使用光作为工具具有重要优势，即测量可在活细胞内部以非侵入方式完成。光操控的作用范围仅限于激光束的捕获焦点区域，因此可在不刺激周围细胞膜的情况下进行操作，也不会干扰细胞膜处的肌动蛋白皮层或力敏感过程（例如离子通道的力依赖性激活）。

光镊技术的难点在于，使用依赖于能量均分定理或利用已知斯托克斯拖拽力来测量激光功率依赖性逃逸力的传统间接力校准方法，难以精确确定施加在微球上的力35。尽管这些方法在体外（in vitro）实验中易于实施，但通常无法应用于细胞环境。近年来，领域内已引入若干基于动量守恒第一性原理的直接力校准策略36,37。与其他力谱技术不同，该方法通过被捕获粒子（形状任意）与光动量之间的局部交换来推导力的测量值38,39。在我们的实验装置中，由光力引起的光动量变化可被直接测量，无需进行原位（in situ）光阱校准40,41,42,43。因此，该方法可在黏稠环境中（如细胞内部甚至组织内部）实现力的测量，并可轻松将力量化至皮牛（pN）水平。

在本实验方案中，我们描述了一种利用光镊装置对细胞内细胞器或结构进行机械操控，并定量评估其力学特性的检测方法。该装置集成于旋转盘共聚焦荧光显微镜中，可同步成像细胞行为或细胞内动态过程。该检测方法能够在对特定细胞区室（如细胞核）的力学特性进行表征的同时，研究其形变本身可能引发的力学响应及分子信号通路的激活。此外，通过将微珠注入细胞并利用光镊捕获，可显著提高压痕力，这是因为聚苯乙烯微珠的折射率（n = 1.59）远高于细胞核（n ~ 1.35）与细胞质（n ~ 1.38）之间固有的折射率差异44。本研究所提出的方法可轻松拓展应用于其他细胞内结构和细胞器的研究，也可结合主动微流变学、使用多个光镊同时探测相同或不同亚细胞结构，以及针对活体胚胎中细胞力学生物学的测量研究。

方案

所有实验方案均已通过机构动物护理和使用伦理委员会（PRBB-IACUEC）批准，并依照国家及欧洲法规实施。所有实验均遵循3R原则进行。斑马鱼（Danio rerio）的饲养条件如前所述。

1. 分离原代斑马鱼胚胎前体干细胞的制备

  1. 微量移液器和琼脂糖准备
    注意：有关完整的斑马鱼胚胎显微注射方案，请参见参考文献45.
    1. 使用微电极拉制仪将一根1.0 mm玻璃毛细管拉制成两根针状电极45将未使用的针头存放于直径150 mm的培养皿中，培养皿底部垫有橡皮泥 cushion，或使用反向的实验室胶带环固定，以保护针尖在运输过程中免受损伤。
    2. 将1%超纯琼脂糖溶于E3溶液（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂）中融化2，0.33 mM MgSO₄4在标准的厨房/实验室微波炉中加热10秒。反复短时间（数秒）加热混合物，直至琼脂糖完全溶解。
    3. 当琼脂糖完全融化后，稍作冷却，然后倒入一个10 cm的培养皿中。缓慢加入三角形显微注射模具（参见 材料表将模具轻轻放在琼脂糖表面，避免产生气泡。不要按压模具，确保其保持在琼脂糖表面。
    4. 当琼脂糖完全凝固后，缓慢而轻柔地施力移除三角形模具，以避免琼脂糖破裂。培养板可倒置于4 °C保存2至4周。
    5. 显微注射前30分钟，将培养板从冰箱中取出，加入预热至28 °C的E3培养基，于室温下平衡。
  2. 注射混合物的制备
    1. 配制注射混合液时，将1 µm微珠（聚苯乙烯，非荧光）以1:5的比例稀释于无RNase水中。
    2. 制备mRNA，用于瞬时表达荧光标记物或重组基因构建体的表达，和/或在所需浓度下共注射吗啉代寡核苷酸。
      ​注意：一种典型的共注射混合物，用于将微珠与每胚胎100 pg mRNA共同注射，以标记细胞核（例如使用H2A-mCherry），其组成为：1 µL 微珠 + 1 µL mRNA（储存浓度为1 µg/µL）+ 2.5 µL 无RNA酶水 + 0.5 µL 酚红（储存液为0.5%，酚红非必需；其作用是便于观察注射液滴，但对于有经验的操作者而言，无标记的注射液滴亦可见）。RNA注射还可用于筛选已注射的胚胎。可选用荧光微珠代替非荧光微珠，以便于观察。
  3. 显微注射针的装填与校准
    1. 使用显微注射仪时，先将其打开 时间门控 选项。此设置对于准确校准注射体积非常重要。将门控时间设为约500 ms。
    2. 使用微量加样器将3 µL注射混合物装入针头中。
    3. 将针插入显微操作器并紧密固定。检查显微操作器是否处于良好位置，并能在注射板上沿x-y方向自由移动。
    4. 使用微米尺（5 mm/100 分度），并在其表面滴加一滴矿物油来测量液滴大小45 并将注射混合液直接滴入矿物油中。
    5. 用尖锐的镊子以较大的倾斜角度修剪针头，以形成尖锐的针尖。调节液滴大小至0.1 mm，相当于注入0.5 nL的材料。
      ​注意：如果因切割针头导致超过此体积，建议使用新针头重新进行校准。可略微调整显微注射仪的门控时间以匹配液滴体积；然而，过短的门控时间对应较大的针头直径，可能对胚胎造成损伤。
  4. 斑马鱼胚胎单细胞期的显微注射
    1. 在受精后不久收集斑马鱼胚胎，于第一次细胞分裂发生前，将珠子混合物直接显微注射到单细胞（合子）期胚胎中。
      注意：这能确保微球在胚胎中的均匀分布，并在后续实验所处的发育阶段（囊胚-原肠胚阶段）获得足够数量的分离卵裂球，且每个细胞至少含有一个微球。若细胞内存在两个微球，仍可进行压痕实验，但应排除不含微球的细胞（尽管无微球时也可进行压痕实验）。本方案使用 AB 野生型品系，但也可使用其他品系，例如 TL。
    2. 将单细胞期胚胎（合子）放入预热的三角形1%琼脂糖模具中，如图所示 图1A，使用塑料巴斯德吸管。
    3. 用同一移液管吸除多余培养基，以防止胚胎漂浮。轻轻将胚胎推入三角形模具中 通过 画笔。在胚胎之间保留一定间距，以便于正确调整方向（图1B).
    4. 用毛笔轻轻调整胚胎，使胚胎呈侧向排列，受精卵的单个细胞清晰可见，如图所示 图1B当胚胎的单个细胞朝向显微注射针方向时，即达到理想的显微注射方位（注射 通过 胚胎的动物极）或相反方向朝向卵黄细胞（注射 通过 胚胎的植物极），如图所示 图1C.
    5. 用一只手握住培养皿，另一只手使用显微操作仪控制器调整针尖位置。将针尖向下移动至胚胎处。
    6. 通过体视显微镜观察操作过程，用针头刺穿卵膜并进入单细胞胚胎。确保针头位置正确，注射后观察注射液滴的位置是否正确，如图所示。 图1C.
    7. 对所有胚胎重复此操作：抬起显微注射针，移动载有胚胎的培养皿直至下一个胚胎位于视野中央， lowering the needle 并进行注射。
    8. 将整套胚胎注射完毕后，用E3培养基冲洗琼脂糖模具或培养皿，将胚胎移出，并使用塑料巴斯德吸管转移至新的培养皿中。建议在注射板上加入足量的培养基，以避免显微注射过程中胚胎干燥。
    9. 重复该操作，直至完成所需数量的胚胎注射。胚胎必须处于单细胞阶段，以确保微珠的最大化且均匀扩散。
      注意：该实验步骤针对早期囊胚胚胎进行了优化，若需研究其他发育阶段，可能需要进行相应优化。
    10. 将注射后的胚胎置于28-31 °C的培养箱中孵育约4小时，或直至达到所需发育阶段图1D在进行原代细胞培养方案之前。
      ​注意：可选择让胚胎继续发育至囊胚期之后（或目标检测时间点），以确认存活情况并排除毒性相关假象。在幼虫阶段，使用三卡因（tricaine）将幼虫麻醉后，置于0.75%琼脂糖中固定，并观察微球在不同组织中的分布情况。配制储存液的方法如下：将400 mg三卡因粉末溶于97.9 mL蒸馏水中，加入约2.1 mL 1 M TRIS碱溶液（pH 9），调节pH至7。该溶液可保存于4 °C。使用时，取4.2 mL储存液加入100 mL卵培养基（或所需培养基）中作为麻醉工作液；本实验中使用E3培养基。参见参考文献46 详情请见。

2. 单细胞制备与染色

  1. 使用塑料巴斯德吸管将球形期胚胎（受精后4小时，hpf）放入玻璃培养皿中。选择注入微珠后显示阳性信号的胚胎，若进行了mRNA注射，则还需选择表达荧光蛋白的胚胎。部分胚胎可能出现微珠高度聚集现象，可予以剔除。
    1. 使用镊子手动去除胚胎的绒毛膜。用玻璃巴斯德吸管将约10–15个胚胎转移至1.5 mL反应管中。
      注意：胚胎去膜后易黏附于塑料表面，因此需使用玻璃器皿。作为替代方案，也可使用底部铺有一层薄薄的1%琼脂糖的塑料培养皿。建议优先采用手动去膜而非蛋白酶Pronase处理，以避免细胞表面蛋白发生蛋白水解损伤，以及细胞和组织力学特性的潜在改变，从而防止延长恢复时间47。
  2. 吸除E3培养基，加入500 µL预热的不含CO2的组织培养基（DMEM-F12；含L-谷氨酰胺和15 mM HEPES，不含碳酸氢钠和酚红，并添加10单位青霉素和10 mg/L链霉素）。
    注意：除非使用显微镜培养箱，否则不应使用依赖CO2的培养基。例如，在碳酸盐缓冲条件下使用RPMI培养基会导致培养基pH值变化，可能影响细胞存活。另一个关键点是避免使用含血清的培养基。血清中可能含有溶血磷脂酸（LPA），这是一种强效的Rho/ROCK信号通路激活剂，能够调控前体干细胞的细胞收缩性和运动性6。培养基的渗透压应维持在300 mOsm，以避免渗透压变化干扰细胞核形态或力学特性12。
  3. 通过轻轻摇动离心管手动解离细胞。确保管内液体变得浑浊，且肉眼不可见大块组织残留。避免产生气泡，以尽量减少细胞损伤和损失。
  4. 以200 × g离心3分钟。离心后应能清晰看到沉淀。
  5. 吸除上清液，并根据以下步骤之一进行操作。
    1. 如无需染色，加入500 µL DMEM。使用200 µL移液器将液流直接对准沉淀，轻柔重悬细胞。避免对细胞施加过大的剪切力。出现泡沫表明细胞已受损。
    2. 若需使用Hoechst等DNA染料对细胞核进行标记，将0.5 µL DNA-Hoechst（储存液浓度为2 mg/mL）与1,000 µL DMEM混合，得到终浓度为1 µg/mL的染色工作液。取500 µL该染色液加入细胞中，轻柔重悬，避光孵育7分钟。
    3. 若需使用荧光化学钙指示剂Calbryte-520对细胞染色，将Calbryte-520加入DMEM中至终浓度为5 µM，避光孵育20分钟。
      注意：步骤2.5.2和2.5.3中所述方案已针对这些特定产品优化。其他染色操作可参照生产商提供的方案进行。
  6. 再次按照步骤2.4相同的条件离心；吸除上清液后，将细胞轻柔重悬于50 µL DMEM中（用于悬浮样品）或20 µL DMEM中（用于受限条件下的细胞），以避免形成细胞团块。

3. 使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）间隔片制备光镊样品腔

注意：基于光动量检测的光学力测量需要捕获从光阱中射出的全部光线40。为了确保不变校准因子α （pN/V）的可靠性，光学力传感器的后焦平面（BFP）上的光强分布必须与光子动量精确对应。这决定了收集透镜表面到捕获平面的距离约为 2 mm，即光学捕获腔的最大高度。

  1. 在 #1.5 玻璃底培养皿上进行 PDMS 旋涂。
    注意：以下配方适用于约 40 个培养皿。根据实验是针对悬浮细胞还是受限细胞，所形成的微腔高度会有所不同（图 1D）。
    1. 在 50 mL 锥形管中混合 9 mL 基础聚合物 PDMS 和 1 mL PDMS 固化剂。充分混合两种组分，以确保固化剂均匀分布。
    2. 使用真空泵对混合物进行脱气处理，以避免产生气泡。将锥形管放入真空瓶中并抽真空，直至混合物中无气泡出现。
      注意：应缓慢开启真空，防止 PDMS 起泡或从离心管中溢出。
    3. 将玻璃底培养皿放置于旋涂仪卡盘上（图 2A）。操作时应轻柔，避免刮伤、留下指纹或污染培养皿。使用铝箔保护旋涂仪腔体，防止 PDMS 泄漏。
    4. 对于用于悬浮细胞实验的光镊腔室，在培养皿底部中央加入约 250 µL PDMS 混合液，并以 750 rpm 转速旋涂 1 分钟。PDMS 层厚度约为 50 µm48。
    5. 对于用于受限细胞实验的光镊腔室，加入少量 PDMS 液滴（约 50 µL），并以 4,000 rpm 转速旋涂 5 分钟。PDMS 层厚度约为 10 µm。如需获得不同 PDMS 厚度的详细方案，请参见参考文献48。
    6. 将涂有 PDMS 的玻璃底培养皿在 70 °C 下固化 1 小时。
    7. 使用手术刀在 PDMS 层上切割出 1 × 1 cm 的正方形区域，并用镊子将其剥离（图 2C）。对于受限细胞实验，需用异丙醇清洗 PDMS 残渣。
  2. 用于悬浮状态下弱附着细胞实验的腔室包被
    1. 加入 100 µL 浓度为 0.5 mg/mL 的刀豆球蛋白 A（ConA），使其覆盖整个方形腔室表面，孵育 30 分钟。
      注意：ConA 是一种可结合细胞表面糖类的凝集素，能将单个细胞偶联至盖玻片表面。
    2. 移除 ConA 液滴，并用不含酚红的 DMEM 培养基小心冲洗表面，避免刮伤经 ConA 处理的区域。
    3. 向腔室中加入 30 µL 前一步骤制备的样品（步骤 2.6），并轻轻重悬，以消除任何细胞团块。
    4. 将一块 22 × 22 mm 的 #1.5 盖玻片轻轻置于 PDMS 边缘上方，封闭腔室（避免突然掉落，尽可能使用镊子操作，图 2B、C）。
      注意：上层玻璃盖片可使用任意厚度的盖玻片（收集物镜的工作距离为 2 mm）。
  3. 用于受限细胞实验的腔室制备
    1. 在方形腔室内加入 10 µL 含细胞的溶液（步骤 2.6）（图 2B）。
    2. 非常轻柔地用一块 22 × 22 mm 盖玻片封片，使液滴均匀铺展至整个区域且无气泡产生。同样建议使用镊子操作（如 图 2C 所示），以防止盖玻片突然下落。

4. OT 培养室间距的替代方案

注意：若无微加工实验室或匀胶机，可按照以下步骤操作。

  1. 悬浮细胞实验的腔室制备
    注意：若无旋涂仪可用，可使用普通双面胶带（高度约100 µm）制作间隔层。
    1. 裁剪一块双面胶带，中心留出一个约10 cm × 10 cm的方形孔（尺寸与PDMS相同，图2B）。
    2. 撕去胶带一侧的保护膜，将暴露的粘性面置于#1.5 H型玻璃底培养皿的中央。轻轻按压，使整个表面贴附于玻璃上并避免产生气泡，然后撕去剩余的保护膜。
    3. 按照步骤3.2中的说明进行操作。
  2. 受限细胞实验的腔室制备
    注意：为精确限制细胞，可在两片盖玻片之间使用已知直径的单分散微粒作为间隔物。
    1. 将直径为10 µm的聚苯乙烯微球以104 个/µL的浓度加入悬浮细胞中。
    2. 取10 µL含有细胞和微球的溶液滴加在一块22 × 60 mm的盖玻片上。
    3. 非常轻柔地用另一块22 × 60 mm的盖玻片覆盖样品，使液滴均匀铺展至整个区域且无气泡产生。为便于轻柔放置上层盖玻片（避免突然下落），建议使用镊子操作。
    4. 由于样品可能干燥，建议迅速完成制备。

5. 为细胞内测量设置光镊

注意：以下步骤针对一种商用光镊平台进行了优化，该平台包含基于声光偏转（AOD）的光学微操作模块和基于光动量变化直接检测的光学力传感器图2，参考文献12,40,49）。该装置的详细信息和光学组件可在 图 2F为了在光镊操作过程中观察力诱导的形变，将尼康旋转盘共聚焦显微镜耦合至倒置显微镜的左侧端口，以实现双色荧光成像。在不失一般性的前提下，本方案可适用于任何配备基于光动量检测直接测力功能的动态光镊系统。构建自制光学梯度阱的详细分步操作流程如下： 体内 应用50基于AOD调制的方法在进行多光阱实验和快速测量时具有显著优势51,52文献中存在多种构建基于光动量仪器的方案36,39,40,53，以及任何其他成像模式（微分干涉差显微镜、宽场荧光等）均可使用。

  1. 光镊启动
    1. 为了优化输出功率的稳定性，在实验开始前至少30分钟，将激光器开启至较高功率（例如3 W）。
    2. 打开光操控与力测量单元的电子模块。
      注意：应采取所有激光安全防护措施，仅使用经机构委员会批准的设备。激光开启时，切勿使用光学显微镜的目镜。始终佩戴经认证的红外防护眼镜（在950–1080 nm范围内光密度OD7），使用落射荧光端口2中的快门阻断红外激光，并在完成第5.3步的光力传感器校准之前，不得运行光捕获软件。通常情况下，避免使用高反射性样品，因为背向反射可能对激光器造成损坏。
    3. 通过光学操控模块入口处的旋转半波片（HWP）（图2F）控制捕获光功率。
      注意：本方案中使用的商用光操控模块已集成此功能。对于自行搭建的光捕获系统，应集成该功率控制装置，以便使用更高且更稳定的激光功率。
  2. 使用空微室进行校准
    1. 在双面胶带上裁剪出一个1 × 1 cm的正方形，并将其粘贴至1 mm厚的显微镜载玻片上。
    2. 向该正方形区域中加入水，并用#1.5盖玻片（22 × 22 mm）从上方封合。建议加入稍多体积的水（例如30–40 µL），以避免封闭腔室内产生气泡。若水溢出，应轻轻擦拭校准室。
  3. 光力传感器的校准
    1. 在60倍/1.2数值孔径的水浸物镜上滴加一滴水。将校准室放置于载物台上，使#1.5盖玻片朝向物镜。聚焦至下表面，即后续细胞样品所在的位置。
    2. 在覆盖样品的上层玻片顶部滴加一滴浸油（图2D）。小心降低力传感器单元的收集透镜，直至其接触油滴。
      注意：油滴应足够大，以完全覆盖收集来自光阱的激光的透镜表面。通常200 µL足以覆盖整个表面并提供稳定的浸没接触。操作应谨慎，避免过量填充，以防油渗入样品中。
    3. 按照光力传感器校准的制造商说明，通过将用于定位光镊（OTs）的辅助相机（AUX，图2F）上的样品平面图像进行观察。极其轻柔地降低光力传感器，直至场阑（FS，图2F-G）成像共轭于样品平面。这将确保通过检测与样品无关的光动量变化，实现准确的直接力测量40。
      注意：将场阑适当关闭，使其图像小于视场（FOV），从而可见。操作需格外小心，避免将光力传感器的收集透镜压向样品。也可通过分析后焦面（BFP）上具有确定数值孔径（NA）的光锥的捕获光分布，来确定光力传感器的垂直位置。
    4. 确保油滴中无气泡；气泡会直接影响力的测量结果。为检查气泡，插入伯特兰透镜（BL，图2G），并通过目镜观察成像光路。若可见灰尘或气泡，或需补充更多油（图S1A），则使用无尘镜头纸清洁透镜和腔室，并重复步骤5.3.2 和5.3.3。无遮挡的光路如图S1B所示。
    5. 利用光力传感器支架上的横向调节螺丝，将场阑（FS）居中于视场内。为提高精度，打开场阑，使其几乎充满辅助相机（AUX，图2F）上可见的整个视场。

6. 光镊优化

注意：直接力测量仅依赖于被捕获粒子所受力引起的光动量变化，因此与间接方法不同，在每次实验前无需校准光阱刚度。仪器特定的偏转/力转换因子（α；pN/V，参考文献41）由制造商校准，因此在不同实验中保持不变。然而，由于激光光斑在70 µm × 70 µm的区域内进行操控，步骤6.2–6.5至关重要，以确保最佳的捕获效果和功率稳定性。以下步骤由制造商提供的软件提供，可使光镊在其工作区域内以半自动方式实现优化。

  1. 启动 OTs 软件和相机 AUX 的采集软件。
  2. 在光镊驱动软件的系统校准子菜单中，点击 步骤 1：电子偏移，以减去初始电压基线。
  3. 为在光镊工作区域内实现捕获光功率的平坦化，通过旋转 HWP 将捕获光功率设置为其最大值的一半。请勿通过改变激光输出来调节捕获光功率，而应通过旋转 HWP 进行调节（图 2F）。点击 步骤 2：功率 以启动捕获光功率平坦化的自动程序。
    注意：此步骤至关重要，用于补偿光镊工作区域内捕获光功率的变化（图 S1D）。成功的校准可将光镊工作区域内的捕获光功率变化降低至 2%，并在约 2 分钟内收敛。
  4. 为进行捕获位置校准，移除红外滤光片 ，使激光光源在相机上可见。将成像平面聚焦到微腔的下表面以找到红外光斑。通过调节成像平面（物镜位置）以及相机 AUX 采集软件中的直方图对比度，获得尽可能小的红外光斑。如有需要，可通过旋转 HWP 降低光镊的功率（图 2F）。点击 步骤 3：位置 以启动捕获位置校准的自动程序。
    注意：该程序可实现光镊在相机 AUX 中的位置坐标与 AOD 偏转角度之间的精确对应。成功的校准可在数秒内生成角度-位置映射关系。
  5. 初始动量补偿
    注意：光镊在样品中移动时，会导致后焦平面（BFP）处的光动量分布发生变化（图 S1E, F）。即使在步骤 6.3 中已完成捕获光功率的平坦化，这种变化仍会引起与激光位置相关的、与作用力无关的信号变化。其结果是，捕获基线力会随位置变化（与被光镊捕获的微球所受的实际作用力无关），因此必须在每次实验前进行校正。
    1. 通过旋转 HWP 设置实验中将使用的捕获光功率（图 2F）。
    2. 在 工具 子菜单中点击 全局偏移 选项。这将打开光镊软件中的 偏移消除 辅助工具，用于校正初始动量基线。
    3. 点击 偏移 | 补偿 以校正随位置变化的初始动量。
      注意：若在后续数周内未对光学路径进行任何改动，则捕获光功率平坦化（步骤 6.3）和位置（步骤 6.4）的映射关系将保持不变。因此建议始终使用相同的光学元件组合（如二向色镜、滤光片等），这些元件可能影响激光捕获路径；否则需重新执行捕获光功率平坦化程序。关于初始动量补偿（步骤 6.5），光镊平台制造商提供了一种实时校准方法，每次更换捕获功率或开始新的实验时都必须重新校准。步骤 6.3 和 6.4 必须在步骤 5.2 中描述的空校准载玻片上进行。在含有细胞或其他物体的样品中，步骤 6.5 应在无任何可能改变光镊工作区域光散射的物体条件下执行。
  6. 可选操作：捕获一个微球，并在记录力信号的同时以已知速度移动捕获光阱。例如，设置捕获光阱执行三角波振荡：记录到的力信号将呈现为方波信号。
    注意：根据作用在微球上的拖曳力，力值应随速度线性增加。该测试可作为力测量正确性的阳性对照38。或者，也可使用光力传感器通过功率谱分析来确定光捕获刚度 κ [pN/µm] 和位置校准因子 β [µm/V]35。在正确对准的情况下，制造商提供的不变校准因子为 α = κ·β [pN/V]。
    1. 在制造商软件的“测量”子菜单中点击“Plot 1”，启动实时力读数。这将提供当前光捕获力和功率的读数。
    2. 从 工具 子菜单中打开 振荡参数 对话框。分别在“形状”和“类型”选择环中设置为三角波空间波形。例如，设置振幅为 10 µm，频率为 3 Hz。这将在直径为 1 µm 的微球上产生约 1 pN 的粘滞力38。
    3. 在相机 AUX 窗口中右键点击微球并选择 开始振荡。力读数将变为在 ±1 pN 处具有平台的方波力信号。
    4. 右键点击微球并选择 停止振荡。

7. 转盘共聚焦显微镜

  1. 开启转盘共聚焦显微镜及其附属设备、集成激光引擎和采集相机。
  2. 启动成像软件。
  3. 设置细胞核Hoechst染色和细胞质膜GFP的成像通道。
    1. 激活405 nm和488 nm激发激光线。
    2. 添加一个多波段二向色镜，以将激发光反射至样品，并允许发射光通过至相机。
    3. 使用500 nm长通边缘二向色镜分离荧光发射信号。
    4. 在两个采集相机前部分别使用DAPI/BFP（~445 nm）和GFP（~521 nm）发射滤光片。参见图2F、G。
    5. 将每个通道的曝光时间设置为100 ms。
    6. 调节激光输出，使样品平面处的激光功率达到5 mW。测量功率时，使用商用功率计。
  4. 设置成像程序。为避免Hoechst通道的光谱渗漏进入GFP通道，需依次成像两种染料。
    ​注意：如果光镊的声光偏转器（AOD）与相机采集之间存在硬件同步，请确保触发极性设置正确。如有疑问，请咨询所在平台负责人或显微镜制造商。

8. 进行细胞核压痕实验

注意：在抬起力传感器模块和更换样品时，务必关闭光镊（既需通过软件关闭，也需关闭落射荧光端口2的快门）。否则，可能导致光学元件及实验人员受到严重损害。在寻找细胞时，需注意物镜 holder 与培养皿底部边缘之间的横向距离，以避免物镜碰撞到载物台或培养皿（图2）。

  1. 将样品置于显微镜下，并按照本实验方案的第5.3步进行操作。
  2. 使用旋转的半波片（HWP）图2F），如果所研究的细胞核或细胞内结构的刚度未知，则将光镊的捕获功率初始值设为200 mW。通过显微镜载物台移动光镊的工作区域至无细胞区域，以在步骤6.5中补偿初始动量基线。
    注意：根据亚细胞结构的硬度，应将捕获功率值调整至更高或更低，以获得相似的压痕深度。
  3. 使用显微镜载物台软件控制器，通过透射明场显微镜观察，寻找带有1个或2个微珠的细胞（图3A).
  4. 定义一个捕获轨迹。
    1. 打开 轨迹 对话在 工具 子菜单并选择 轨迹类型中的位移 选择环
    2. 在数据表中，记录每一步后续轨迹的位移和时间。以下是两个示例。
    3. 对于应力松弛实验，编程设置梯形载荷，如图所示 图 3B。在 表 S1，施加了两个梯形压痕，行进距离为5 µm；速度为5 µm/s；回撤前等待时间为10 s。
    4. 对于以恒定速度进行的重复压痕实验，若需获得无停留时间的三角形循环，可设定轨迹振幅（例如 5 µm）以及阶跃时间（例如 2 s，对应速度为 2.5 µm/s）。在 表 S2以相同速度重复施加八次。
      注意：这些数值需针对每种细胞类型和实验进行确定，但以下梯形程序的参数可捕捉本实验中最重要的动态特性。等待时间应足够长，以确保细胞核在压痕后表现出完全的应力松弛
  5. 捕获微球
    1. 使用显微镜载物台软件控制器，将成像平面设置在微珠略上方。
    2. 使用OTs软件激活光镊，并在相机AUX成像窗口中点击小球（该窗口已按步骤6.4完成校准）。若光镊成功捕获小球，其运动将显著减弱。
    3. 点击并拖动珠子穿过细胞质，将其放置在距离核膜约 2 µm 的位置图3A确保轨迹设置为使微珠压痕垂直于核膜。
  6. 必要时，若需测量微珠相对于光阱的位置，可扫描光阱穿过微珠以确定捕获刚度。 k [pN/µm]54，从而 Δx珠粒 = -F/k （参见讨论部分）。本方案所用的光学微操作模块内置了用于此目的的程序。
    1. 打开 粒子扫描 对话在 工具 子菜单。
    2. 选择您要扫描的陷阱 高频 作为 扫描方法选择用于珠扫描测量的压痕轨迹方向（x 或 y）。
    3. 将出现一个窗口，显示捕获刚度的测量值。在图中，拖动两个游标以选择与线性捕获区域相对应的部分 F = -kx所选数据部分的线性拟合将自动更新。
      注意：将微珠的初始位置设置在远离细胞膜处（约 5 µm），因为介质-细胞界面的光动量偏转会干扰力测量的准确性。如果细胞核过于靠近细胞膜，可尝试从细胞对侧对细胞核进行压痕操作。若无法实现，则弃用该细胞。
  7. 单击成像软件中的采集按钮，开始图像采集。
  8. 点击开始保存陷阱位置和力测量数据 数据 | 保存 在实时力读数窗口中（按步骤 6.6.1 打开）。
    注意：光镊系统配备有触发输入接口，可连接至相机的时序输出端口。因此，图像数据与力数据可通过硬件同步，电子系统能够在数据采集期间将光镊的循环周期与图像的帧数对应起来。
  9. 通过右键单击珠子并选择先前加载的轨迹来启动 开始轨迹.
  10. 等待轨迹运行结束且系统稳定。
  11. 停止陷阱力测量数据的保存。将弹出一个数据保存对话框。
    注意：为优化数据存储，可在本对话框中选择下采样参数（10、100 或 1000）对数据进行下采样。
  12. 停止图像采集，并使用用户选择的后处理软件绘制结果。
  13. 如果在常规操作过程中微球丢失，且无法压痕细胞核（图S2），舍弃该次测量并提高功率。注意必须重复步骤6.5。在我们的实验中，至少95%的实验流程能够顺利完成，且微珠未从光镊中脱落。

结果

捕获珠的显微注射：
将微球注入单细胞斑马鱼胚胎后，在形态发生过程中，微球扩散至整个动物极帽区。为了更清晰地观察，我们使用红色荧光微珠重复了注射方案，并利用共聚焦显微镜在不同发育阶段获取了三维图像。在 图 4A-D注入的微珠在前体干细胞的细胞质中可见 体内 在5 hpf时。随后，在24 hpf时，微球分布于整个胚胎图 4E）。这两个阶段的胚胎均正常发育，存活率与对照组未注射或模拟注射的胚胎相当（参见 图 S3这与其他研究结果一致，这些研究报道了注射微珠的斑马鱼在受精后5天内存活率未受影响。55.

我们的转盘共聚焦显微镜适用于多通道荧光显微成像。在 图 5A，我们展示了细胞质中含有一个或两个微珠的分离干细胞。可使用多种荧光标记来研究细胞的不同特征图 5B）。细胞核形态可通过Hoechst染料或H2A::mCherry mRNA表达进行追踪，而内核膜可通过Lap2b-eGFP进行分析12肌动球蛋白皮层的动力学变化以及细胞内钙离子水平可通过 My12.1::eGFP 转基因品系进行观察56 以及Calbryte-520孵育。本文所述方案旨在比较固定于黏附基底上的野生型细胞（后文简称为悬浮状态）与处于机械限域条件下的细胞核力学特性。受限于微腔中的分离干细胞 10 µm 表现出内层核膜（INM）的部分解折叠以及肌动球蛋白收缩性的继发性增强12。在 图5C，显示细胞质中含有一到两个微珠的受限细胞。成功的受限状态将清晰可见 通过 细胞变扁平并伸展，细胞核的横截面更宽。在受限的细胞中，核膜进一步展开，与悬浮状态的细胞相比，应显得更加平滑。图5C).

力-时间与力-形变分析
所得结果的分析在很大程度上取决于所研究的样品以及关注的科学问题，因此无法在此进行泛化。例如，分析压痕测量数据的一种常用方法是通过将修正的赫兹（Hertz）模型拟合到力-压痕数据中，从而提取杨氏模量57。然而，此类分析所依赖的假设需要仔细评估，并非在所有情况下都成立（例如，所研究结构需为各向同性、均质、具有线性弹性，且压痕深度小于压头半径）。因此，本文仅考虑不依赖模型的测量方法，以便在不同实验条件下对所研究结构的力学行为进行比较。

作为起点，在特定压痕深度下测量力-位移曲线的斜率，可提供细胞核结构刚度58（一种与模型无关的参数）的量化指标。随后可从多个样本中采集该数值，并在不同实验条件和样本扰动之间进行比较。

压痕测量
在下文中，我们重点关注细胞在受限条件下发生形变时细胞核的力学响应。本方案第8步中的实验通常在约2-3 µm的压入深度下产生高达200 pN的力峰值。然而，这些数值可能因细胞类型和实验条件的不同而存在显著差异，较软的细胞核在相同压入深度下会产生更小的力。因此，为了准确表征细胞核的力学性质，需要在测量力的同时精确测量细胞核的形变。在本节中，我们将通过典型的力-压痕测量结果来获取细胞核的刚度。

在图6中，我们展示了悬浮且受限细胞中细胞核远端和近端的形变情况。可观察到丰富的力学行为。在典型的粘附基底上的悬浮细胞中，微珠对细胞核产生明显的压痕，同时在重复推压过程中细胞核也发生轻微位移。我们通过分析Hoechst染色细胞核荧光成像获得的明暗图（kymograph）来测量微珠对细胞核的压入程度。可使用Fiji软件中的Multi Kymograph插件沿压痕方向轻松生成明暗图（图6A、B），然后导入Matlab（版本2021，Mathworks）进行进一步处理。我们对原始强度曲线拟合了一个阶跃函数，以追踪压痕路径上细胞核边界边缘的变化。如图所示，该方法能够准确反映细胞核形状的变化（图6和图S2）。我们采用以下双S形曲线作为阶跃函数的解析形式：

静态平衡，I(x)=(A-B)/(1+exp(...))，用于数据建模的方程，逻辑函数。         （公式 1）

此处， x1 和 x2 表示细胞核的远端和近端边缘，而 A 和 B 分别为图像蓝色通道（Hoechst 染料）的最大灰度值和背景灰度值（图 6B）。边缘宽度已被考虑（e0 = 0.25 mm）。尽管凹陷的近端核边缘（x2）遵循光镊程序在微球-细胞核接触后所施加的轨迹，相对的远端边缘（x1)表现出黏弹性材料（如细胞质）所预期的弛豫动力学特性图6D）。相比之下，受限于 10 µm 高微腔室在细胞压痕过程中未表现出细胞核的此类易位行为（图6B，D）。图中还展示了 图6D，细胞核后缘在微珠从近端推动时保持不变，这很可能是因为细胞收缩力和摩擦力较强，抵抗了压痕力的作用。为了获得正确的形变深度，需测量位移 x1 从凹陷测量值 x2 中减去：Δx = x2 - x1 （另请参见 图6D).

力数据的分析
导致细胞核变形的力是通过光学捕获微珠处光动量的变化来测量的（图7A）。在施加梯形轨迹时（步骤8.4.3，图7B），所受的力最初呈线性增加，直到光阱停止移动，随后松弛至一个稳态值。这种行为表明材料具有黏弹性，表现出损耗模量和储能模量。在压痕事件发生后，力迅速达到一个峰值 Fp，随后发生应力松弛（图7C）：

用于光谱数据分析的荧光衰减方程 F(t) 示意图。          （公式 2）

其中，F0 是弹性组分的储存力，f(t) 是无量纲的松弛函数。我们通过以下三种方式分析了这一行为：

1. 考虑一个具有指数应力松弛的标准线性固体，即 f(t) = e-t/τ，其示意图见图7C插图。

2. 使用通用的双指数衰减函数：
F(t) = A + B1e-t/τ1 + B2e-t/τ2。

3. 使用幂律后接指数衰减函数59：
f(t) = t-pe-t/τ，拟合结果见图7C。

虽然模型1的拟合可以直接进行，但我们建议分别对模型2和模型3估计参数（τ1, τ2）和（p, τ）的初始猜测值。这可以通过分别在对数-线性（图7D，左）和对数-对数（图7D，右）坐标系中对数据进行直线拟合来实现。表S3总结了对图7中示例分析的结果。在接下来的部分中，我们将考虑使用幂律与指数律的组合来表征细胞核的力学特性。

力-位移关系
同样，上述实验装置可用于获取多次压痕事件的力-位移关系。通过执行三角形程序（步骤 8.4.4，图8A），可将施加的力与形变关联，并绘制出力-压痕曲线。一个典型的实验结果如图8B所示，其中在微珠接触到细胞核之前，基线平坦；一旦接触发生，斜率平滑变化。在噪声较大的数据中准确识别真实的接触点具有挑战性，需谨慎判断接触区域是否适用于弹性模型拟合60。在本项特定实验中还可观察到，后续的连续压痕导致曲线的接触点逐渐加深，表明细胞核在微珠回缩后形状恢复过慢，以及由细胞核黏弹性材料特性所决定的滞后循环发生了改变（图8C）。因此，研究者应意识到此类现象的发生，并将其纳入数据分析流程中予以考虑，或限制连续测量的次数，以避免该效应影响测量结果。

悬浮细胞和10 µm限制条件下的细胞核力学特性
上述方法用于分析悬浮在粘附基质上以及受限条件下细胞的细胞核应力松弛动力学。结果显示，限制条件导致细胞核投影面积扩大（图9A），但对细胞核刚度的影响不显著（图9B）。我们测得的应力松弛时间常数相似：未受限条件下为 τ = 6.08 ± 1.1 s，受限条件下为 τ = 4.00 ± 0.6 s，表明存在快速的黏弹性耗散，随后保留的力值对应于细胞核的弹性模量。为了排除因压痕实验初始条件不同而可能引起的实验差异，将测得的保留力归一化为压痕深度，即 单位位移受力，公式 F₀/Δx，与静态平衡分析相关。。该参数反映了细胞核刚度，描述了产生特定压痕所需的力或应力。在受限和未受限条件下，我们获得的细胞核刚度相似：单位位移受力，公式 F₀/Δx，与静态平衡分析相关。 = 20.1 ± 12.6 pN/µm 和 单位位移受力，公式 F₀/Δx，与静态平衡分析相关。 = 24.6 ± 13.6 pN/µm（均值 ± 标准差）。

显微镜下的琼脂糖凝胶装置；光镊示意图；染色与分析的细胞实验流程。
图 1：斑马鱼胚胎在单细胞（合子）阶段的显微注射。（A）注射板：使用三角形注射板进行注射操作。该板由含1%超纯琼脂糖的E3（卵培养基）制成。右侧展示其俯视图与侧视图。（B）胚胎定位：使用毛刷轻轻调整胚胎方向，使其单细胞清晰可见且易于针头接触。建议将胚胎调整至细胞位于针头对侧的位置，如示意图所示。（C）对单细胞期胚胎进行注射：用针头刺穿包围胚胎的透明带及单个细胞。确保针尖位于细胞内部，随后释放压力完成注射。（D）将胚胎在28–31 °C条件下孵育，直至发育至囊胚（球形）阶段（4 hpf）。随后进行细胞分离实验流程与细胞染色（步骤2），并制备含有悬浮或受限细胞的光镊捕获腔室，结合相应的基底表面涂层（步骤3）。请点击此处查看本图的高清版本。

光镊装置、示意图及用于光力测量和捕获模块的设备。
图 2：光镊装置的制备。（A）将聚二甲基硅氧烷（PDMS）以确定的高度旋涂到玻璃底培养皿上。由于离心力的作用，PDMS 液滴会均匀铺展。（B）利用 PDMS 层制备样品腔室。1：用解剖刀切割出一个方形，2：用刀豆蛋白 A（ConA）包被内孔，洗涤后接种细胞；3：用载玻片或盖玻片覆盖以密封孔腔。（C）用解剖刀切割方形并用镊子移除 PDMS 孔腔的照片。（D）将光力传感器的收集透镜安装在捕获腔室上方。一滴浸油作为收集透镜与上层玻璃盖片之间的浸没介质。示意图未按比例绘制。降低收集透镜时需小心，避免接触样品皿的玻璃盖片。（E）力检测单元与样品接触的照片。（F）实验装置示意图。光学微操作模块使用连续波激光器（5 W，λ = 1064 nm），通过半波片（HWP）和偏振分束器（BS）调节功率。经一对声光偏转器（AOD）调制后，激光耦合至倒置显微镜的上部落射荧光端口。激光束被一个 950 nm 短通二向色镜（IR-DM）反射，允许荧光激发和发射光透过。捕获激光被导入显微镜的后部落射荧光端口（上部转塔）。光镊在水浸物镜（60×，NA = 1.2）的焦平面上形成。光力传感器由显微镜转塔承载，使用高数值孔径（NA）的油浸物镜收集来自光镊的出射激光。同时，力传感器提供明场照明。共聚焦转盘单元连接至左侧端口，配备两个集成激光引擎（ILE），可控制七种荧光激发激光和两个背照式 sCMOS 相机，实现并行双荧光染料成像。Abb：TI，透射照明器；FS，视场光阑；AOD，声光偏转器；HWP，半波片；CAM，相机。（G）光镊设备的照片。红色圆圈标示可手动切换至光路中的伯特兰透镜。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞操作示意图与图表，显示实验设置中随时间变化的位置变动
图 3：选择合适的样本与参数。 （A）一个孤立的斑马鱼前体干细胞的代表性图像，其内单个微球体被置于靠近细胞核的位置，以进行压痕实验。比例尺 = 10 µm。（B）典型的光镊移动轨迹；压痕深度 5 µm；压痕速度 = 5 µm/s；松弛时间 10 s。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜示意图；GPI-GFP蛋白定位，1μm微珠，激光Z轴位置设置，细胞成像。
图4：斑马鱼胚胎发育过程中微珠的定位。将0.5 nL的1 µm红色荧光微珠与GPI-GFP mRNA（100 pg/胚胎，定位于质膜）共同注射到野生型（WT）胚胎中，以观察微珠的分布情况。（A-D）注射后5小时，固定于0.75%琼脂糖中的胚胎内微球的分布情况。（A）明场与荧光图像。微珠在胚胎组织中均匀分布，如共聚焦显微图像所示。（B）共聚焦荧光Z轴堆栈图像的最大投影。微珠根据其在图像堆栈中的Z轴位置，以从紫色到黄色的颜色编码表示。紫色/品红色对应最外层的微珠/细胞（EVL；上皮包被层；或位于EVL表面附近的前体干细胞），黄色对应内部的微珠（前体深层细胞），如右侧示意图所示。（C）对应于（B）中橙色框区域的子堆栈的截取图像及其最大投影：大量深层细胞含有1-2个微珠。（D）对应于（B）中品红色框区域的子堆栈的截取图像及其最大投影：部分EVL细胞含有1-2个微珠。（E）24小时后（24 hpf）固定于0.75%琼脂糖中并用三卡因麻醉的胚胎的明场图像及其Z轴堆栈的最大投影。胚胎预先用三卡因孵育15分钟。从左至右：微珠（1 µm直径）、GPI-GFP及图像叠加。微珠分布于胚胎全身。各图中标尺尺寸已在图中标注。请点击此处查看该图的放大版本。

使用荧光标记进行细胞结构分析；显微镜图像显示细胞组分和DNA。
图5：经不同标记的分离自斑马鱼的前体干细胞。（A）悬浮细胞的透射光显微镜图像，显示注射了1个（上图）或2个（下图）微珠。青色箭头指示微珠位置。（B）经不同染色处理的悬浮细胞的荧光共聚焦图像。左上图：Lap2b-eGFP（内层核膜，80 pg/胚胎）和H2A-mCherry。右上图：GPI-GFP（质膜，100 pg/胚胎）以及DNA-Hoechst（染色方法见第2节）。左下图：MyI12.1-eGFP（转基因品系）和DNA-Hoechst。右下图：Calbryte488和DNA-Hoechst（染色方法见第2节）。（C）受限生长细胞的透射光显微镜图像，显示注射了1个（上图）或2个（下图）微珠。青色箭头指示微珠位置。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

静态平衡分析；强度与距离关系图；显微成像；生物物理学数据。
图 6：通过旋转圆盘显微成像估算细胞核形变。（A, B）在（A）悬浮细胞和（B）受限细胞中对细胞核进行压痕实验的时间序列图像。比例尺：10 µm。图中显示了Hoechst标记的细胞核在压痕前5秒、压痕过程中以及压痕后5秒的代表性图像（白色箭头指示光镊捕获的微球位置）。沿压痕方向（红线，右侧面板）生成的时空图（kymograph）。x1 和 x2 是从强度分布拟合到公式1中提取的细胞核在压痕实验期间的远端边界和近端边界（靠近微球）。（C）沿压痕方向在三个不同帧（压痕前、压痕中、压痕后）的强度分布曲线，并通过拟合公式1确定细胞核边缘的远端位置 x1 和近端位置 x2。（D）悬浮细胞和受限细胞（10 µm）在压痕实验过程中 x1(t)（蓝色）和 x2(t)（琥珀色）的代表性轨迹。阴影区域表示压痕阶段，x1 与 x2 之间的距离表示细胞核直径。请点击此处查看该图的高清版本。

光镊示意图，含力图与方程；用于研究动态力学特性。
图7：力信号处理。（A）光镊捕获微球在压入时使细胞核发生形变的示意图。核膜与光镊力由黑色箭头表示。出射光束动量的变化由绿色箭头 Pout 表示。（B）在重复的核压入实验中，光镊捕获微球所经历的捕获轨迹（上）和受力（下）。（C）在达到最大压入深度时的力峰值之后的力弛豫衰减。插图显示了一个标准线性固体的示意图，其动力学行为可近似描述此处的唯象观测结果。（D）左图：归一化力的对数随时间的变化。阴影区域表示用于拟合双指数衰减（红线）的数据区间。右图：归一化力的对数随时间对数的变化。阴影区域表示用于拟合幂律的数据区间。请点击此处查看该图的放大版本。

光镊实验；力与时间、光阱位置；用于科学数据分析的图表。
图 8：采用三角形光阱位移的力压痕实验流程。（A）在10 µm限域高度的细胞上进行三角形压痕实验时，x1(t)（蓝色）和x2(t)（琥珀色）的代表性轨迹。上图：光阱位置。中图：细胞核形态分析。x1与x2之间的距离表示细胞核直径。下图：力信号。（B）八次连续压痕过程中力与光阱位置的关系。（C）每次连续压痕事件中细胞核耗散的演变，由力-位移曲线的加载与卸载段之间的滞后回线计算得出。请点击此处查看此图的放大版本。

比较悬浮状态与受限状态下细胞的投影面积和刚度的点图；统计分析。
图9。细胞在悬浮状态（粘附表面）及梯形微环境限制下的核特性。（A）悬浮状态及10 µm限制条件下细胞核的投影面积。黑色条代表中位数。（B）悬浮状态与受限状态下细胞核的刚度。黑色条代表中位数。P值通过MatLab进行Kruskal-Wallis检验获得。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表1：由光镊软件定义的梯形轨迹。第一行（第二行）为光阱在x（y）方向上线性移动的距离。第三行设定各步持续时间，单位为秒。该轨迹由七个点组成，对应于图7B中针对细胞核施加两次的梯形加载。请点击此处下载该表格。

补充表 2：由光镊软件定义的三角形轨迹。 与表 2 类似，该轨迹由 16 个点组成，对应 8 次压痕事件，压入深度为 5 µm，速度为 2.5 µm/s。请点击此处下载该表格。

补充表3：数据拟合参数 图7. IG：初始猜测。 请点击此处下载该表格。

补充图S1：光力传感器校准与动量基线补偿。 (A辅助相机（AUX）成像的视场光阑 图2通过伯特兰透镜观察，可见浸油中存在一个气泡，但该气泡在目镜中不可见。B) 清洁光路。为准确对齐，打开视场光阑并使其与 NA = 1.2 的光锥重合。C样品平面图像。红色方框表示光镊工作区域。比例尺： 20 µm. (D) 沿C图中白色双箭头所示方向测量视场范围内的光阱功率。红色曲线表示未施加校正时的光阱功率变化；蓝色曲线表示在整个视场范围内完成校正后的光阱功率。E动量基线在同一范围内的X分量。红色为未校正的曲线，蓝色为针对陷阱光功率校正后的曲线，绿色为使用制造商软件中的全局偏移补偿（Global Offset Compensation）对动量基线校正后的曲线。F) 与 E 中 Y 分量相同。请注意，在正常操作下，阴影部分组件用于力学和力的测量，例如沿 x 坐标移动时的 x 方向力分量以及沿 y 轴移动时的 y 方向力分量。在完成所有校正后，RMSD 噪声为 <获得 0.5 pN。 请点击此处下载此文件。

补充图 S2：由于捕获能力较弱导致的常规实验失败。 (A) 显示因珠子逃逸出光镊而导致的常规操作失败时细胞核凹陷的显微轨迹图。由于珠子脱离捕获，仅可见短暂的短时变形。重要的是，即使没有珠子，光镊激光仍继续移动以完成预设轨迹（绿色虚线）。比例尺 = 10 µm. (B上图：捕获位置随时间的变化。 中图：压痕处近端和远端细胞核边缘的边缘追踪结果。注意，与在粘附基底上分离细胞的完整实验中常见现象一致，未压痕时远端边缘不发生移动。 下图：力随时间的变化，显示微球丢失，表现为热噪声减小以及力突然降至零。 请点击此处下载此文件。

补充图 S3：注射胚胎的存活率。 根据方案中所述浓度，向胚胎注射 1 µm 微珠和 100 pg/胚胎的 mRNA，与未注射胚胎相比，在受精后 24 小时内未显示出显著差异。数据来自三次独立实验，每项实验每组条件胚胎数量 N > 21，显示均值及标准差。请点击此处下载该文件。

讨论

在本实验方案中，我们描述了一种在活细胞内检测细胞核力学特性的独特方法。与其他力谱技术不同，非侵入性光镊技术使我们能够将细胞膜和细胞骨架的贡献与细胞核刚性分离开来。重要的是，光学微操作与多模态显微镜兼容，可使研究者同时研究细胞核力学生物学中涉及的多种过程。作为代表性结果，我们采用DNA-Hoechst染色法，在施加数百皮牛顿量级作用力进行压痕操作的同时，测量了细胞核的形变情况。

本方法在本方案所述示例之外的潜在应用
能够在活细胞内部进行无外部扰动的定量力学信息提取，为大量前所未有的研究机会打开了大门，而这些机会才刚刚开始被探索。因此，本文介绍的光学微操作平台方案可扩展至更为复杂的实验，具有极高的灵活性。声光偏转器（AOD）可生成多个光镊，用于在细胞不同位置同步进行力学测量，也可用于宽频率范围内的主动微流变学研究51,61。如前所述，在压痕过程中产生的力学响应可能超过光镊的最大捕获力，导致微球从光阱中逃逸。在此情况下，可通过AOD配置力反馈系统，以钳制光学力。综上所述，多种微流变学方法，例如本方案中描述的应力松弛，以及主动微流变学或蠕变柔量，均可通过该平台实验获取，并利用新型软件包进行深入分析61,62,63,64,65。此外，施加力的对象不仅限于细胞核，原则上还可用于测量多种细胞内结构，甚至在复杂组织中进行操作，例如在完整血管内捕获流动的红细胞66,67，或捕获并形变叶绿体和线粒体68。光动量校准不依赖于被捕获物体的形状和大小，因此可对任意形状的力探针直接进行力学测量38,39。使用注射微球的方法使我们能够以相对较低的激光功率在细胞核上施加较大力量，相较于直接操控细胞结构更具优势69,70,71。然而，只要折射率差异足够大，则无需外加力探针，细胞内细胞器可被直接操控而无需注射微球（未发表观察结果及参考文献70）。

对本方法进行潜在改进以拓展其应用范围
可根据实验需求注射不同尺寸的微珠，但必须设置相应的对照。例如，若需研究较晚阶段的细胞，可注射较小的微珠，但这会降低光镊所能施加的最大作用力（如参考文献55所示）。注射较大的微珠可施加更高的力，但其尺寸或注射时的发育阶段可能会影响胚胎的正常发育。在无法使用微珠注射的实验中，仍可通过光操控具有与细胞质不同折射率的多种细胞器，从而产生可通过光动量变化测量的光力42。如上所述，Bambardekar 等人已采用这些方法对果蝇胚胎中的细胞间连接进行形变操作70。同样，细胞核的折射率低于周围介质44，因此可在无微珠条件下实现压痕操作（未发表观察结果及参考文献72），尽管捕获强度较低。因此，细胞核难以被稳定捕获，容易逃逸出光阱。

旋涂法制备PDMS间隔层 通过 一种便捷快速的方法，但对于无法接触微米/纳米加工设备或工程实验室的研究组而言可能难以实现。因此，可使用实验室胶带或帕拉膜（parafilm）轻松组装间隔层（步骤4）。该方案还可通过制造微流控通道进行改进，以实现将单个细胞自动导入预设的测量孔或特定高度的腔室中，从而在同一标本内评估限域效应。然而，此类微流控装置必须设计为适配显微镜物镜与光力传感器收集透镜之间的空间，约为2 mm（见步骤3）。需注意，光力传感器必须置于适当高度，以避免散焦引起的光学像差影响光子动量的测量。

其他修饰可能包括更换生物报告分子。我们发现 Hoechst 荧光在光谱上会渗漏到 GFP 通道中，因此我们更倾向于将其与标记 mCherry 的组蛋白 联用，作为细胞核标记物，以实现两个荧光通道的同步检测。或者，也可使用靶向内层核膜的标记物（如 Lap2b-GFP）轻松追踪细胞核形变（图 2）。

细胞核的压痕形变量约为2-3微米，我们可通过衍射受限的转盘共聚焦显微镜图像分析对此进行精确定量。对于更坚硬的细胞核或更小的作用力，采用该方法所获得的压痕形变将难以准确测量。然而，该 绝对力校准的光镊也可用于对被捕获微珠的位置测量进行校准 原位 使用具有纳米级精度的BFP干涉测量法51通过该方法，电压信号和光学力传感器可通过参数转化为捕获探针的位置 β [nm/V]，而该不变参数 α [pN/V] 通过上述光动量校准产生力的数值41 （详见下文）。

故障排除
我们发现在实验过程中可能出现以下问题：

未形成稳定的光镊，微球容易逃逸
显微镜物镜表面的任何污物或校正环未对准均可能导致无法形成稳定光镊。若无法立即解决问题，应测量物镜的点扩散函数。如果目标样本位于光学密度较高的组织内部，激光焦点可能会产生严重的光学像差，从而导致捕获不稳定（该效应在分离的单个细胞中通常可忽略，但在较厚的组织中更为明显）。当细胞核刚度过高时，其恢复力可能超过光镊的逃逸力，导致微球丢失，压痕程序失败。初始阶段，靠近光镊的细胞核膜边缘几乎不发生形变（图S2A）。当此情况发生时，光镊激光不再受到作用力和布朗运动的影响，导致受力降至零，信号噪声减小（图S2B）。若出现此现象，可尝试提高激光功率以增强光镊强度，减小梯形轨迹推动微球进入细胞核的振幅，或将在光镊中微球的初始位置设置得离细胞核更远一些。

细胞在刺激过程中发生移动
如果细胞贴附不充分，在进行细胞内压痕操作时，光镊梯度力陷阱会带动细胞移动，从而导致所测得的核力学参数及基础力学数据出现人为假象。为防止整个细胞发生位移，我们建议增加表面细胞黏附分子的浓度，例如刀豆球蛋白A（ConA）。

初始动量补偿
如果光镊平台中没有提供初始动量补偿程序（步骤 6.5），则需要校正一个虚假的、与力无关的基线信号。即使未捕获微珠，该信号也会在力曲线中表现为斜率（图 S1E）。为进行校正，需在无微珠的情况下，在细胞外相同位置重复执行相同的轨迹操作。为此，可通过载物台控制将细胞移离光阱。作为参考，在我们的系统中，200 mW 激光功率下，整个视场范围内力的偏移量变化约为 5 pN；因此，在较短的轨迹中该偏移可忽略不计。或者，也可使用压电扫描载物台移动样品上的细胞，从而保持激光位置不变。

本方案的关键步骤
微球应于胚胎右侧的1细胞期进行注射，以确保在胚胎中实现最大程度的分布。微珠不应具有荧光性，以免光线泄漏至成像所用的荧光通道。例如，即使普通的红色荧光微珠，由于其亮度较高，在用于Hoechst染色后细胞核成像的蓝色通道（激发波长：405 nm；发射波长：445 nm）中也明显可见。细胞与基底的稳定附着对于防止在压痕程序期间发生侧向位移至关重要。若细胞在程序中移动，则测得的力会被低估。若此类情况频繁发生，应优化附着方案。对于组织培养细胞，其他细胞黏附蛋白（如纤连蛋白、胶原蛋白或聚-L-赖氨酸）也可实现满意的附着效果（未发表观察结果）。在受限过程中，细胞会受到突然且强烈的机械应力。这可能导致细胞损伤，若操作不够谨慎，实验者常会遇到细胞破裂的情况。此外，若受限高度过小，所有细胞均可能出现核膜破裂或不可逆损伤。为减轻此类问题，应更缓慢地下降上层盖玻片和/或增加盖玻片之间的间距。

该技术的局限性及克服建议
该技术的一个明显局限是激光对组织深层区域的穿透能力，这会导致像差和捕获不稳定。因此，穿透深度的下限取决于样品的透明度、可采用的像差校正方法73以及所使用的激光功率。需要注意的是，较高的激光功率会引起微球附近样品的热激发。然而，我们已尽量减少由1064 nm波长激光光斑引起的样品加热，以避免对生物样品产生可能的热相关应力74。

另一个局限性是可测量的最大力。尽管直接检测光动量能够实现远超光镊线性响应范围的力测量40,41，但所能施加的最大力通常仅为数百皮牛顿量级。这一限制主要源于激光功率以及软性生物材料的损伤阈值，同时折射率差异通常不超过0.1或0.3，也制约了力的提升44。已有多种方法被提出以提高力检测的上限，例如使用结构光75、抗反射涂层微球76、高折射率颗粒77或高掺杂量子点78。

通过BFP干涉测量法，光镊可用于纳米尺度的位置测量，此时小球在光阱中的位置为 Δx =  βSx，其中Sx为传感器的电压信号， β [µm/V] 可根据不同方案进行实时校准35,54。对于光学力传感器，可以证明电压到力的不变换算系数 α [pN/V] 与 β 及光阱刚度k [pN/µm] 直接相关，关系式为 α = kβ 37。在光学成像无法检测到小球微小位移的实验中，该策略可用于在力测量的同时补充微小位置变化的检测。一个典型应用是将本文介绍的实验流程应用于非常刚硬的细胞核，此时在合理激光功率（200–500 mW）下产生的力不足以引起足够大的压痕形变。在这种情况下，需先将小球与细胞核接触，并在测量前校准光阱刚度（步骤8.6）。细胞核的压痕形变d 随作用力的变化关系可间接确定为：

d = xtrap - F/k

其中 xtrap 为光阱位置。与恒定的光动量因子 α [pN/V] 不同，因子 β [µm/V] 在每次实验前均需校准，因其取决于多种决定捕获动力学的局部变量，例如颗粒尺寸、光阱光斑尺寸以及相对折射率。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

MK 承认获得西班牙经济与竞争力部通过国家计划（PGC2018-097882-A-I00）、欧洲区域发展基金（FEDER，EQC2018-005048-P）、R&D 卓越中心塞韦罗·奥乔亚计划（CEX2019-000910-S；RYC-2016-21062）、Cellex 私人基金会、Mir-Puig 基金会，以及加泰罗尼亚自治区政府通过 CERCA 和研究计划（2017 SGR 1012）提供的资金支持，此外还获得欧洲研究理事会（ERC，MechanoSystems）和人类前沿科学计划（HFSP，CDA00023/2018）的资助。V.R. 承认获得西班牙科学与创新部对 EMBL 合作关系、塞韦罗·奥乔亚卓越中心的支持，以及西班牙科学与创新部国家计划（BFU2017-86296-P，PID2020-117011GB-I00）和加泰罗尼亚自治区政府（CERCA）的资助。V.V. 承认获得由欧盟“地平线 2020”研究与创新计划资助的 ICFOstepstone 博士项目的支持，该项目受玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议（665884）资助。我们感谢 Arnau Farré 对稿件的审阅；Maria Marsal 在 24 小时受精后胚胎成像与封片方面的帮助；以及 Senda Jiménez-Delgado 在斑马鱼显微注射方面的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#1.5 22 mm 盖玻片Ted Pella260148
#1.5 22x60 mm 盖玻片Ted Pella260152
#1.5H 玻璃底培养皿WillcoGWST-5040
10 微米微珠Supelco72986
1 毫米玻璃毛细管Harvard Apparatus30-0020 GC100F-15
1 微米聚苯乙烯微珠Sigma89904
1 微米红色荧光微珠ThermoFisherF8816
琼脂ThermoFisher16500500
成像相机 sCMOSAndorSona-4BV11-UNI
辅助相机（图 3，AUX）Blackfly, FLIRBFS-U3-200S6M-C
Calbryte 520AAT Bioquest520 AM
离心机Eppendorf5453000011
刀豆蛋白 ASigmaC5275
DMEMSigmaD2906
DNA-HoechstThermoFisher33342
双面透明胶带Biesse Adesivi
E35 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂，0.33 mM MgSO₄
Eclipse Ti2Nikon
镊子Fine Science Tools11252-20
GPI-GFP
H2A-mCh
图像采集软件Fusion-Andor
浸油Cargille型号 B：16484
红外防护眼镜ThorlabsLG1
Lap2b-eGFP
微量移液器（Micro loader pipette）EppendorfGELoader
显微注射仪World Precision InstrumentsSYS-PV820
MicroManager 2.0
微米刻度载玻片ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 分度
矿物油SigmaM3616
电动载物台ASI
拉针仪Sutter Instrument Co.型号 P-97
光镊平台Impetux OpticsSensocell
光镊软件（LightAce）Impetux Optics
PDMSSigmaSylgard 184
PDMS 固化剂SigmaSylgard 184
后期处理软件（Matlab）Mathworks
无 RNA 酶水ThermofisherAM9937
短通二向色镜（图 3，IR-F）SemrockFF01-950/SP-25
旋涂仪Specialty Coating SystemsSpincoat G3P-8
转盘共聚焦显微镜AndorDragonFly 502
体视显微镜Leica M80
三角形显微注射模具Adaptive Science ToolsTU1
通用烘箱MemmertUNB 200
水浸物镜NikonMRD07602

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使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量
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