需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用机械臂对Toxoplasma gondii和Neospora caninum进行高通量筛选的核苷三磷酸水解酶活性检测

816 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62874

⸱

2022年7月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

Toxoplasma gondii 和 Neospora caninum 感染可发生于人类和动物，导致严重的健康问题。这两种寄生虫具有相似的核苷三磷酸水解酶，并在增殖与存活过程中发挥重要作用。我们建立了一种需要使用机械臂的高标准化酶活性检测方法。

摘要

原生动物寄生虫可感染人类及多种温血动物。Toxoplasma gondii 是一种重要的人类原生动物寄生虫，常见于 HIV 阳性患者、器官移植受者和孕妇中，可导致严重的健康问题——弓形虫病。另一种重要的原生动物 Neospora caninum 与 Toxoplasma gondii 具有许多相似之处，可在动物中引起严重疾病，例如犬和牛的脑脊髓炎以及多发性肌炎-多发性神经根炎，导致犊牛死产。这些寄生虫均表现出类似的核苷三磷酸水解酶（NTPase）。Neospora caninum 拥有 NcNTPase，而 Toxoplasma gondii 拥有 TgNTPase-I。这些酶被认为在寄生虫的增殖与存活过程中发挥关键作用。为了筛选能够预防原生动物感染的化合物和/或提取物，我们将这些酶作为药物发现的靶点。下一步是建立一种新型、高灵敏度且高准确性的检测方法，通过将传统的生化酶活性检测与荧光检测相结合，以测定 ADP 含量。我们还验证了该新型检测方法符合对两种原生动物酶进行高通量筛选（HTS）的标准。我们开展了高通量筛选，分别从两个合成化合物库和一个来源于海洋细菌的提取物库中鉴定出 19 种化合物和 6 种提取物。本研究详细介绍了如何开展高通量筛选，包括试剂、设备、机械臂等的准备信息。

引言

机器人技术已被确立为在工业和制造工程以外的多个领域实现重大突破的复杂而强大的工具，例如生物化学、分子生物学和临床研究，尤其是高通量筛选（HTS）1,2,3。Toxoplasma gondii 是一种重要寄生虫，属于单细胞寄生真核生物4，可导致人类5和许多恒温动物4出现严重健康问题，引发弓形虫病，该疾病在艾滋病患者6、器官移植受者7以及孕妇8中尤为严重。Neospora caninum 属于顶复门（Phylum Apicomplexa）9，主要感染犬类和牛类6，导致犬类发生脑脊髓炎和多发性肌炎-多发性神经根炎10,11，以及牛类流产12,13。此外，Neospora caninum 在形态学和系统发育上与Toxoplasma gondii 具有高度相似性9,14。同时，它们均表达核苷三磷酸水解酶（NTPase；EC3.6.1.15）14，这类酶与传统的外源性ATP酶存在显著差异14。这些寄生虫可产生大量NTPase蛋白，占其总蛋白的2%–8%，并在速殖子阶段作为潜伏酶发挥重要作用15。值得注意的是，这些蛋白在致密的分泌颗粒中被浓缩16，并被分泌至寄生泡内16。从生化酶学特性来看，NTPase可被二硫苏糖醇（dithiothreitol）激活17。推测诸如二硫醇化合物、尚未鉴定的二硫醇-二硫键氧化还原酶类酶或其他具有类似性质的因子可能也具有激活作用，但这些因子在寄生虫中尚未被鉴定出来。然而，该酶在促进速殖子从感染的宿主细胞中释放过程中发挥着重要作用17。

刚地弓形虫 具有两种NTP酶同工型18I型酶TgNTPase-I和II型酶TgNTPase-II18前者优先利用三磷酸核苷作为底物18后者可水解三磷酸和二磷酸核苷18氨基酸水平上的同源性为97%18. 新孢子虫（Neospora caninum） 也具有一个名为 NcNTPase 的 TgNTPase-I 同源物19氨基酸水平上的同源性为73%19Asai 教授和原田教授利用NTPase生成了两种重组体 E. coli 并根据先前报道的方法更换了这些基因的组成型活性突变体20他们慷慨提供了两种活性突变体。这两种酶均可将ATP转化为ADP。 体外20最近，我们通过检测酶水解产生的ADP含量，测定了NTP酶的活性。最终，通过结合荧光检测与酶促反应来定量ADP含量的方法，成功建立了高标准的检测体系，该方法此前已有报道。21,22我们还进行了高通量筛选（HTS）22.

本研究介绍了新型高精度和宽动态范围检测方法的详细步骤21，以及如何制备试剂以测量酶活性，并利用机械臂进行高通量筛选（HTS）来开发荧光强度的详细说明。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 重组TgNTPase-I和NcNTPase的表达与纯化

  1. 准备表达质粒并将其导入 E. coli 菌株 BL21
    ​注意：有关构建体和实验步骤的详细信息见先前的报道14本研究中，TgNTPase-I 和 NcNTPase 的组成型活性突变体均由 Asai 教授和 Harada 教授惠赠。

2. 将生物荧光反应溶液制备并加入到孔板中

  1. 按照表1所述配制2x生物荧光反应溶液，用于384孔板格式的400孔检测，制备总量为2 mL的主混合液。
  2. 除刃天青（Resazurin）和N-乙基马来酰亚胺（N-ethylmaleimide）外，其余试剂均使用蒸馏水（DW）配制指定浓度的储备液。剩余两种试剂则用DMSO溶解至相应浓度。随后将所有试剂于-30 °C保存，直至实验时使用。
  3. 向368个孔（384孔板格式）中每孔加入15 µL的2x生物荧光反应溶液。
    ​注意：第一块板作为试剂储备板，以确保有足够的试剂重复进行两次实验。

3. 将待测化合物或提取物加入检测板各孔的底部

  1. 使用机械臂从文库母板（包括待测化合物）中取0.5 µL每种化合物，加入到平板底部。
  2. 向阴性对照和阳性对照中各加入0.5 µL DMSO。

4. 酶反应混合物的制备及反应的开始

  1. 按照表2配制酶反应溶液。
  2. 将NTP酶（终浓度为0.0002 µg/mL）加入50 mL酶反应混合液中，迅速混匀后转移至塑料储液槽中。
  3. 使用机械臂除阴性对照孔外，同时向每孔注入4.5 µL反应液。
  4. 在同步注射前，用PBS替代酶，加入等量的酶反应混合液。
  5. 将酶标板置于37 °C培养箱中孵育10分钟。

使用微孔板读板仪实时测定酶活性

  1. 孵育10分钟后，立即使用机械臂同时向每个孔中加入5 µL的2倍生物荧光反应液。
  2. 暂时停止机械臂，使每个吸头中的溶液悬停在即将放置培养板的位置上方。
  3. 待检测板放置到位后，重新启动机械臂。
    注意：为避免生成的ADP信号饱和，应立即测定荧光强度。
  4. 迅速离心培养板（200 × g，1分钟），然后将培养板放入酶标仪中。
  5. 开始实时检测荧光信号，激发/发射波长为540 nm/590 nm，每分钟读数一次，持续1小时。

6. 结果分析

  1. 根据各实验组中指定的重复样本，计算均值 ± 均值标准误（SEM）；重复实验以确保结果一致性。
  2. 使用学生氏t检验进行统计学显著性分析 t测试。
  3. 若计算值具有统计学显著性，则 P 值为 P < 0.05.
  4. 使用以下公式计算信噪比（S/B）、信噪比（S/N）和Z'因子：
    S/B = 平均配体信号/平均载体信号
    信噪比 = （配体平均值 - 溶剂对照平均值）/ 溶剂对照标准差
    Z'因子 = 1 - (3 × 配体标准差 + 载体标准差)/(配体平均值 - 载体平均值)
  5. 确保S/B、S/N和Z'-因子分别大于3、10和0.5。
    注意：请确认每个实验是否符合先前报告中所述的高通量筛选（HTS）通用标准23,24.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

该检测方法的原理总结于补充图1，并基于先前的报道12,18。本实验采用384孔板格式，如图1所示。实验中避免使用酶标板最左侧和最右侧的列。紧邻最左和最右列的两列分别用作阴性对照和阳性对照（含或不含酶，n = 16）。这使得板上其余320个化合物可被方便地检测。图1B展示了本研究中使用的酶标板、容器、机械臂、吸头及酶标仪。图1C显示了本研究的操作流程。首先，为测定荧光强度，配制2倍浓度的生物荧光反应溶液，并除最左和最右列外（共352孔），每孔分装5 µL。随后，将320种待测化合物各0.5 µL转移至384孔检测板中。接着，按照方案配制酶反应混合液。同时，除阴性对照孔外，向其余每孔重新分装4.5 µL含酶的溶液。加入酶反应混合液后，将酶标板在37 °C孵育10分钟。孵育结束后，向每孔加入等量的酶反应混合液并进行闪...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

我们成功建立了一种新颖的高动态范围和高准确度的检测方法，该方法结合了经典酶学检测与针对ATP酶反应终产物ADP的荧光检测，适用于包括Tg和Nc ATP酶在内的多种ATP酶22。为了实现高通量筛选（HTS），该检测方法的S/B、S/N以及Z'因子必须优于传统的酶学检测方法15,22。此外，该方法省去了使用盐酸等酸性物质终止酶反应的步骤，并可在1小时内每分钟对所有孔进行实时荧光测定，从而简化了操作流程，减少了误判风险，避免了因在反应已达到饱和的不同样本间选择不恰当时间点而导致的数据比较偏差。由于反应速度过快，若在不恰当的时间点进行检测，反应已趋于饱和，将无法准确测量酶的真实活性。

本文介绍了一种高效的试剂制备方法，包括酶、酶反应混合液及2x生物荧光反应溶液的配制，详细描述了如何有效使用机械臂和微孔板读数仪，并提供了所有实验步骤的具体细节。需要注意的是，该检测方法除了用于ATP酶外，还创新性地应用于激酶及其他酶的检测。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者对本研究无经济利益冲突。

致谢

本工作部分得到了日本促进科学基金（JSPS-21K06566）科学研究费补助金（C）以及药物发现、信息学与结构生命科学平台项目的支持。作者衷心感谢浅井（Keio University School of Medicine）、原田（Kyoto Institute of Technology）和Stephen Stratton分别赠送了两种重组NTP酶活性突变体，并对本文稿的准备作出了贡献。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 工位工作站 EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SX机器人臂移液系统
384 孔吸头Biotech Co., Ltd.定制生产
ADP-己糖激酶Asahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPOriental Yeast, Co, Ltd.45140000
BSAWako Pure Chemical Industries, Ltd.011-15144
Diaphorase-IUnitika Ltd.Di-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P 脱氢酶Oriental Yeast, Co, Ltd.306-50143
葡萄糖Wako Pure Chemical Industries, Ltd.049-31165
Greiner 384 孔微孔板 非结合型浅孔 黑色#784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADPOriental Yeast, Co, Ltd.44332000
N-乙基马来酰亚胺Wako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FS多功能微孔板读板仪
刃天青Wako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse 实验耗材 384 孔低剖面储液板S30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Triton X-100Nacalai Tesch, Inc.35501-02

参考文献

  1. Bianca, C. B., et al. A robotic platform to screen aqueous two-phase systems for overcoming inhibition in enzymatic reactions. Bioresource Technology. 280, 37-50 (2019).
  2. Aliaksei, V., Jan, D. B. Robot-scientists will lead tomorrow's biomaterials discovery. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 74-80 (2018).
  3. Mandeep, D., Kusum, P., Dharini, P., Nikolaos, E. L., Pratyoosh, S. Robotics for enzyme technology: innovations and technological perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105, 4089-4097 (2021).
  4. Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (1988).
  5. Michael, C., Sneller, H., Clifford, L. Infections in the Immunocompromised Host in Clinical Immunology., 3rd ed. , Elsevirer. Amsterdam, The Netherlands. (2008).
  6. Schäfer, G., et al. Immediate versus deferred antiretroviral therapy in HIV-infected patients presenting with acute AIDS-defining events (toxoplasmosis, Pneumocystis jirovecii-pneumonia): A prospective, randomized, open-label multicenter study (IDEAL-study). AIDS Research and Therapy. 16, 34(2019).
  7. Ramanan, P., et al. Toxoplasmosis in non-cardiac solid organ transplant recipients: A case series and review of literature. Transplant Infectious Disease. 26, 13218(2019).
  8. Rivera, E. M., et al. Toxoplasma gondii seropositivity associated to peri-urban living places in pregnant women in a rural area of Buenos Aires province, Argentina. Parasite Epidemiology and Control. 7, 00121(2019).
  9. Donahoe, S. L., Lindsay, S. A., Krockenberger, M., Phalen, D., Šlapeta, J. A review of neosporosis and pathologic findings of Neospora caninum infection in wildlife. International Journal of Parasitology: Parasites and Wildlife. 4, 216-238 (2015).
  10. Crookshanks, J. L., Taylor, S. M., Haines, D. M., Shelton, G. D. Treatment of canine pediatric Neospora caninum myositis following immunohistochemicalidentification of tachyzoites in muscle biopsies. TheCanadian Veterinary Journal. 48, 506-508 (2007).
  11. Bartner, L. R., et al. Testing for Bartonella ssp. DNA in cerebrospinal fluid of dogs with inflammatory central nervous system disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 32, 1983-1988 (2018).
  12. Changoluisa, D., Rivera-Olivero, I. A., Echeverria, G., Garcia-Bereguiain, M. A., de Waard, J. H. Working group "Applied Microbiology" of the School of Biological Sciences and Engineering at Yachay Tech University. Serology for Neosporosis, Q fever and Brucellosis to assess the cause of abortion in two dairy cattleherds in Ecuador. BMC Veterinary Research. 15, 194(2019).
  13. Serrano-Martínez, M. E., et al. Evaluation of abortions spontaneously induced by Neospora caninum and risk factors in dairy cattle from Lima, Peru. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaria. 28, 215-220 (2019).
  14. Matoba, K., et al. Crystallization and preliminary X-ray structural analysis of nucleoside triphosphate hydrolases from Neospora caninum and Toxoplasma gondii. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 66, 1445-1448 (2010).
  15. Nakaar, V., Beckers, C. J., Polotsky, V., Joiner, K. A. Basis for substrate specificity of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase. Molecular and Biochemical Parasitology. 97, 209-220 (1998).
  16. Pastor-Fernández, I., et al. The tandemly repeated NTPase (NTPDase) from Neospora caninum is a canonical dense granuleprotein whose RNA expression, protein secretion and phosphorylation coincides with the tachyzoite egress. Parasites and Vectors. 9, 352(2016).
  17. Silverman, J. A., et al. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. Journal of Biological Chemistry. 273, 12352-12359 (1998).
  18. Olias, P., Sibley, L. D. Functional analysis of the role of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolases I and II in acute mouse virulence and immune suppression. Infection and Immunity. 84, 1994-2001 (2016).
  19. Leineweber, M., et al. First Characterization of the Neospora caninum Dense Granule Protein GRA9. BioMed Research International. 2017, 6746437(2017).
  20. Krug, U., Zebisch, M., Krauss, M., Sträter, N. Structural insight into activation mechanism of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphatediphosphohydrolases by disulfide reduction. Journal of Biological Chemistry. 287, 3051-3066 (2012).
  21. Kumagai, K., Kojima, H., Okabe, T., Nagano, T. Development of a highly sensitive, high-throughput assay for glycosyltransferases using enzyme-coupled fluorescence detection. Analytical Biochemistry. , 146-155 (2014).
  22. Harada, M., et al. Establishment of novel high-standard chemiluminescent assay for NTPase in two protozoans and its high-throughput screening. Marine Drugs. 18, 161(2020).
  23. Kurata, R., et al. Establishment of novel reporter cells stably maintaining transcription factor-driven human secreted alkaline phosphatase expression. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19, 224-231 (2018).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  25. Nakajima-Nakano, K., Makioka, A., Yamashita, N., Matsuo, N., Asai, T. Evaluation of serodiagnosis of toxoplasmosis by using the recombinant nucleoside triphosphate hydrolase isoforms expressed in Escherichia coli. Parasitology International. 48, 215-222 (2000).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

弓形虫酶活性检测荧光检测ADP检测药物发现机械臂自动化原虫寄生虫

本文已发表

视频即将推出

联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。