利用叶片透光率的变化研究叶绿体运动 拟南芥

摘要

许多植物物种会改变叶绿体的定位以优化光吸收。本方案介绍如何使用一种简单、自制的仪器，通过检测光透过叶片时透射率的变化，来研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片中叶绿体的运动。

摘要

叶片中叶绿体的运动已被证明有助于在特定条件下减少光抑制并促进生长。通过使用共聚焦荧光显微镜等技术研究叶片中叶绿体的定位，可以深入了解叶绿体的运动机制，但此类显微镜的使用受到限制。本实验方案描述了一种利用叶片透光率变化作为叶绿体运动代理指标的方法。当叶绿体分散分布以最大化光捕获时，叶片透光率较低；当叶绿体向细胞侧壁（垂周壁）移动以避光时，透光率则较高。本方案详细介绍了如何使用一种结构简单、可自行搭建的仪器，使叶片暴露于不同强度的蓝光下，并定量测定叶片透光率的动态变化。该方法使研究人员能够对不同物种和突变体中的叶绿体运动进行定量描述，研究化学物质和环境因素对其的影响，或筛选新的突变体，例如用于鉴定从光信号感知到叶绿体运动这一过程中缺失的组分。

引言

光对于光合作用、植物生长和发育至关重要。光是最具动态变化的非生物因子之一，其强度不仅随季节或昼夜发生变化，还会因云层覆盖情况而迅速且不可预测地波动。在叶片水平上，光强还受到周围植被的密度和性质以及植物自身冠层结构的影响。植物在多变光照条件下优化光能捕获的一个重要机制是叶绿体能够响应蓝光刺激而发生运动^1,2。在弱光条件下，叶绿体沿垂周细胞壁方向展开排列（即垂直于入射光），这种现象称为积累反应，可最大化光能吸收，从而提高光合作用效率；而在强光条件下，叶绿体则向侧壁（即垂周壁）移动，这种现象称为避光反应，可减少光能吸收，降低光抑制的风险。在许多物种中，叶绿体在黑暗中还会呈现出特定的位置，该位置不同于积累或避光状态，通常介于两者之间^3,4。多项研究表明，叶绿体运动不仅对叶片短期抗逆性具有重要意义^5,6,7，而且对植物的生长和繁殖成功也至关重要，尤其是在光照条件多变的环境中^8,9。

在某些活体样本（例如藻类或叶片较薄的植物如Elodea）中，使用光学显微镜可实时直接观察叶绿体的运动¹。然而，研究大多数植物叶片中的叶绿体运动通常需要先进行预处理以诱导叶绿体移动，随后进行化学固定并制备横切片，才能在光学显微镜下观察样品¹⁰。随着共聚焦激光显微镜的引入，现已能够在完整或固定的叶片中对叶绿体的三维排列进行成像^4,11,12。这些成像技术通过提供重要的定性信息，极大促进了对叶绿体运动的理解。尽管也可以对叶绿体的定位进行量化分析（例如，图像中位于垂周壁或侧周壁位置的叶绿体所占百分比，或叶绿体覆盖的细胞表面积占总面积的百分比），但该过程十分耗时，尤其是在需要以较短时间间隔连续观察定位快速变化的情况下尤为如此^10,8。最简单的方法是通过遮蔽叶片大部分区域以保持该部分叶绿体处于黑暗状态，同时仅暴露叶片的一条狭长区域于强光下，从而检测某种野生型植物或突变体的暗适应叶片是否具备叶绿体避光运动的能力。在强光照射至少20分钟后，暴露区域的叶绿体会移至避光位置，导致该条带区域颜色明显比叶片其余部分更浅。这一现象在野生型A. thaliana中成立，但在后文将详细描述的一些叶绿体运动突变体中则不成立¹³。该方法及其多种改进形式（例如，改变叶片暴露区域的位置、调整光照强度）对于大规模筛选突变体、鉴定完全丧失避光反应、聚集反应或两者皆无的无效突变体具有重要价值。然而，该方法无法提供有关叶绿体运动动态变化过程的信息。

相比之下，本文所述方法利用光通过叶片时透射率的变化来间接量化完整叶片中叶绿体的运动：当叶绿体在叶肉细胞中因聚集反应而分散分布时，透射过叶片的光较少；而在避光反应中，大量叶绿体沿垂周细胞壁排列，透射光则较多。因此，透射光的变化可作为叶片整体叶绿体运动的间接指标¹⁴。该仪器的具体细节已在其他文献中描述（见补充文件），其基本原理是利用蓝光诱导叶绿体运动，并在设定的时间间隔内测量红光通过叶片的透射量。 最近，已有研究报道了对该系统的改进版本，该系统采用改装的96孔微孔板读数仪、蓝光LED、计算机和温度可控的培养箱¹⁵。

结合使用多种方法（包括通过光学评估叶片进行筛选，随后测量透射率的动态变化并结合显微技术）极大地促进了我们对叶绿体运动潜在机制及其生理学/生态学意义的理解。例如，这些方法促成了多种突变体的发现与表征，这些突变体在叶绿体运动的特定方面存在缺陷。例如，A. thaliana phot 1 突变体在弱光下无法使叶绿体发生聚集，而 phot 2 突变体则无法执行避光反应。这些表型是由于两种相应的蓝光受体功能受损所致^16,17,18。相比之下，chup1 突变体无法在叶绿体周围形成正常的肌动蛋白丝，而这些肌动蛋白丝对于将叶绿体移动到细胞内的特定位置至关重要^11,19。除了突变体研究外，研究人员还通过评估多种抑制剂对叶绿体运动的影响，以阐明该过程的机制。例如，使用 H₂O₂ 和多种抗氧化剂来研究这种信号分子对叶绿体运动的作用²⁰。多种抑制剂也被用于阐明钙离子在叶绿体运动中的作用²¹。除了有助于揭示叶绿体运动的机制外，这些方法还可用于比较不同物种或在不同条件下生长的突变体之间的叶绿体运动，以期理解该行为的生态学和进化背景。例如，已有研究表明，叶绿体运动通路中各种突变的影响程度依赖于生长条件^7,9，且喜阳植物的叶绿体似乎几乎不发生移动。相反，叶绿体运动对耐阴植物则非常重要^10,22,23。

这篇方法学论文以模式植物A. thaliana为研究对象，介绍了一种传输装置的使用方法，该装置是此前开发的仪器的升级版本⁹。尽管该仪器目前尚未商业化，但具备基本电子学知识的研究人员，或在工程学、物理学领域的同事及学生的协助下，均可利用价格合理的组件并依照详细的操作说明（见补充文件）完成仪器的搭建。用于构建该仪器的开源平台拥有广泛的网络支持资源以及社区论坛，可在遇到问题时提供帮助²⁴。

该方案重点介绍如何使用仪器测定叶片透射率的变化，通过标准探索性实验，使叶片暴露于广泛的光照条件下，捕捉其暗反应、积累反应和避光反应。 A. thaliana这些运行可根据实验目的进行调整，并可用于大多数植物物种。该论文提供了透射数据的示例 A. thaliana 野生型及多个突变体，并展示了如何进一步分析数据。

方案

1. 准备用于实验的叶片

1. 将8株A. thaliana植株置于黑暗环境中过夜（>6小时适用于大多数物种），以确保叶绿体进入其暗适应位置。所有重复实验的起始透射值应保持一致。
2. 或者，将8片完整叶片放入底部铺有湿润滤纸的培养皿中，盖上培养皿后用铝箔纸包裹。

2. 测试传输装置是否正常工作

1. 将传输设备连接至稳定的电源，然后按下设备的电源开关（ON/OFF 按钮）以重置仪器图1A，B).
2. 将 iPad 连接到稳定的电源，按下主屏幕按钮以激活屏幕，然后输入密码登录。
3. 按压 设置 图标，按下 显示 & 亮度 图标，按下 自动锁定，并选择 从不 通过按下此选项，确保屏幕始终保持开启状态。否则，当屏幕进入休眠时，程序将停止运行。按下 主屏幕 返回主屏幕的按钮。
4. 双击主屏幕按钮以查看已打开的应用程序，并通过将它们向上滑动至屏幕顶部来关闭所有应用程序。按下 主屏幕 返回主屏幕按钮。
   1. 找到 叶片传感器 主屏幕上的应用程序图标，或通过左右滑动屏幕找到应用。按下应用图标以打开（参见 补充文件将出现一个带有文字和白色输入区域的绿屏，用于输入信息。
   2. 确保该词 连接的 在屏幕下部会显示该提示，表明应用程序正在与传输设备通信。如果出现“Adafruit 未找到出现“”时，请检查设备是否已插入电源，然后再次按下设备上的启动按钮。
5. 在应用程序页面上填写前四个字段，以命名实验并设置无叶片且叶夹打开条件下的简短测试运行参数：
   1. 命名实验（使用8个或更少的大写字母或数字），例如，通过输入 测试 到名为的字段中 实验名称.
   2. 选择实验中将使用的不同蓝光强度的数量，例如，通过输入 3 到名为的字段中 # 光强度.
   3. 选择本次实验的蓝光强度（选择0到3000之间的整数，并用逗号分隔每个数值；参见 补充文件 关于如何将这些数值转换为LED的实际蓝光强度，例如通过输入 0,100,1000 到名为的字段中 蓝色强度.
   4. 选择每种蓝光强度照射叶片的时间长度（用逗号分隔每个数字），例如，输入 2,2,2 到名为的字段中 蓝色持续时间（分钟）.
6. 按压 开始实验 屏幕中段。屏幕下部有8个连字符及一条消息 开始实验 将出现。
   1. 确保前两分钟内LED灯不发出任何光线，然后发出微弱的蓝光，2分钟后蓝光强度逐渐增强。
   2. 确保发光二极管每分钟发出一次强红光用于测量。
      ​注意：实验进行时，应用程序页面上会显示八个传感器各自的数值，且数据每分钟更新一次。确保光电二极管的输出数值在1000–1023之间（若环境黑暗）。左下方的提示会显示截至目前已完成的测量次数，例如： 完成 6 次测量中的 1 次 （每分钟测量一次）。
   3. 当实验完成后，检查外观变化 实验结束 位于应用程序页面的左下方。现在仪器已准备好进行叶片检测。
7. 按两次主屏幕按钮，滑动退出应用程序后重新打开。按下仪器上的电源按钮以重置设备。

3. 将叶片安装到叶夹中

注意：此步骤必须在黑暗环境中使用绿光光源进行（例如，在灯泡前放置绿色滤光片），以避免诱导叶绿体运动。或者，可使用极低强度的白光，并延长叶夹中的暗处理时间。请注意，叶夹的一个部分用于固定LED（较大的开口），另一部分用于固定光电晶体管（图1C）。

1. 如果植物已整体进行暗适应，则选取8片足够宽大、能够覆盖LED的叶片；否则，将叶片从培养皿中取出。准备8条长度与叶夹相仿的滤纸条，并在顶部打孔，以避免遮挡LED。
   1. 将滤纸条润湿后，放置在叶夹的LED固定部分上。对全部八个叶夹重复此步骤。
2. 将每片叶片放置在对应叶夹湿润滤纸的上方，确保叶片的正确面朝向LED（通常实验中以近轴面即上表面朝向LED）。
   1. 避免将叶片的主脉置于LED正上方；为获得更一致的结果，应将每片叶片的相似部位（例如叶片最宽处）对准LED。
   2. 将带有光电晶体管的另一部分叶夹盖上，并在必要时使用橡皮筋将两部分叶夹固定在一起（图1C、D）。
3. 将每个叶夹放入其对应的“小船”形托架中，并用移液器向储水槽中加水。确保叶片或至少滤纸条接触水面，以防止实验过程中叶片脱水（图1D）。

4. 运行实验

注意：进行标准的探索性实验时，首先进行4小时的黑暗处理（0 µmol 光子 m^-2 s^-1），随后进行7小时的低强度蓝光照射（2 µmol 光子 m^-2 s^-1），接着依次进行每种光强各60分钟的蓝光处理，光强分别为5、10、30、40、50、60、90、100 µmol 光子 m^-2 s^-1。该程序可诱导叶片表现出其暗态透射特性，促使叶绿体移动至最大聚集状态，并显示出不同程度的避光反应。

1. 按照以下步骤在 iPad 上设置 LeafSensor 应用程序。
   1. 在名为 Expt Name 的字段中输入 EXPLORA1。
   2. 在名为 # Light Intensities 的字段中输入 10。
   3. 在名为 Blue intensities 的字段中输入 0,1,60,160,550,750,950,1150,1350,1950。
   4. 在名为 Blue Duration 的字段中输入 240,420,60,60,60,60,60,60,60,60。
2. 点击 Start Experiment。一分钟后，屏幕将显示输出值（通常在 990 至 820 之间）。如果数值偏差较大，请检查叶片是否已正确插入叶夹中。
3. 当运行结束后，请确认屏幕左下角出现 Experiment Finished 消息。数据将自动保存。
   1. 将屏幕置于直立位置（非水平位置），屏幕上将出现两个新选项，分别为 Save 和 Utilities。
   2. 点击 Utilities，已保存的文件列表将显示出来。选择感兴趣的文件，本例中为 EXPLORA1。
   3. 在文件列表下方，查找 Selected Expt: EXPLORA1。点击 Email，输入 email address，数据文件将自动附加到邮件中。点击 Send。
      注意：如果文件发送后长时间未收到，请重启应用程序并重新发送文件。
4. 如果某次运行被中止，但此前的数据仍有价值，请在选择 Utilities 前先点击 Save。完成多次运行后，请清理内存空间：点击 Utilities，逐个选择文件，在文件旁向左滑动，然后点击 Delete 以删除文件。
5. 点击 Back 以运行另一个实验；若已完成操作，则按下主屏幕按钮，滑动至主屏幕，点击 Settings，点击 Display & Brightness，点击 Auto-Lock，然后选择 2 Minutes。

5. 数据分析

1. 从电子邮件中下载文件EXPLORA1，将文件扩展名添加为.csv，然后双击该文件。数据将被整理到一个电子表格中，八个不同传感器的数据分别排列在不同的列中。最后一列显示数据采集的时间（单位为秒）。如果标题（Sensor1-8）下方的第一行包含无意义的数据，请将其删除。
2. 建立一个主数据表，用于在单独的工作表中存储每个传感器的结果，并使用叶夹和传感器校准所得的方程将输出值转换为透射率（%）值（参见补充文件）。
   1. 将每组数据复制到一个独立的数据工作表中（例如，A列包含时间；C列包含Sensor1的数据）。
   2. 设置B列，将时间从秒转换为分钟。设置D列，使其包含使用校准方程将电压转换为透射率（%）的公式。
   3. 为每个传感器建立类似的数据表，并注意将电压输出转换为透射率（%）值的公式可能因传感器而异。
3. 绘制透射率（T，%）随时间（分钟）变化的曲线图（图2）。
4. 将数据表另存为新名称，以便主数据表可重复使用。
5. 为进一步分析数据（图2），可计算ΔT（%）积累量（例如，最大积累时的T值与暗适应状态下的T值之差）、ΔT（%）避光量（例如，最大避光时的T值与暗适应状态下的T值之差），或dT/dt（%/h）（例如，积累或避光反应最快阶段T的变化速率）。更多细节请参见⁸。

结果

透射装置的各个部件如图1所示。微控制器是该装置的控制单元，用于控制固定在黑色叶夹中的叶片所处的光照条件，并存储其接收到的光透射数据（图1A、B）。仪器控制单元的特写显示了电源开关、用于数据存储的SD卡、蓝牙模块（用于将数据发送至LeafSensor应用程序）以及连接发光二极管（LED）和光电晶体管的电缆。微控制器位于仪器底部，在图中仅可见其边缘部分（图1B）。通过3D打印制成的黑色叶夹用于固定叶片、LED和光电晶体管。在安装有LED的一侧叶夹上放置湿润的滤纸，确保LED不被遮挡，并将已暗适应的叶片使其近轴面（adaxial leaf surface）朝向LED放置。示意图显示LED与光电晶体管位于叶片的相对两侧。LED可发射蓝光或红光。蓝光用于诱导叶绿体运动，在每分钟内会短暂关闭一次，期间红光作为测量光照射到叶片上。位于叶片另一侧的光电晶体管检测透过叶片的红光量，并将数据传送给微控制器和SD卡（

讨论

该设备使用极为简便，但由于每个叶片夹中的LED和光电晶体管的位置可能略有差异，因此必须对透射装置的每个叶片夹组件进行独立校准，这一点至关重要。确保LED和光电晶体管稳固插入，若数据出现异常，需重新检查校准情况。避免让设备接触水分。叶片夹中的叶片应置于盛水的“小船”中，以避免水分胁迫。可将这些“小船”放置于低边沿的塑料容器中，远离控制单元，并且切勿将其碰倒。切勿拔出或弯折电缆连接处。将叶片插入叶片夹时需小心操作，避免过度拉扯或弯折电缆。

必须使叶片在黑暗中充分适应，以确保初始透射值能够代表暗状态下的数值。在用蓝光照射叶片前，应检查仪器中暗期阶段的数值是否已在至少30分钟内保持稳定。若未达到稳定，应在下一次运行前延长叶片的暗适应时间，或延长透射装置中的暗期，以监测叶片达到稳态所需的时间。通常，透射数据以在特定蓝光强度下相对于暗态值的透射率变化百分比（ΔT）表示。因此，获得准确的基线值至关重要。

探索性实验可用于任何 A. thaliana 突变体（包括已知影响植物其他生理过程的突变体，例如光合作用、肌球蛋白相关突...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铝箔
暗适应叶片
滤纸
安装有 LeafSensor 应用程序的 iPad（参见补充信息）
移液器	任意
培养皿	任意
传输设备（参见补充信息）
水