从土壤样品中分离与筛选昆虫病原真菌及其对害虫的致病力评估

摘要

本文介绍了一种基于 黄粉虫（Tenebrio molitor）诱饵系统从土壤样品中分离和筛选昆虫病原真菌（EPF）的实验方案。通过有效分生孢子数（ECN）公式，结合生理特性筛选出具有高抗逆性的EPF，用于田间害虫的微生物防治。

摘要

昆虫病原真菌（EPF）是用于综合害虫管理的微生物防治剂之一。为了防控本地或入侵性害虫，分离和筛选本土来源的EPF至关重要。因此，本研究采用了一些改进的土壤诱饵法结合昆虫诱饵（黄粉虫，Tenebrio molitor）系统。分离得到的EPF随后进行了对农业害虫斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的毒力测定。此外，对具有潜力的EPF菌株进行了形态学和分子生物学鉴定。同时，对有前景的EPF菌株开展了分生孢子产量和耐热性测定，并进行比较；这些数据进一步代入有效分生孢子数（ECN）公式中进行实验室等级排序。通过更换昆虫种类并整合更多胁迫因子，可进一步优化土壤诱饵-黄粉虫系统及ECN公式，以评估其商业化和田间应用潜力。本实验方案为EPF的筛选提供了一种快速高效的方法，将有助于推动生物防治剂的研究进展。

引言

目前，昆虫病原真菌（EPF）已广泛应用于农林及园艺害虫的微生物防治。EPF具有宿主范围广、环境适应性强、生态友好等优点，并可与其他化学药剂联合使用，产生协同效应，助力有害生物综合治理^1,2。作为害虫防治制剂的应用，有必要从感病昆虫或自然环境中分离获得大量EPF。

从宿主中采集这些生物有助于了解虫生真菌（EPF）在自然宿主中的地理分布和流行率^3,4,5。然而，感染真菌的昆虫采集通常受限于野外的环境因素和昆虫种群数量⁴。考虑到昆虫宿主在感染虫生真菌后会死亡并落入土壤，因此从土壤样品中分离虫生真菌可能是一种稳定的资源^3,6。例如，已知腐生真菌可利用死亡的宿主作为其生长的营养来源。土壤诱饵法和选择性培养基系统已被广泛用于从土壤中检测和分离虫生真菌^3,4,

方案

注意：整个流程图见图1。

1. 潜在昆虫病原真菌（EPF）的分离与筛选

1. 采集土壤样品
   1. 去除表层1 cm的土壤，然后使用铁铲从每个采样点采集5–10 cm深度的土壤。
      注意：采样地点应选择山区、森林或人口稀少的区域，以避免人工喷洒的虫生真菌（EPF）菌株污染。确保土壤采样区域地表覆盖有杂草。干燥或过湿的土壤均不适用于本实验。
   2. 记录每个采样点的详细信息，包括 GPS、海拔、田地类型、年均温度、年降水量、采集时间（季节）、土壤类型和 pH 值。
   3. 将100 g土壤样品收集到塑料袋中，若需在3小时内于实验室进行真菌分离实验，则在室温下保存。
      注意：如果样品在3小时内无法使用，请将土壤在室温下避光保存。若实验不能立即进行，土壤样品可保存于 4 °C 持续1周，直至方案开始^18,19.
2. 用面包虫诱捕并分离内生真菌Tenebrio molitor)
   1. 将100 g土壤样品放入塑料杯中（杯口直径 = 8.5 cm，高 = 12.5 cm），然后在室温避光条件下，将5只黄粉虫置于土壤表面，培养2周。
      注意：也....

结果

分离与 选择潜在的昆虫病原真菌（EPF）
通过使用 Tenebrio molitor介导的昆虫病原真菌（EPF）文库构建方法可排除无杀虫活性的真菌数量，从而显著提高EPF的分离效率与筛选效果。在该方法应用过程中，记录了采样地点、土壤样品及真菌萌发率等信息。表 2）。根据我们之前的数据，从172份土壤样本中共分离得到101株真菌，表明分离效率较高，达64%。在101株真菌分离物中，有26株对昆虫表现出杀虫活性 T. molitor （100% 死亡率）在第 1 天后^st 致病性筛选，因此淘汰的真菌分离株为26/101 = 25.7%。在2^nd 毒力测试，26株真菌分离物对 T. molitor 进一步证明，其中12种对 T. molitor 幼虫（接种后5天死亡率为100%）图 2A）。这些用于评估对农业害虫的毒力试验。根据.......

讨论

昆虫病原真菌（EPF）已被用于昆虫防治。目前已有多种方法用于分离、筛选和鉴定EPF^30,31,32。在比较不同类型的昆虫诱饵方法时，Beauveria bassiana 和 Metarhizium anisopliae 常在昆虫诱饵中被发现^6,12,13,14。在这些昆虫诱饵中，Galleria mellonella 和 Tenebrio molitor 对 Beauveria 和 Metarhizium 属真菌的回收率较高。事实上，利用黄粉虫（T. molitor）作为诱饵.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌学级琼脂	BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.	AGR001	适用于大多数细胞培养/分子生物学应用。
琼脂糖，生物技术级	BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.	AGA001	用于DNA电泳。
BioGreen Safe DNA凝胶缓冲液	BIOMAN	SDB001T
黄铜打孔器	Dogger	D89A-44001
Canon kiss x2	Canon	EOS 450D	用于记录菌株菌落形态
恒温培养箱	Yihder Co., Ltd.	LE-509RD	真菌保藏。
cubee迷你离心机	GeneReach	MC-CUBEE
DigiGel 10数字凝胶成像系统	TOPBIO	DGIS-12S
Finnpipette F2 0.2至2 µL移液器	Thermo Scientific	4642010
Finnpipette F2 1至10 µL移液器	Thermo Scientific	4642030
Finnpipette F2 10至100 µL移液器	Thermo Scientific	4642070
Finnpipette F2 100至1000 µL移液器	Thermo Scientific	4642090
Finnpipette F2 2至20 µL移液器	Thermo Scientific	4642060
Finnpipette F2 20至200 µL移液器	Thermo Scientific	4642080
GeneAmp PCR System 9700	Applied Biosystems	4342718
GenepHlow凝胶/PCR纯化试剂盒	Geneaid	DFH100
Genius干浴恒温孵育器	Major Science	MD-01N
定制A型量筒 100 mL	SIBATA	SABP-1195906	用于测量试剂体积。
手持计数器	SDI	NO.1055
血细胞计数板	bioman	AP-0650010	用于计算孢子数量
接种环	Dogger	D8GA-23000
盖子	IDEAHOUSE	RS92004
显微盖玻片	MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD	24241
显微成像系统	SAGE VISION CO.,LTD	SGHD-3.6C
显微镜载玻片	DOGGER	DG75001-07105
Mupid-2plus DNA凝胶电泳仪	ADVANCE	AD110
尼康光学显微镜	SAGE VISION CO.,LTD	Eclipse CI-L
塑料杯	IDEAHOUSE	CS60016
Presto Mini gDNA酵母基因组DNA提取试剂盒	Geneaid	GYBY300	真菌基因组DNA提取试剂盒
沙氏葡萄糖肉汤（沙氏液体培养基）	HiMedia Leading BioSciences Company	M033	用于酵母、霉菌及耐酸微生物的培养。
23号手术刀片	Swann-Morton	310
4号手术刀柄	AGARWAL SURGICALS	SSS -FOR-01-91
铲子	Save & Safe	A -1580242 -00
Silwet L-77	bioman(phytotech)	S7777	表面活性剂
Sorvall Legend Micro 17微量离心机	Thermo Scientific	75002403
不锈钢镊子	SIPEL ELECTRONIC SA	GG-SA
无菌培养皿	BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.	1621	带盖的浅圆柱形容器，专用于微生物学或细胞培养。
ThermoCell MixingBlock	BIOER	MB-101
Tween 80	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	164-21775
TwinGuard超低温冰箱	Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.	MDF-DU302VX	用于-80°C样品储存。
立式落地型操作柜	Chih Chin	BSC-3	用于真菌操作与培养。
Vortex Genie II涡旋振荡器	Scientific	SIG560
拉链式储存袋	Save & Safe	A -1248915 -00
100 bp DNA Ladder	Geneaid	DL007
-20°C冰箱	FRIGIDAIRE	Frigidaire FFFU21M1QW	用于-20°C样品及实验试剂储存。
2X SuperRed PCR预混液	TOOLS	TE-SR01
50X TAE缓冲液	BIOMAN	TAE501000