方法文章

从土壤样品中分离与筛选昆虫病原真菌及其对害虫的致病力评估

DOI：

10.3791/62882

⸱

2021年9月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, National Chung Hsing University, 2Department of Agricultural biology, Jeonbuk National University, 3Department of Agricultural Convergence Technology, Jeonbuk National University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种基于 黄粉虫（Tenebrio molitor）诱饵系统从土壤样品中分离和筛选昆虫病原真菌（EPF）的实验方案。通过有效分生孢子数（ECN）公式，结合生理特性筛选出具有高抗逆性的EPF，用于田间害虫的微生物防治。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

昆虫病原真菌（EPF）是用于综合害虫管理的微生物防治剂之一。为了防控本地或入侵性害虫，分离和筛选本土来源的EPF至关重要。因此，本研究采用了一些改进的土壤诱饵法结合昆虫诱饵（黄粉虫，Tenebrio molitor）系统。分离得到的EPF随后进行了对农业害虫斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的毒力测定。此外，对具有潜力的EPF菌株进行了形态学和分子生物学鉴定。同时，对有前景的EPF菌株开展了分生孢子产量和耐热性测定，并进行比较；这些数据进一步代入有效分生孢子数（ECN）公式中进行实验室等级排序。通过更换昆虫种类并整合更多胁迫因子，可进一步优化土壤诱饵-黄粉虫系统及ECN公式，以评估其商业化和田间应用潜力。本实验方案为EPF的筛选提供了一种快速高效的方法，将有助于推动生物防治剂的研究进展。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前，昆虫病原真菌（EPF）已广泛应用于农林及园艺害虫的微生物防治。EPF具有宿主范围广、环境适应性强、生态友好等优点，并可与其他化学药剂联合使用，产生协同效应，助力有害生物综合治理1,2。作为害虫防治制剂的应用，有必要从感病昆虫或自然环境中分离获得大量EPF。

从宿主中采集这些生物有助于了解虫生真菌（EPF）在自然宿主中的地理分布和流行率3,4,5。然而，感染真菌的昆虫采集通常受限于野外的环境因素和昆虫种群数量4。考虑到昆虫宿主在感染虫生真菌后会死亡并落入土壤，因此从土壤样品中分离虫生真菌可能是一种稳定的资源3,6。例如，已知腐生真菌可利用死亡的宿主作为其生长的营养来源。土壤诱饵法和选择性培养基系统已被广泛用于从土壤中检测和分离虫生真菌3,4,7,8,9,10。

在选择性培养基方法中，将稀释的土壤溶液接种到含有广谱抗生素（如氯霉素、四环素或链霉素）的培养基上，以抑制细菌的生长2,3,9,11。然而，已有报道指出，该方法可能会扭曲菌株的多样性和密度，并导致对许多微生物群落的过高或过低估计6。此外，在分离过程中，所获得的菌株致病性较弱，并且会与腐生菌发生竞争。从稀释的土壤溶液中分离胞外致病真菌（EPF）较为困难3。相比之下，土壤诱饵法通过从被感染的死亡昆虫中分离EPF，可将诱饵样本保存2-3周，从而提供一种更为高效且标准化的EPF分离方法3,4,7,6。由于该方法操作简便，可在低成本条件下分离出多种致病菌株4，因此被众多研究人员广泛采用。

在比较不同类型的昆虫诱饵系统后发现，Beauveria bassiana 和 Metarhizium anisopliae 是在半翅目、鳞翅目、小蠊属和鞘翅目昆虫中发现的最常见虫生真菌（EPF）种类6,12,13,14。在这些昆虫诱饵中，与其它昆虫相比，大蜡螟（Galleria mellonella，鳞翅目）和黄粉虫（Tenebrio molitor，鞘翅目） 对 Beauveria 和 Metarhizium 属真菌的回收率更高。因此，G. mellonella 和 T. molitor 常被用于昆虫诱捕法。多年来，美国农业部（USDA）已建立了一个虫生真菌菌种库（农业研究服务局虫生真菌培养物收藏，ARSEF），其中包含多种真菌种类，包括 4081 株 Beauveria 属、18 株 Clonostachys 属、878 株 Cordyceps 属、2473 株 Metarhizium 属、226 株 Purpureocillium 属以及 13 株 Pochonia 属等15。另一个虫生真菌菌种库由美国佛蒙特大学的昆虫学研究实验室（ERL）历时约 30 年建立，包含来自美国、欧洲、亚洲、非洲和中东地区的 1345 株虫生真菌菌株16。

为了控制中国台湾地区的本地或入侵性害虫，需要分离和筛选本土的昆虫病原真菌（EPF）。因此，在本实验方案中，我们改进并描述了土壤诱捕法的操作流程，并将其与昆虫诱捕（黄粉虫，Tenebrio molitor）系统相结合17。基于该方案，建立了EPF菌株库。对初步获得的EPF分离株进行了两轮筛选（接种量定量），筛选出对昆虫具有致病性的EPF分离株。对有潜力的菌株进一步进行形态学和分子生物学鉴定，并通过耐热性及分生孢子产量测定进行深入分析。此外，本文还提出了有效分生孢子数（ECN）的概念。利用ECN公式和主成分分析（PCA），在模拟环境压力条件下对潜在菌株进行分析，从而完成EPF菌株库的构建与筛选流程。随后，对有前景的EPF菌株针对目标害虫（例如，Spodoptera litura）进行了致病性验证。本方案将耐热性和分生孢子产量数据整合至ECN公式与PCA分析中，可作为EPF相关研究的标准化排序体系。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：整个流程图如图1所示。

1. 潜在昆虫病原真菌（EPF）的分离与筛选

  1. 采集土壤样品
    1. 去除表层1 cm的土壤，然后使用铲子从每个采样点采集5-10 cm深度的土壤。
      注意：采样地点应选择山区、森林或人口稀少的区域，以避免人为喷洒的昆虫病原真菌（EPF）菌株污染。确保土壤采样区域地表覆盖有杂草。干燥或过湿的土壤均不适用于本实验。
    2. 记录每个采样点的详细信息，包括GPS坐标、海拔、田地类型、年均温度、年降水量、采集时间（季节）、土壤类型和pH值。
    3. 将100 g土壤样品收集到塑料袋中，若需在3小时内于实验室进行真菌分离实验，则在室温下保存。
      注意：如果样品无法在3小时内使用，请将土壤在室温下避光保存。若实验不能立即进行，土壤样品可在4 °C条件下保存1周，直至开始实验方案。18,19.
  2. 用面包虫诱捕并分离EPFTenebrio molitor)
    1. 将100 g土壤样品放入塑料杯中（杯口直径 = 8.5 cm，高 = 12.5 cm），然后在室温避光条件下，将5只黄粉虫置于土壤表面，培养2周。
      注意：也可使用其他类型的塑料杯容器。如果土壤过于干燥（出现裂缝或呈沙状），可喷洒灭菌的 ddH₂O2O（约5-10 mL）于土壤中。体长约为2.5 cm（14th 龄期）的 T. molitor 幼虫有助于真菌分离物筛选20.
    2. 每日观察并记录幼虫的死亡率和真菌感染情况；将死亡幼虫保留在杯中直至2周，以进行真菌分离。
      注意：在上述过程中，土壤样品中的真菌分生孢子会附着于黄粉虫幼虫体表。随着菌丝从节间膜处生长而出，可观察到真菌感染引起的真菌病症状，随后整个虫体将被菌丝体覆盖。接种7天后开始产孢，真菌感染部位的颜色将逐渐转变为分生孢子团的颜色。
    3. 将死亡的昆虫转移至洁净工作台，使用无菌牙签收集分生孢子。在实验室中将其划线接种于四分之一强度沙氏葡萄糖琼脂培养基（¼ SDA）平板（55 mm）上。21在25 °C下将培养皿培养7天，以获得真菌的初级培养物。
      注意：¼ SDA 平板的制备方法如下：将 1.5 g 沙氏葡萄糖肉汤和 3 g 琼脂溶于 200 mL H₂O 中2O，然后灭菌20分钟。在培养基凝固前，将¼ SDA分装至每个55 mm的培养皿中。凝固后的¼ SDA平板储存于4 °C，待用。
    4. 在超净工作台中，将每种原始培养的真菌重新划线接种至一个55 mm的¼ SDA平板，于25 °C培养7天，以获得真菌的单菌落。
    5. 重复此重分离步骤约2-3次，并在光学显微镜下观察，以获得单一且形态纯一的真菌菌落。
      注意：使用以下方法分离所有EPF T. molitor-诱饵并按照下节所述进行储存。分离、保存、纯培养及划线操作必须在后续各节中的超净工作台内进行。
  3. 保存EPF分离株
    1. 用打孔器从每个分离的纯真菌培养平板边缘切下3块5 mm的琼脂块，放入1.5 mL微量离心管中作为一次重复。
      注意：建议每种真菌分离物在EPF菌株保存后进行三次重复实验nd 毒力试验。如果储存空间有限，也建议进行分子鉴定。
    2. 加入 250 µL 0.03% 表面活性剂溶液（材料表使用微量移液器将250 µL 60%甘油加入1.5 mL微量离心管中，然后涡旋振荡10秒。
    3. 用石蜡膜密封1.5 mL微量离心管，并在-20 °C冰箱中预冷24 h。随后将预冷的菌种转移至-80 °C冰箱中进行冷冻保存。
      注意：第1.4节中使用了额外的纯真菌培养平板（除冷冻保存样品外）。
  4. 1st 真菌分离株致病性筛选
    1. 放置五个 T. molitor 将幼虫直接置于各纯真菌培养皿表面，在25 °C条件下培养。
    2. 观察并记录10天内的真菌感染情况和死亡率。选取真菌分离株进行进一步分析。
      注意：选择导致100%死亡率的真菌分离物用于后续实验nd 毒力测试以确认其对宿主的致病性 T. molitor 幼虫。或者，研究人员可根据自身研究需要调整标准。
  5. 2nd 真菌分离株的毒力测定
    注意：根据第1条st 致病性筛选，从 -80 °C 中复苏所选的真菌分离株用于后续实验nd 毒力测试。该2nd 毒力测试旨在量化所选真菌分离株接种后的致病性st 筛选轮次
    1. 通过涡旋振荡1分钟收集每种真菌分离株的分生孢子，并使用血细胞计数板对分生孢子数量进行计数。
    2. 将分生孢子悬液调整至浓度为 1 x 107 分生孢子/mL，置于0.03%表面活性剂溶液中（材料表).
    3. 将10 µL真菌悬液涂布于55 mm的¼SDA平板上，于25 °C避光培养7天。
    4. 放置五个 T. molitor 幼虫直接置于每个纯真菌培养皿表面（约 6 x 107 分生孢子）。用石蜡膜密封培养皿，于25 °C避光培养。
    5. 观察并记录10天内的真菌感染情况和死亡率。
    6. 对每种真菌分离物重复进行三次测试（从步骤1.51到1.55）。
      注意：选择导致100%死亡率的真菌分离物用于后续实验rd 毒力测试以确认其对靶标害虫的致病性。
  6. 3rd 靶标害虫真菌分离物的毒力测定斜纹夜蛾 （例如）
    1. 重复步骤 1.5.2 至 1.5.6，使用来自 2 的选定分离株nd 毒力，用于测试对靶标害虫的毒力。
    2. 计算 LT50 每种真菌分离株22.
      注意：LT50 使用 R studio（版本 3.4.1）通过广义线性模型（GLMs）计算每种真菌分离物的值；可采用准二项式误差分布和对数链接函数来校正过度离散。

2. EPF的分子鉴定

  1. 真菌基因组DNA提取
    1. 收集约 1 cm2 7天1/4 SDA平板上的EPF
    2. 提取真菌基因组DNA 使用真菌 根据制造商说明使用基因组DNA提取试剂盒23 (材料表).
  2. PCR扩增与DNA测序
    1. 通过PCR扩增DNA样本中的真菌ITS区域21 使用 PCR Master Mix (2x) 和 ITS1F/ITS4R 引物组24 (表1) 采用以下PCR程序：94 °C 预变性1 min，随后进行35个循环：94 °C 变性30 s、55 °C 退火30 s、72 °C 延伸1 min，最后72 °C 终延伸7 min。
      注意：ITS1F/ITS4R 引物组用于属水平的鉴定。
    2. 通过商业测序服务对PCR产物进行测序。
    3. 使用 NCBI BLAST 在 NCBI 数据库中搜索相似的真菌，并选择相关的真菌模式种用于系统发育分析。
      注意：属于该属的真菌物种 绿僵菌 或 球孢白僵菌 应使用tef-983F/tef-2218R引物组进一步鉴定至种水平25 （重复步骤 2.1.1 至 2.2.3）。对于不属于以下属的真菌 绿僵菌 或 球孢白僵菌， 其他分子标记也可用于鉴定该物种，包括 DNA 裂解酶 (APN2), β微管蛋白 (BTUB), RNA聚合酶II最大亚基 (RPB1), RNA聚合酶II第二大亚基 (RPB2），以及 翻译延伸因子1α的3'端部分 (TEF)25,26.
  3. 系统发育分析
    1. 使用 ClustalX 2.1 软件27 使用 GeneDoc 手动修剪步骤 2.2.2 和 2.2.3 中获得的多序列比对中的保守序列区域28.
    2. 使用 MEGA7 软件进行系统发育分析29 基于最小进化法（ME）、邻接法（NJ）和最大似然法（ML）
      注意：同时执行这三种方法有助于确认并准确判断分类状态。通过1st 致病性筛选用于属水平的分子鉴定。通过2进行筛选的真菌分离株nd 毒力试验用于物种水平的分子和形态学鉴定。

3. 染色体外小体（EPF）的形态学鉴定

  1. 真菌菌落形态的观察
    1. 使用相机连续7天拍摄真菌培养物的菌落生长情况，记录菌落的生长状况、形态（如绒毛状、坚实）及颜色。
  2. 观察分生孢子和分生孢子梗
    1. 用接种环从纯培养的真菌菌落上刮取分生孢子，并将孢子转移至含有0.1%吐温80溶液的载玻片上。随后加盖盖玻片，用于光学显微镜下观察分生孢子。
    2. 使用手术刀切割一段5 mm2 将真菌菌落边缘的菌丝带所在的琼脂块转移到载玻片上。
    3. 按如下步骤进行清洗：用塑料滴管将0.1% Tween 80溶液滴加到琼脂块上，用镊子洗去大部分多余的分生孢子，然后盖上盖玻片，用于光学显微镜观察。
      注意：0.1% 吐温 80 可替换为另一种更强效的表面活性剂（材料表）取决于真菌种类及其疏水性。
    4. 测量并记录分生孢子和分生孢子梗的宽度与长度，以比较不同真菌分离株之间的差异。
    5. 使用 R Studio（版本 3.4.1）对各菌株的分生孢子宽度和长度进行 Welch's ANOVA 检验，并采用 Games-Howell 检验（事后检验）进行分析。
      注意：形态特征的数据分析可根据具体情况调整。使用3筛选出的真菌分离株rd 毒力试验用于第4和第5节中的生理学表征及ECN排序。

4. 分生孢子产率与耐热性的研究

  1. 分生孢子产生测定实验
    1. 将选定的真菌分离株在¼ SDA培养基上于25 ± 1 °C避光条件下培养10天。
    2. 用0.03%表面活性剂溶液制备1 mL该真菌分离株的分生孢子悬浮液，并按上述方法调整至1 × 107 个分生孢子/mL。
    3. 在¼ SDA培养基上滴加三滴，每滴10 µL分生孢子悬浮液，避光于25 °C培养7、10和14天，以计数真菌的产孢情况。
      注：10 µL为最佳滴加体积，可在真菌生长7–14天后获得产孢均匀的5 mm菌块。
    4. 在各时间点使用打孔器从菌落中心切取5 mm琼脂块，转移至含有1 mL 0.03%表面活性剂溶液（材料表）的1.5 mL微量离心管中。
    5. 在室温下以3,000 rpm涡旋振荡15分钟，使用血细胞计数板计数分生孢子数量。
      注：计数公式为每25个最小方格（方格面积 = 0.025 mm2；计数室深度 = 0.1 mm）内的分生孢子数：
      5个方格内分生孢子总数 ÷ 80 × (4 × 106)
    6. 每种分离株重复三次。
  2. 耐热性测定实验
    1. 将选定的真菌分离株在¼ SDA培养基上于25 ± 1 °C避光条件下培养10天。
    2. 用0.03%表面活性剂溶液制备1 mL该真菌分离株的分生孢子悬浮液，并按上述方法调整至1 × 107 个分生孢子/mL。
    3. 涡旋混匀分生孢子悬浮液后，置于45 °C干浴中加热0、30、60、90和120分钟。每次热处理后，在55 mm的¼ SDA培养基上滴加三滴，每滴5 µL分生孢子悬浮液，于25 ± 1 °C培养18小时。
      注：避免摊开真菌液滴，以便更清晰地聚焦观察区域。
    4. 在200倍光学显微镜下随机选取五个视野，计数萌发的分生孢子数量，以确定萌发率。
    5. 每种分离株进行三次重复实验。

5. 有效分生孢子数（ECN）排序

  1. ECN 计算
    注意：在计算总 ECN 值之前，需先获得每种潜在真菌菌株的分生孢子产量和耐热性数据21。
    1. 计算每个时间点分生孢子产量的倍数变化（FC）：
      荧光相关光谱方程，FC_x = n_cp/I。
      其中，x = 数据采集时间点；ncp = 每天培养后产生的分生孢子数量；I = 接种的初始分生孢子数量。
    2. 使用以下公式计算每个时间点胁迫处理下的分生孢子数量：
      ECN 计算方程，显示变量 I、FC_x、TT_0、胁迫系数(TT_Z)。
      其中，y = 处理条件下该时间点的 ECN 值；TT0 = 未经热胁迫的分生孢子萌发率（= 0 分钟热处理的萌发率）；TTz = 胁迫系数，即不同热处理时间（z）下的分生孢子萌发率。
    3. 使用以下公式计算总 ECN 值：
      ECNsum 计算方程；静态平衡、胁迫系数、公式表示。
    4. 比较各真菌菌株的 ECN 值。
  2. 真菌菌株的主成分分析（PCA）
    注意：PCA 分析可验证 ECN 的排序结果，并有助于理解各生理特征值之间的相关性。比较 ECN 值，筛选出 ECN 值较高的昆虫病原真菌（EPF）分离株。
  3. 使用 R 软件通过编码进行 PCA 分析：
    #输入 PCA 数据文件
    ​a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)
    1. #处理样本数据
      row.names(a) <- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113")
      X=row.names(a)
      df<- a[2:11]
    2. #PCA 计算
      pca <- prcomp(df, center = TRUE, scale = TRUE)
      vars <- (pca$sdev)^2
      pc1_percent = vars[1] / sum(vars)
      pc2_percent = vars[2] / sum(vars)
      value = pca$x
    3. #输出 PCA 可视化文件
      png(file = 'pca.png', height = 2000, width = 2000, res = 300)
      注意：使用 7 至 14 天的分生孢子产量数据以及全部耐热性数据进行主成分分析（PCA），以确认 ECN 排序结果。
  4. 根据 ECN 或 PCA 结果选择表现最优的真菌菌株，并对目标害虫开展毒力测试，用于后续研究。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分离与 筛选潜在的昆虫病原真菌（EPF）
通过使用 Tenebrio molitor介导的昆虫病原真菌（EPF）文库构建方法可排除无杀虫活性的真菌数量，从而显著提高EPF的分离效率与筛选效果。在该方法应用过程中，记录了采样地点、土壤样品及真菌萌发率等信息。表2）。根据我们之前的数据，从172份土壤样本中总共获得101株真菌分离物，表明分离效率较高，达64%。在101株真菌分离物中，有26株对昆虫表现出杀虫活性 T. molitor （100% 死亡率）在第1天后st 致病性筛选导致真菌分离株被淘汰的数量为26/101 = 25.7%。在后续的2nd 毒力测试，26株真菌分离物对宿主的高毒力 T. molitor 进一步证明，其中12种对 T. molitor 幼虫（接种后5天100%死亡率）图2A）。这些用于评估对农业害虫...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

昆虫病原真菌（EPF）已被用于昆虫防治。目前已有多种方法用于分离、筛选和鉴定EPF30,31,32。在比较不同类型的昆虫诱饵方法时，Beauveria bassiana 和 Metarhizium anisopliae 常在昆虫诱饵中被发现6,12,13,14。在这些昆虫诱饵中，Galleria mellonella 和 Tenebrio molitor 对 Beauveria 和 Metarhizium 属真菌的回收率较高。事实上，利用黄粉虫（T. molitor）作为诱饵...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明本工作中不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由台湾科技事务主管部门（MOST）资助，项目编号为109-2313-B-005 -048 -MY3。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细菌学级琼脂BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGR001适用于大多数细胞培养/分子生物学应用。
琼脂糖，生物技术级BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.AGA001用于DNA电泳。
BioGreen Safe DNA凝胶缓冲液BIOMANSDB001T
黄铜打孔器DoggerD89A-44001
Canon kiss x2CanonEOS 450D用于记录菌株菌落形态
恒温培养箱Yihder Co., Ltd.LE-509RD真菌保藏。
cubee迷你离心机GeneReachMC-CUBEE
DigiGel 10数字凝胶成像系统TOPBIODGIS-12S
Finnpipette F2 0.2至2 µL移液器Thermo Scientific4642010
Finnpipette F2 1至10 µL移液器Thermo Scientific4642030
Finnpipette F2 10至100 µL移液器Thermo Scientific4642070
Finnpipette F2 100至1000 µL移液器Thermo Scientific4642090
Finnpipette F2 2至20 µL移液器Thermo Scientific4642060
Finnpipette F2 20至200 µL移液器Thermo Scientific4642080
GeneAmp PCR System 9700Applied Biosystems4342718
GenepHlow凝胶/PCR纯化试剂盒GeneaidDFH100
Genius干浴恒温孵育器Major ScienceMD-01N
定制A型量筒 100 mLSIBATASABP-1195906用于测量试剂体积。
手持计数器SDINO.1055
血细胞计数板biomanAP-0650010用于计算孢子数量
接种环DoggerD8GA-23000
盖子IDEAHOUSERS92004
显微盖玻片MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD24241
显微成像系统SAGE VISION CO.,LTDSGHD-3.6C
显微镜载玻片DOGGERDG75001-07105
Mupid-2plus DNA凝胶电泳仪ADVANCEAD110
尼康光学显微镜SAGE VISION CO.,LTDEclipse CI-L
塑料杯IDEAHOUSECS60016
Presto Mini gDNA酵母基因组DNA提取试剂盒GeneaidGYBY300真菌基因组DNA提取试剂盒
沙氏葡萄糖肉汤（沙氏液体培养基）HiMedia Leading BioSciences CompanyM033用于酵母、霉菌及耐酸微生物的培养。
23号手术刀片Swann-Morton310
4号手术刀柄AGARWAL SURGICALSSSS -FOR-01-91
铲子Save & SafeA -1580242 -00
Silwet L-77bioman(phytotech)S7777表面活性剂
Sorvall Legend Micro 17微量离心机Thermo Scientific75002403
不锈钢镊子SIPEL ELECTRONIC SAGG-SA
无菌培养皿BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.1621带盖的浅圆柱形容器，专用于微生物学或细胞培养。
ThermoCell MixingBlockBIOERMB-101
Tween 80FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation164-21775
TwinGuard超低温冰箱Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.MDF-DU302VX用于-80°C样品储存。
立式落地型操作柜Chih ChinBSC-3用于真菌操作与培养。
Vortex Genie II涡旋振荡器ScientificSIG560
拉链式储存袋Save & SafeA -1248915 -00
100 bp DNA LadderGeneaidDL007
-20°C冰箱FRIGIDAIREFrigidaire FFFU21M1QW用于-20°C样品及实验试剂储存。
2X SuperRed PCR预混液TOOLSTE-SR01
50X TAE缓冲液BIOMANTAE501000

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
  2. Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
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