本方案介绍了高通量测量HaCaT角质形成细胞迁移能力的方法，包括细胞核图像的采集与处理，以及利用ImageJ插件TrackMate进行颗粒追踪的技术。
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本文内容
摘要
摘要
集体细胞迁移在包括发育、伤口愈合和癌症转移在内的许多基本生物学过程中发挥着关键作用。为了理解细胞运动性的调控机制，我们必须能够在不同条件下对其运动性进行简便且一致的测量。本文描述了一种利用细胞核染色标记来测量和量化HaCaT角质形成细胞单细胞及群体运动性的方法。该方法包含一个MATLAB脚本，用于分析TrackMate输出文件，以计算单个细胞以及整个成像区域中细胞的位移、运动速率和轨迹角度。该运动性分析脚本可对来自TrackMate数据的细胞运动速率进行快速、直接且可扩展的分析，可用于广泛识别和研究上皮细胞中运动性的调控机制。我们还提供了一个MATLAB脚本，用于重组显微镜采集的显微视频，并将其转换为TIF图像堆栈，以便使用ImageJ的TrackMate插件进行批量分析。通过应用该方法探究黏附连接和肌动蛋白细胞骨架动态在调控HaCaT角质形成细胞运动性中的作用，我们证明了Arp2/3活性是HaCaT角质形成细胞中α-连环蛋白缺失后运动性升高的必要条件。
引言
上皮细胞中细胞运动性的精确且响应性的调控对于伤口愈合以及上皮层的更新至关重要。运动性维持失败可能导致胚胎发育和伤口愈合出现问题1，而运动性信号过度激活则是癌症转移的关键因素之一2。
了解HaCaT角质形成细胞对运动性的细胞调控可为这些过程提供重要见解。本文所述方案可在单细胞或群体水平上对细胞运动性的平均幅度进行一致的测量和计算。我们已采用该方法，在对HaCaT角质形成细胞进行基因扰动或小分子抑制剂处理后，测量其运动性，以理解调控运动速率的细胞信号通路。所提供的MATLAB脚本可测量每个细胞的平均速度和平均运动方向。
集体细胞运动在发育过程和癌症转移中的上皮-间质转化均起着关键作用3。细胞通过黏附、极化、突出和回缩的协调作用实现运动能力4。这些过程高度依赖于动态肌动蛋白细胞骨架的协调调控。PI3K或多种受体酪氨酸激酶下游的Rac1 GTP酶激活可使细胞极化，从而引发肌动蛋白聚合5。肌动蛋白细胞骨架的动态变化受该通路及其他Rho介导的GTP酶调控，后者由多种生长因子的下游信号激活。这些Rho介导的GTP酶进一步激活Arp2/3复合物，促进肌动蛋白分支形成....
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方案
1. 细胞培养与成像板制备
- 在加湿培养箱中，于37 °C和5%二氧化碳条件下，使用细胞培养基（DMEM高糖培养基，添加2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素/链霉素和10% (v/v) 胎牛血清）培养HaCaT细胞。
- 在96孔成像板（如96孔黑色聚苯乙烯微孔板）中，每孔接种所需数量的细胞（我们通常接种5000–20,000个细胞/孔）。向其中三个孔仅加入培养基（不接种细胞）。
- 将培养板置于完全水平的表面上静置20–30分钟，使细胞均匀贴附于培养板底部。
- 将培养板转移至加湿细胞培养箱（37 °C，5%二氧化碳）中孵育4–6小时，使细胞完全贴壁。
- 移除培养基，每孔更换为含有2 µg/mL Hoechst染料（将1 mg/mL储存液按1:5000稀释）的细胞培养基。
- 将培养板放回加湿细胞培养箱（37 °C，5%二氧化碳）中孵育2小时。
- 每孔用100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤三次，然后每孔加入90 µL成像培养基（不含酚红的DMEM高糖培养基，添加2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素/链霉素和10% (v/v) 胎牛血清）。
- 若需检测小分子抑制剂或其他效应分子的作用，应在成像前立即对细胞进行处理。
2. 成像....
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结果
为了确保我们的分析脚本具有可靠性和一致性，我们在三个独立的实验中测量了HaCaT角质形成细胞的运动能力。我们发现，尽管不同实验之间细胞运动能力的标准差存在差异（可能由于HaCaT细胞对融合度和机械刺激较为敏感），但平均运动能力在多个实验中均保持一致，且根据双尾学生t检验，各重复实验之间的差异无统计学意义（图2）。
由于Arp2/3复合物在介导肌动蛋白动态变化中的作用，已知α-连环蛋白对Arp2/3具有抑制作用，以及我们先前观察到α-连环蛋白缺失会导致细胞运动性增强3，因此我们探究了使用小分子抑制剂CK-666抑制Arp2/3复合物是否能够消除α-连环蛋白缺失所引起的运动性增强。两种稳定表达shRNA的HaCaT角质形成细胞系——一种为靶向α-连环蛋白的shRNA敲低细胞系，另一种为非靶向shRNA对照细胞系——这些细胞系的构建与验证如前所述8，被接种于96孔成像板上。
我们.......
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讨论
上述方法与分析工具提供了一种简单且可扩展的方法，用于测量和量化 HaCaT 角质形成细胞的运动能力，该方法使用 MATLAB，且仅需极少的编程经验。本实验方案要求对细胞核进行染色，并在至少 5 小时内进行连续成像。虽然数据采集可在任何合适的显微镜上完成，但本方案提供了一个脚本，用于将 ImageXpress Micro XL 显微镜采集的图像处理为每个成像位点的 TIFF 图像序列，该序列显示了所有时间点上细胞核位置的时间推移变化。在将这些 TIFF 图像序列通过 ImageJ 的 TrackMate 插件处理后，本方案可将输出的轨迹整合为一个单一的 MATLAB cell 结构，其中包含每个成像位点及单个细胞的平均运动能力、标准差和轨迹数据。
尽管已有其他细胞运动性分析工具，但本方法利用 MATLAB 以一种直接且可扩展的方式，对通过 ImageJ TrackMate 插件追踪的细胞进行运动速率分析。该图像分析流程在计算上效率较高，可在搭载 Windows 或 iOS 操作系统的个人计算机上运行；虽然所提供的脚本是为 iOS 机器编写的，但只要将路径名中的正斜杠替换为反斜杠，即可.......
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披露
X.L. 和科罗拉多大学博尔德分校对HDAC抑制剂的治疗用途开发具有经济利益，并持有OnKure公司的股权。X.L. 是OnKure公司的联合创始人及董事会成员，该公司已从科罗拉多大学博尔德分校获得专有HDAC抑制剂的许可。OnKure公司未参与本研究的实验设计，也未提供资金支持。
致谢
感谢 Daniel Messenger、Lewis Baker、Douglas Chapnick、Adrian Ramirez、Quanbin Xu 以及 Liu 和 Bortz 实验室的其他成员提供的见解和建议。感谢 Jian Tay 分享其 MATLAB 专业知识并编写了用于 XML 导入的函数。感谢 BioFrontiers 先进光学显微镜核心设施的 Joseph Dragavon 提供的显微镜与成像技术支持。感谢细胞培养核心设施的 Theresa Nahreini 和 Nicole Kethley 提供的细胞培养支持。本研究工作由美国国立卫生研究院下属的国家癌症研究所和国家关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所资助（项目编号 R01AR068254）支持 X. L. 的研究，以及由国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助（项目编号 R01GM126559）支持 D.B. 和 X. L. 的研究。G.E.W. 和 E.N.B. 的研究得到了 NIGMS 资助的博士前培训项目（T32GM08759）的支持。ImageXpress Micro XL 显微镜系统由国家研究资源中心（S10 RR026680）资助。FACSAria 流式细胞分选仪由美国国立卫生研究院（S10OD021601）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔平底透明黑色聚苯乙烯TC处理微孔板，单独包装，带盖，无菌 | Corning | 3603 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（高D-葡萄糖） | Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific | 12800-082 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich Inc | F0926 | |
| Fluorobrite杜尔贝科改良伊格尔培养基（高D-葡萄糖，3.7 g/L碳酸氢钠，不含L-谷氨酰胺，不含酚红） | Gibco/Thermo Fisher Scientific | A18967-01 | |
| GlutaminePlus | R&D Systems Inc. | R90210 | |
| Hoechst 33342，三盐酸盐三水合物 | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14190-144 |
参考文献
- Li, L., He, Y., Zhao, M., Jiang, J. Collective cell migration: Implications for wound healing and cancer invasion. Burns & Trauma. 1 (1), 21-26 (2015).
- Stuelten, C. H., Parent, C. A., Montell, D. J. Cell motility in cancer invasion and me....
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重印与许可
