用于分析和整合 TrackMate 输出的协议，用于使用细胞核跟踪测量二维细胞运动

摘要

该协议用于高通量测量 HaCaT 角质形成细胞中的细胞运动，描述了收集和处理细胞核图像以及使用 ImageJ 插件 TrackMate 进行粒子跟踪的方法。

摘要

集体细胞迁移在许多基本生物过程中起着关键作用，包括发育、伤口愈合和癌症转移。要了解细胞运动的调节，我们必须能够在不同条件下轻松一致地测量它。在这里，我们描述了一种使用核染色测量和量化 HaCaT 角质形成细胞的单细胞和大量运动的方法。该方法包括一个 MATLAB 脚本，用于分析 TrackMate 输出文件，以计算单个细胞中的位移、运动速率和轨迹角，并批量计算成像站点的位移、运动速率和轨迹角。该运动分析脚本允许对 TrackMate 数据的细胞运动率进行快速、直接和可扩展的分析，并可广泛用于识别和研究上皮细胞的运动调节。我们还提供了一个 MATLAB 脚本，用于重新组织在显微镜上收集的显微镜视频并将其转换为 TIF 堆栈，可以使用 ImageJ TrackMate 插件批量分析。使用这种方法来探索粘附连接和肌动蛋白细胞骨架动力学在调节 HaCaT 角质形成细胞运动中的作用，我们证明了 Arp2/3 活性是 HaCaT 角质形成细胞 α-catenin 耗竭后运动升高所必需的。

引言

上皮细胞中细胞运动的精确、反应性调节对于伤口愈合和补充上皮层至关重要。不能维持运动会导致胚胎发育和伤口愈合问题¹ ，而过度活跃的运动信号传导是癌症转移² 的关键因素。

了解 HaCaT 角质形成细胞对运动的控制为了解这些过程提供了重要的见解。此处概述的程序提供了单细胞或群体水平上细胞运动平均幅度的一致测量和计算。我们使用这种方法来测量遗传扰动或用小分子抑制剂处理后 HaCaT 角质形成细胞的运动，以了解控制运动速率的细胞信号传导。提供的 MATLAB 脚本测量每个细胞的平均速度和平均运动方向。

集体细胞运动对于发育和癌症转移中的上皮-间质转化至关重要³。细胞通过粘附、极化、突出和回缩的协调来实现运动⁴。这些过程在很大程度上依赖于动态肌动蛋白细胞骨架的协调调节。PI3K 下游 Rac1 GTP 酶或各种受体酪氨酸激酶的激活使细胞极化，导致肌动蛋白聚合⁵。肌动蛋白细胞骨架动力学受这种酶和其他 Rho 介导的 GTP 酶的调节，这些 GTP 酶被各种生长因子的下游激活。然后，这些 Rho 介导的 GTP 酶激活刺激肌动蛋白分....

方案

1. 细胞培养和成像板制备

1. 在 37 °C 和 5% 二氧化碳的细胞培养基（补充有 2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素/链霉素和 10% （v/v） 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基）中培养 HaCaT 细胞，置于加湿培养箱中。
2. 在 96 孔成像板（例如 96 孔黑色聚苯乙烯微孔板）中接种每孔所需数量的细胞（我们使用 5000 - 20,000 个细胞/孔）。向三个孔中，仅添加培养基（无细胞）。
3. 将板放在完全平坦的表面上 20 - 30 分钟，以便细胞可以以均匀的空间分布附着在板的底部。
4. 将板转移到加湿的细胞培养箱（37°C，5%二氧化碳）中4-6小时，以使细胞完全粘附在板的底部。
5. 从板中取出培养基，用 2 μg/mL Hoechst 染料（1 mg/mL 储备液的 1:5000 稀释液）的细胞培养基替换。
6. 将板放回加湿的细胞培养箱（37°C，5%二氧化碳）中2小时。
7. 用每孔 100 μL 磷酸盐缓冲盐水轻轻洗涤板 3 次，然后向每个孔中加入 90 μL 成像培养基（不含酚红的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基，补充有 2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素/链霉素和 10% （v/v） 胎牛血清）。
8. 如果测量小分....

结果

为了确保我们的分析脚本可靠和一致，我们在三个独立实验中测量了 HaCaT 角质形成细胞的运动。我们发现，虽然细胞运动的标准差在实验之间是可变的（可能是由于 HaCaT 细胞对汇合和机械刺激的敏感性），但根据双尾学生的 t 检验，平均运动在多个实验中一致复制，重复之间没有统计学上的显着差异（图 2）。

由于 Arp2/3 复合物在介导肌动蛋白动力学中的作用、已知的 α-catenin 对 Arp2/3 的抑制作用，以及我们之前观察到的 α-catenin 耗竭导致运动性增加³，我们研究了使用小分子抑制剂 CK-666 抑制 Arp2/3 复合物是否会消除 α-catenin 耗竭时增强的运动。将稳定表达靶向 α-catenin 的 shRNA 敲低或非靶向 shRNA 对照的两种 HaCaT 角质形成细胞系接种在 96 孔成像板上，如前所述⁸ 产生和验证。

我们使用我们的方法.......

讨论

上述方法和分析工具提供了一种简单且可扩展的方法来测量和量化 HaCaT 角质形成细胞的运动，该方法使用 MATLAB 并且需要最少的编程经验。该方案要求在至少 5 小时的过程中对细胞核进行染色和成像。虽然可以在任何合适的显微镜上进行数据收集，但该协议提供了一个脚本，用于将 ImageXpress Micro XL 显微镜上收集的图像处理到每个成像位点的 TIFF 堆栈中，该堆栈显示了所有时间点细胞核位置的延时。在通过 ImageJ 的 TrackMate 插件处理这些 TIFF 堆栈后，该协议允许将输出轨迹合并到单个 MATLAB 细胞结构中，其中包含每个成像位点和单个细胞的平均运动、标准偏差和轨迹。

虽然可以使用其他细胞运动分析工具，但该方法使用 MATLAB 以简单且可扩展的方式确定使用 ImageJ TrackMate 插件跟踪的细胞的运动率。此图像分析管道的计算效率足够高，可以在使用 Windows 或 iOS作系统的个人计算机上运行;虽然提供的脚本是为在 iOS 计算机上使用而编写的，但一旦路径名更新为包.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96 孔平底透明底黑色聚苯乙烯 TC 处理微孔板，独立包装，带盖，无菌	宁	3603
Dulbecco's 改良鹰培养基（高 D-葡萄糖）	Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific	12800-082
胎牛血清	Sigma-Aldrich Inc	F0926
Fluorobrite Dulbecco 改良 eagle 培养基（高 D-葡萄糖，3.7 g/L 碳酸氢钠，无 L-谷氨酰胺，无酚红）	Gibco/Thermo Fisher Scientific	A18967-01
谷氨酰胺Plus	R&D Systems 公司	R90210
Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物	Invitrogen/Thermo Fisher Scientific	H21492
青霉素链霉素	Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific	15140-122
磷酸盐缓冲盐水	Gibco/Thermo Fisher Scientific	14190-144