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用于高分辨率冷冻电子断层扫描的三维关联聚焦离子束切片样品制备

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DOI：

10.3791/62886

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2021年10月25日

 ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Biochemistry, 2Max Planck Institute for Biophysics, 3Fondazione Human Technopole

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于引导冷冻电子断层成像样品制备的三维关联聚焦离子束切削技术流程。首先通过冷冻荧光显微镜确定荧光标记的目标蛋白的三维位置，随后对该位置进行聚焦离子束切削。该方案适用于哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌细胞。

摘要

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）已成为研究细胞超微结构及分子复合物在其天然、冷冻水合状态下结构的首选方法。然而，cryo-ET 要求样品足够薄，以避免对入射电子束产生散射或阻挡。对于较厚的细胞样品，可通过冷冻聚焦离子束（FIB）切削技术实现。本实验方案描述了如何在 FIB 切削过程中采用三维关联成像方法，精确定位特定的细胞位点。该方法结合了三维荧光显微镜数据与 FIB-扫描电子显微镜的信息。利用该技术，可高精度地定位稀有细胞事件和结构，并通过冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）在分子分辨率水平上进行可视化观察。

引言

聚焦离子束（FIB）切割技术能够从冷冻固定的样品中制备薄的生物样本，避免了传统机械切片中常见的刀痕和压缩伪影等问题1。当与冷冻电子断层扫描技术（cryo-electron tomography）结合时，FIB切割可实现对细胞形态的高分辨率生物学研究，并直接在细胞内以亚纳米分辨率解析大分子复合物的结构2,3,4。尽管在随机切割的FIB薄片中容易观察到核糖体等丰度较高的结构，但许多细胞过程依赖于多个复合物的共定位，或局限于细胞内的特定区域。因此，为避免在切割过程中丢失感兴趣的生物学结构而仅依赖随机采样，必须实现高效的靶向定位。这就需要采用一种关联成像方法，将扫描电子显微镜（SEM）-FIB与冷冻荧光显微镜（FLM）的数据相结合。虽然理论上可以省略初始关联步骤，仅在透射电子显微镜（TEM）成像后整合FLM与冷冻电子断层扫描数据5,6，但荧光引导的聚焦离子束切割能够在切割前精确选择目标区域，从而显著提高数据采集效率。自该技术提出以来7，三维关联FIB切割在生物研究中的应用一直较为有限，直到我们近期利用该技术在酵母中鉴定出一种新的液-液相分离（LLPS）区室结构8。

本文介绍了一种通用的三维冷冻关联光镜与电镜（CLEM）实验方案，可用于研究从细菌、酵母到哺乳动物细胞等多种类型的样品。尽管实验使用了特定的仪器组合，但各步骤并不依赖于特定硬件，可作为现有方案的扩展，轻松转移至其他系统3,5。所用经过验证的设备清单及推荐设置详见材料表和表1。该流程包含四个关键步骤：（1）样品制备，（2）利用冷冻荧光显微镜定位感兴趣区域，（3）三维关联聚焦离子束切削，以及（4）在冷冻透射电子显微镜下对冷冻薄片进行目标结构定位，以开展冷冻电子断层成像（cryo-ET）数据采集（图1）。

方案

冷冻电镜样品工作流程图：制备、荧光、聚焦离子束切割、透射电镜用于数据分析。
图1：工作流程概要，包含若干关键步骤的示意图。 整个实验流程根据所用设备分为四个阶段：样品制备、投入冷冻、冷冻荧光显微镜观察、冷冻聚焦离子束切割以及冷冻透射电子显微镜成像。针对每个步骤，均标出了若干关键要点。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 细胞培养与载网的投入冷冻

  1. 在进行冷冻实验之前，先在室温下培养目标细胞，并优化标记和处理策略。目标结构可通过荧光蛋白融合或活细胞染色（如 Halo-Tag、LysoTracker、BODIPY、活体抗体染色等）进行标记。若需使用化学或生物试剂（如小分子、特殊培养基、siRNA 等）处理以研究特定生物学过程，应利用活细胞荧光显微成像优化处理条件（如时间、浓度）。
    1. 确保在足够数量的细胞中，使用尽可能接近后续冷冻条件的成像参数（如数值孔径、曝光时间等），能够成功地在背景之上定位到目标区域。
  2. 载网的选择与制备
    1. 选择适合细胞大小和所用 fiducial 标记物的孔径与间距的载网（见步骤 1.3.1）。请勿使用无孔连续膜，因其可能导致 blotting 后残留过多缓冲液，从而降低玻璃化效率并妨碍 fiducial 小球的检测。若细胞需长时间接触载网，应确保载网支撑结构及膜材料具有生物相容性。
    2. 使用等离子体清洁冷冻电镜载网，以增强其亲水性。若用于贴壁细胞培养，需在超净台中用紫外光照射20分钟对载网进行等离子体清洁后的灭菌处理。根据需要，可按照下述方法用有助于细胞贴附的化合物对载网进行预处理，例如聚-L-赖氨酸或多聚-L-赖氨酸或刀豆球蛋白A。
      注意：通常情况下，以下网格/样品组合已成功应用于关联冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）工作流程：酵母：Cu 或 Au，200 目，R1/4 碳或 SiO2 薄膜，可选地用刀豆蛋白A包被； 大肠杆菌铜或金，200目，R1/4碳或二氧化硅2 薄膜； 莱茵衣藻铜或金，200目，R1/2或R1/4碳膜或二氧化硅膜2 薄膜；HeLa：Au，200目，R1/4 SiO2 覆有聚-L-赖氨酸的载网；HEK293：金，200目，R1/4二氧化硅2 聚-L-赖氨酸包被的膜
    3. Concanavalin A 包被以改善酵母细胞的黏附
      • 配制含100 µM CaCl₂的10 mM HEPES缓冲液中的1 mg/mL刀豆蛋白A涂层溶液2，pH 8.5。在一片石蜡膜上分别滴加一滴（50 µL）包被液和两滴蒸馏水。
      • 用反向镊子夹取经等离子清洗的载网，小心将其插入包被溶液液滴中，避免垂直于载网方向的移动，以防损坏薄膜。
      • 孵育约5秒后，以同样方式将载网浸入水滴中清洗两次。最后，用滤纸从载网背面吸去多余液体，并让载网完全干燥后再将其从镊子上取下。将干燥后的载网用于冷冻固定。
    4. 用于悬浮培养和贴壁细胞的多聚-L-赖氨酸包被：
      • 在 pH 8.5 的 0.1 M 硼酸钠缓冲液中配制浓度为 1 mg/mL 的多聚-L-赖氨酸包被溶液。
      • 将经等离子清洗的载网放入适合细胞培养的培养皿中，并用紫外光照射20分钟进行灭菌。
      • 轻轻加入足量包被液以覆盖所有网格，在37 °C孵育至少2小时。吸去液体后，用PBS轻轻洗涤网格两次，然后将细胞接种至所需浓度。
  3. 细胞与标记微珠的制备
    注意：进行三维关联FIB切削需要使用基准标记微珠，以实现荧光数据与FIB/SEM显微镜所获取图像的三维配准。
    1. 选择在所有成像模式下均可识别的微珠，即荧光显微镜（FLM）、扫描电镜（SEM）和离子束成像（IB）中均可见的微珠（推荐直径为0.5–1 µm），但需确保这些微珠在荧光成像过程中不会掩盖细胞靶结构，以便于区分微珠与感兴趣的生物结构。去除标记微珠中的细胞毒性防腐剂（例如NaN₃）。3按照制造商的说明进行操作。
      注意：为了更清晰地区分目标生物学特征与定位标记物，建议荧光发射光谱仅部分重叠，以便根据荧光显微成像通道中的信号强度差异来区分两者。
    2. 若使用悬浮培养，将细胞培养至适宜密度（例如，酵母 OD600 = 0.8, E. coli 光密度600 = 0.8-1.0, C. reinhardtii 1500 个细胞/µL）并根据实验需要进行相应处理，如更换培养基、添加化学物质、饥饿处理等。根据浸入法（手动/自动）的要求，将经等离子体清洁的载网固定于镊子上，加入 4 µL 细胞悬液（其中混有约 1 × 105 每微升（µL）标定微球悬液加入微球至载网的膜面。
      注意：应在滴定实验中确定细胞和定位标记物的最佳稀释比例（例如，通过冷冻荧光显微镜或聚焦离子束/扫描电子显微镜检查，见下文）。然而，对于大多数悬浮培养的细胞，最终浓度约为 ~1 x 105 1 µm 阈值微珠（按20倍稀释；参见 材料表 （详见正文）已被证明是一个良好的起点。
    3. 若采用贴壁培养，需使用紫外辐射对载网进行等离子清洗和灭菌，以实现无菌培养。必要时，可用促进细胞贴附的化合物预先包被载网（如聚-L-赖氨酸、纤连蛋白、层粘连蛋白；参见步骤1.2.2）。将细胞接种于载网上，并在常规培养皿或带有载网分隔区域的培养皿中进行培养。
    4. 根据实验需要处理样品，并将细胞维持在最佳条件下直至投入冷冻（例如，37 °C、5% CO₂）2 对于HEK/HeLa细胞，小心地将载网从培养皿中取出，并将其附着于冷冻夹上。加入4 µL含有标记物（fiducials）的培养基混合液（1 x 105 珠/µL，用于1 µm的定位标记）至含有细胞的一侧。
  4. 使用手动或自动冷冻程序对细胞进行 plunge-freeze。如果可能，仅从细胞相对的一侧对载网进行 blot，以避免对细胞造成机械损伤（图2A）。在双臂自动冷冻制样系统中，可通过将聚四氟乙烯（例如特氟龙）片材代替滤纸放置在朝向细胞的垫片上来实现。将载网转移至储存盒中，并置于液氮（lN₂）中保存2直至使用前
    警告：lN2 以及其他冷冻剂可能对眼睛和皮肤造成严重损伤。应使用个人防护装备（PPE），并在通风良好的环境中操作，以避免危险的N₂积聚2 浓度
    注意：所有后续步骤最好在液氮的液相中进行2 为避免细胞和薄片表面受到污染（这可能会增加后续处理的难度），应尽量减少与漂浮冰晶的接触。可通过始终使用洁净的液氮（例如，过滤以去除漂浮的冰晶）、减少不必要的转移步骤，以及在可能的情况下于湿度可控的环境中操作来实现。
  5. 将冷冻蚀刻网格安装并固定在带有切口且细胞面向上的 AutoGrids 中（图 2A) 用于后续的冷冻荧光成像和聚焦离子束（FIB）切削。为确保样品在透射电子显微镜（TEM）中的正确对齐，切削方向必须与冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的倾转轴正交。因此，在将样品夹固定到AutoGrid之前，应在AutoGrid上添加取向标记（例如激光刻痕或可移除的标记点），以辅助实现此对准。图2A).
  6. 筛选网格质量（图2B在冷冻荧光显微镜（cryo-FLM）和聚焦离子束/扫描电镜（FIB/SEM）上优化细胞密度、 blotting 时间和压力，以获得细胞和标记微珠的均匀分布。使用冷冻荧光显微镜的反射光成像或冷冻FIB-SEM，确保细胞和 fiducial 微珠均清晰可见。图2B，白色箭头）。
  7. 如有必要，可调整条件（如细胞浓度和/或 blotting 时间）后重复冷冻制样。一旦确定合适的冷冻制样参数，无需在每轮新实验中重复进行载网筛选。

样品制备；TEM倾转轴示意图；SEM与离子束切削；冷冻光学显微镜流程。
图2：利用扫描电镜（SEM）和离子束（IB）筛选合适的载网。（A）应在AutoGrid上垂直于切削方向标记取向标记，以便正确装入透射电镜（TEM）。组装好的AutoGrid中，细胞应朝上放置。（B）快速冷冻后，需在扫描电镜中检查载网，以评估并优化冷冻条件：a）每张载网上细胞数量不宜过多。例如，对于HeLa细胞，每个方格内不要超过1–4个细胞；对于较小的细胞（如本图所示的Saccharomyces cerevisiae），4–6个细胞的聚集体已被证明较为适用。b）定位金标颗粒（白色箭头）应清晰可见，且细胞周围不应有过多缓冲液。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 冷冻荧光显微镜

  1. 针对每个载网，先在（宽场）荧光模式以及微分干涉差（DIC）或反射模式下获取整体图像，选择具有荧光信号的合适网格区域。所选视野应同时包含目标细胞和足够数量的定位标记物（6–12 个）。
    1. 确保细胞和微珠分布均匀，密度适中，并位于每个方格的中心区域。仅选择可被聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）和透射电子显微镜（TEM）共同访问的方格，因此在 200 目载网上应选择距离边缘至少三个方格外的区域（图 3A，红色圆圈内）。
  2. 在每个选定的载网方格上，采集荧光图像堆栈，其焦距步进应适合后续去卷积处理，即小于轴向分辨率极限的一半（<½）。如有可能，使用高数值孔径（NA）物镜以提高光子计数和定位精度。
    1. 在配备 NA 0.9 物镜的共聚焦显微镜上，以 300 nm 的步长采集图像堆栈，超过奈奎斯特采样频率。如需要，可记录多色图像堆栈（图 2B）。将载网保存于液氮（lN2）中，待后续使用。
      ​注意：为确定最佳步长，可采用显微镜控制软件计算出的数值，或使用在线工具9。检查各通道间是否存在信号串扰，因为过度串扰会对共定位实验造成不利影响；但适量串扰可能有助于校正多色图像堆栈中的色差。
  3. 使用适当的软件对图像堆栈进行去卷积处理10,11，若需要各向同性的像素尺寸，可进一步进行重切片处理7。去卷积处理——与室温下成像类似——可改善荧光显微镜（FLM）信号质量，并可能提升定位精度（图 3C）。

冷冻荧光显微成像流程；Z轴层扫采集、FLM示意图、强度分析、去卷积。
图3：选择用于FLM层扫采集的区域及通过去卷积优化数据。（A）浸入式载网上表达eGFP-Ede1（绿色）和mCherry-Atg8（品红色）的酵母细胞网格概览。应选择微珠与细胞分布良好的位置，但需避免载网边缘区域（红色阴影部分）。方框标示了细胞分布良好且用于采集荧光层扫图像的位置。（B）对A图中黄色方框区域采集的多色层扫图像经去卷积处理后的最大强度投影（MIP）。FLM层扫图像的去卷积显著减少了背景噪声信号，并更准确地实现了微珠在Z轴方向的定位，这一点从去卷积前（C）和去卷积后（D）的高斯拟合结果中可以明显看出（拟合在3DCT中完成，图中显示的是标记为1的微珠）。图像展示了红色通道的放大MIP视图（激发光：552 nm，发射光：585–650 nm）。请点击此处查看该图的高清版本。

3. 聚焦离子束刻蚀

  1. 将载网装入冷冻聚焦离子束-扫描电子显微镜（cryo-FIB-SEM）仪器中，并利用切口和/或取向标记确保其方向正确，以便后续放入透射电子显微镜（TEM）时准确定位图 2A）。确保研磨方向与透射电子显微镜（TEM）的倾斜轴垂直。
  2. 使用气体注入系统（GIS；CpMePtMe3在FIB-SEM系统预设的阶段位置对载网进行处理，以沉积一层保护性有机金属涂层。涂层不宜过厚，以免干扰后续透射电镜中定位标记微球的识别。使用等离子体镀膜仪沉积金属铂，以减少样品充电效应。
    注意：若无可用的GIS镀膜参数设置，可通过多次短时间镀膜（约2秒）后进行FIB切割来快速确定合适参数。需确保样品在中等电流（约100 pA）下仍可成功切割，且薄片边缘周围无明显的保护性有机金属层扩散现象。GIS喷针与样品之间的距离和镀膜时间均为需考虑的重要参数。GIS喷针不应在室温设置下（即45 °C）运行，而应尽可能保持低温，但仍能提供均匀镀膜（25–27 °C）。
  3. 记录扫描电镜（SEM）网格概览图像，并与荧光显微镜（FLM）概览图像进行二维关联，以确定已记录荧光图像堆栈的网格区域。可通过人工方式同时检查两种图像视图，或使用多种软件工具完成7,10,12 以找到网格方格。此处重点介绍三维相关性工具箱（3DCT）7，该方法在视图间采用带有各向同性缩放的三维刚体变换。有关3DCTs功能的详细操作指南可在线获取。13.
    1. 在荧光显微镜（FLM）和扫描电镜（SEM）网格概览图中（右键点击），选择并标记至少四个对应的定位点，例如支撑膜上的栅格条或孔洞等特征点，并计算这些标记点之间的转换关系（进行关联）。
    2. 接下来，将标记置于已获取FLM图像序列的相应网格方格中心，并预测其在SEM视图中的位置（关联）； 图 4A).
  4. 对于每个对应的网格方格，在聚焦离子束（FIB）铣削选定角度（对于45°预倾斜样品台，角度为10°–25°）下，采集低束流（≤10 pA）的离子束（IB）图像。选择与荧光数据相匹配的视野（即位置和放大倍数）。对于200目网格，采集的荧光数据和FIB/SEM数据应包含单个网格方格及其网格条（参见 图3A 和 图 4A).
    注意：铣削时应尽可能采用较浅的倾角，以避免在冷冻电子断层扫描（cryo-ET）过程中损失较大的倾转角度范围，并确保能够识别出足够数量的标志金颗粒。例如：当台体倾角为17°、样品转移杆预倾角为45°、聚焦离子束（FIB）相对于铅垂方向的倾角为52°时，薄片的预倾角为10°，此时在透射电子显微镜（TEM）中可通过从-50°倾转至+70°（许多TEM冷冻样品杆的最大倾转范围）来实现接近理想的±60°倾转角范围。
  5. 拍摄同一区域的扫描电镜（SEM）图像，以帮助在荧光和离子束成像中识别对应的微珠。
  6. 对每个位置的去卷积三维荧光显微图像堆栈和二维离子束视图，按照以下方法与三维CT进行配准图4B步骤。
    1. 在3DCT中加载相应的重新切片3D FLM图像序列和离子束（IB）视图。
      注意：多色荧光数据可作为最多三个独立的单通道图像序列文件加载。
    2. 在荧光数据中选择4个标记微珠，右键点击位置列表以确定其三维位置 通过 在 x、y 和 z 方向上对信号进行高斯拟合。在 IB 图像中选择对应的微珠，并执行初始三维相关（correlate）。
    3. 在荧光图像中逐步添加更多微珠，优化其三维位置，并预测其在IB视图中的位置，以快速将更多微珠加入配准过程并检验相关性的准确性。在3DCT中，提供均方根误差（RMSE）值以评估相关性的一致性。7.
      1. 确保均方根误差（RMSE）值较小，且处于定位精度的数量级（约300 nm）。为评估配准的准确性，可在配准步骤中故意排除部分在荧光和离子束图像中均清晰可辨的标记微珠。通过比较这些微珠在离子束图像中的预测位置与实际位置来验证配准效果。若预测位置与实际位置存在显著偏差，应使用一组新的标记微珠重新进行初始配准。
        注意：关联6-8个微珠已足以实现FLM图像序列与IB视图的准确配准。然而，在较宽的z值范围内增加定位标记的数量（最多12-15个）（例如，通过选择网格条上或相邻方格中的微珠）可提高关联的准确性。
    4. 选择目标细胞信号，将其在FLM图像栈中的三维位置进行匹配，并应用变换以预测其在IB视图中的目标位置图4B).
      注意：FLM 位置列表中任何在 IB 列表中没有对应项的条目，将被视为需要预测的信号。
  7. 对于每个相关方格，将目标特征的预测位置转移至FIB-SEM仪器，并设置薄片铣削图案（图4C）。手动转移位置（例如，通过测量到可见标记物（如细胞或定位标记微珠）的距离）或使用自动化和脚本，例如在 SerialFIB 中实现的方式14如果每个细胞有多个信号，应调整模式，使尽可能多的兴趣点（POIs）位于同一片层内，以提高通量。
  8. 首先进行粗磨，然后细磨，将薄片研磨至最终厚度为150–250 nm。避免产生台阶（例如应力释放切口）15）导致片层下垂，从而引起所关注的实际结构相对于先前采集的 FLM 图像序列发生位移。可使用手动3 或自动化14,16,17,18 FIB 研磨步骤。无论采用哪种方法，均需从薄片顶部和底部对称地进行减薄，以确保目标区域始终位于薄片中心。
  9. 为评估每片薄片铣削的准确性，执行与步骤3.4相同的配准操作。然而，此次应使用聚焦离子束（FIB）铣削完成后的最终IB图像，检查目标特征的预测位置是否包含在最终薄片范围内。或者，可叠加由3DCT输出结果及自定义脚本获得的FLM图像堆栈的旋转投影19，最终的IB图像（图4C，小片段插入）

冷冻FIB切片示意图；SEM图像关联位点，预测感兴趣区域，并指导薄片制备。
图4：三维关联FIB切片流程。（A）通过荧光显微镜（FLM，左）和扫描电镜（SEM，右）对载网进行二维-二维关联，定位先前采集荧光图像的载网方格。（B）对于每个选定的方格，在三维CT（3DCT）中完成三维-二维对应标记点位置配准（彩色框）后，在FLM数据中选择感兴趣生物结构的位置。根据其在离子束图像中对应位置的预测结果（红色圆圈），确定用于薄片制备的位点。（C）利用扫描电子显微镜（SEM）和离子束（IB）图像在切片过程中保持目标结构居中。最终薄片厚度为150–250 nm，已证实足以满足后续下游处理需求。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 相关透射电子显微镜（TEM）

  1. 将载网装入透射电子显微镜（TEM）中，确保薄片区（根据切口或取向标记判断）的方向与倾斜轴垂直。
    ​注意：不同制造商的显微镜可通过多种软件进行控制，例如 Tomo5、TOM 或 SerialEM20。此处重点介绍后者。
  2. 对包含薄片区的每个载网方格采集网格拼接图和概览图像。确保放大倍数和曝光时间适合在TEM图像中清晰显示标记微珠，同时不显著增加总电子剂量。对每个薄片区采集高分辨率TEM图（拼接图）。
  3. 在3DCT中，将FLM图像序列与TEM载网方格及薄片区概览图进行配准和三维-二维关联。选择荧光图像中微珠位置（x, y, z — 高斯拟合）与透射电子显微镜图像中的对应位置，操作流程同步骤3.6所述。然后，在FLM通道中选择感兴趣区域的位置，并将其转移至TEM概览图中。如有必要，可采用两步法：首先在FLM与低倍TEM图像之间进行关联，再从低倍TEM图像关联至高倍TEM图像（图5）。
  4. 可通过手动方式（通过测量至参考标志的距离）、SerialEM20 内置的配准与地图工具，或使用外部软件（如 CorRelator21）进行位置转移。
  5. 在已关联的位置设置并运行倾转系列成像。采用适当的放大倍数、离焦量和总剂量（详见材料表和表1）。从由薄片区确定的预倾角开始采集（参见步骤3.4中的注释），并采用剂量对称的倾转方案22。可选择手动或批量采集模式。

FLM-TEM 相关性示意图，用于显微镜和结构分析中的三维-二维微珠转换分析。
图 5：在透射电子显微镜中相关位置的定位。 在成功完成三维相关聚焦离子束切片并转移至透射电子显微镜后，通过比较荧光显微镜图像序列（FLM stacks）与透射电镜概览图中标志微珠（彩色方框）之间的切片区域，进行三维-二维配准，以定位可用于冷冻电子断层扫描的潜在位点（红色圆圈）。随后可获取更高倍率的薄片概览图（放大图），以便更精确地设置断层图采集区域。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

本方案详细介绍了发现含有EH结构域的内吞蛋白1（Ede1）依赖性内吞蛋白沉积物（END）及其在自噬体中降解与滞留过程的技术流程8。END是酿酒酵母（S. cerevisiae）中一种通过液-液相分离形成的区室，在内吞事件失败后可缓冲多种参与网格蛋白介导的内吞作用（CME）的蛋白质。Ede1是该结构的主要组分之一，它既作为CME的组成部分，又作为选择性自噬受体介导这一新型液-液相分离（LLPS）区室的降解。因此，采用酒精脱氢酶（ADH）启动子驱动的EGFP-Ede1融合蛋白（EGFP-Ede1）来可视化观察END，因为Ede1的过表达会干扰内吞作用的早期阶段，从而持续诱导液-液相分离的发生。

在载有过度表达EGFP-Ede1酵母细胞和1 µm标记物的冷冻电镜载网上，选择五个位置在GFP通道中采集FLM图像序列（图6A；TFS Corrsight；共聚焦模式，焦距步长300 nm，范围10 µm）。将载网转移至FIB仪器（Quanta 3D FEG）中，通过荧光与SEM载网概览图进行二维对二维相关比对，确定已采集FLM图像序列的载网方格（参见步骤3.2）。

对于每个选定的方格，均在低电流条件下（10 pA，1200倍放大）采集离子束图像，并在3DCT中记录相应的基准标记位置。在选定具有目标生物学特征的位置并将其三维位置与FLM图像堆栈进行拟合后，将所得的变换应用于预测的END位置，进而确定薄片制备的位点（图6B）。本研究示例中采用的FIB束相对于网格表面倾斜11°（45° FIB摆动预倾角；18°样品台倾角）。将感兴趣的位置进行转移后，通过测量预测位置与FIB图像中显著地标（如孔洞、冰污染、基准标记微珠）之间的距离，手动绘制FIB加工图案（图6D）。通过有意排除在FLM和IB图像中均可清晰识别的微珠，随后比较其在离子束图像中的实际位置与预测位置，以此评估配准的准确性（例如，图6B、C中的菱形标记）。对于图6C所示方格，配准相关性结果准确（即FLM中微珠位置的预测结果与其在离子束图像中的对应位置完全重合，且3DCT报告的配准亚像素均方根误差（RMSE）值极小）。因此，在预测位置（位点B）切割薄片，并精细铣削至厚度约为200 nm（最终图案偏移量）。

用于显微镜分析的薄片制备位点的扫描电镜与荧光显微图像及研磨模式示意图。
图6：酵母中内吞蛋白沉积物（END）三维关联定位的代表性结果。（A）研磨前载网的扫描电镜概览图。彩色方框表示此前已采集荧光图像堆栈的网格区域。（B-C）单个网格区域内的三维关联。通过在荧光显微图像数据（B，此处显示为最大强度投影）和离子束图像（C）中匹配多个对应的标记微珠（彩色方框），验证三维配准的准确性；随后利用标有菱形的微珠位置进行预测以确认配准精度。接着，在离子束图像中预测两个潜在研磨位点处目标信号的位置（红色圆圈）。（D）B位点的放大图，显示三个目标信号点（红色圆圈）的预测位置以及初始研磨模式（黄色方框）。第四个荧光信号点预测深度明显更深，因此未在研磨过程中被靶向（灰色圆圈）。请点击此处查看该图的放大版本。

在成功完成聚焦离子束（FIB）铣削并将载网转移至冷冻透射电子显微镜（Titan Krios，工作电压300 kV，配备Gatan K2直接电子探测器和Bioquantum能量滤波器）后，使用SerialEM采集载网的概览图像，并用于定位含有薄片的方格区域。针对每个薄片，采集概览图像，并利用相应的标记微珠在3DCT（3D-2D）中完成荧光显微镜（FLM）数据的三维配准。随后，基于标记微珠计算出的变换关系，预测目标生物学特征的位置（图7A）。以更高倍率记录的薄片概览图像进行拼接，并利用清晰可见的参照标志（例如标记微珠）实现感兴趣区域的关联定位。此外，也可使用多种软件生成传统的CLEM概览图像10,12。

根据相关性分析，图7A所示薄片中发现了四个可能用于断层成像采集的位点。然而，其中也包含了一个在三维关联FIB切削过程中未被靶向的位点（参见图6D；灰色圆圈），以及一个被冰污染遮挡的位点（图7；灰色方框）。因此，仅能在两个位点成功记录断层图像（图7B）。总体而言，关联成功率约为75%，即在预测位点处成功找到经历转移至透射电镜并保留END结构的薄片（共12个关联位点）。在完成断层图像重建、分割及模板匹配后，可在其天然环境中可视化单个END结构（图7C、D）。这包括环绕END的窗孔状内质网（ER）、偶尔与之接触的脂滴，以及被排除在LLPS区室之外的核糖体。综上所述，本结果展示了三维关联FIB切削技术如何从完整细胞中获取稀有生物学过程的分子水平信息。

TEM and FLM diagram showing cell structure, ribosomes, mitochondria analysis, tomography results.
图7：利用冷冻电子断层扫描技术可视化END的代表性结果。 (A低倍透射电子显微镜下观察到的研磨位点整体形貌 图6 可轻松与FLM最大强度投影相关联（图6B）以定位感兴趣的生物特征（红色叉号）。B在第二步中，可关联更高倍率（拼接）的视野，并设定断层扫描图像采集的位置（黄色框）。由离面信号产生的位置（灰色框，参见 图6D）被忽略。C-D利用这种三维关联聚焦离子束（FIB）方法，可在其天然环境中观察内吞蛋白沉积物（END）。内质网（ER）、核糖体、膜结构和脂滴等结构均可被识别和可视化。 请点击此处以查看此图的放大版本。

等离子清洗仪设置
Harrick Plasma Cleaner PDG-3XG：射频设置：“HI”，30 秒；氮气等离子体
加样杆设置
TFS Vitrobot Mk IV：湿度 100%； blotforce = 8； blottime = 10 秒；等待时间 0 秒；（此设置适用于大多数悬浮细胞和贴壁细胞）
FIB GIS 位置与时间设置
Quanta 3D FEG：倾角 = 0，旋转 = -180，Z 位置 = 13.5，温度设定值 = 26.15°，时间 = 8 秒
TFS Scios：倾角 = 0，旋转 = -180，Z 位置 = 9.8，温度设定值 = 28° C，时间 = 7 秒
TFS Aquilos 1：软件预设位置，温度设定值 = 28°，时间 = 7 秒
TFS Aquilos 2：软件预设位置，温度设定值 = 28°，时间 = 7 秒
FIB 溅射镀膜仪设置
Quorum System：在 Quorum 样品制备腔内：10 mA，40 秒
TFS Scios：10 W，500 V，250 mA，0.2 mbar，15 秒
TFS Aquilos 1：1 kV，10 mA，10 Pa，15 秒
TFS Aquilos 2：1 kV，10 mA，10 Pa，15 秒
断层扫描图像采集
Titan Krios Gi2K2 相机，Gatan Bioquantum 能量过滤器
20 eV 狭缝；剂量对称倾斜方案（Hagen），步长 2°；从 +10°（样品薄片预倾角！）开始，至 +70° 和 -50°
Titan Krios Gi4Falcon 4；Selectris X 能量过滤器
10 eV 狭缝；剂量对称倾斜方案（Hagen），步长 2°；从 +10°（样品薄片预倾角！）开始，至 +70° 和 -50°
荧光显微镜图像采集
Corrsight（共聚焦模式）物镜：Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol；图像堆栈采集参数：x-y 像素尺寸 = 161.25 nm，z 步长 = 300 nm。
Leica SP8 Cryo-Confocal物镜：Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM；图像堆栈采集参数：x-y 像素尺寸 = 84 nm，z 步长 = 300 nm。

表1：已测试设备及建议设置参数。

讨论

1. 实验方案中的关键步骤

优化细胞培养和载网冷冻参数是该工作流程的基础。在项目初期，投入时间优化标记策略、细胞分布和标记微珠的分布，并测试不同的载网制备和滤纸吸附参数，是非常值得的。使用经过优化的快速冷冻样品将显著促进后续处理过程。

对于任何透射电子显微镜（TEM）实验，均需要制备玻璃态冰样品。对于HeLa等较大的哺乳动物细胞，每个网格方格中以1-2个细胞为宜，但即使细胞密度较高，仍可能形成良好的玻璃态冰。可选地，可在哺乳动物细胞（例如HEK293、HeLa）中通过在冷冻前10分钟将2.5-10%（v/v）的甘油加入培养基中孵育，以改善玻璃化效果23。如有条件，可使用图案化载网以确保细胞的精确定位与均匀分布，从而提高玻璃化质量以及后续的关联成像效果24。

尽管在工作流程中可以选择特定细胞，但显示目标生物学特征的细胞数量过少会显著降低整体通量。为了提高目标蛋白阳性细胞中的相关性，应使用足够明亮的荧光染料。这一点在内源性表达水平下尤为重要。我们发现，在冷冻条件下，mVenus通常优于EGFP，因其亮度更高25，且具有蓝移效应，使其在冷冻条件下仍适用于标准的GFP滤光片设置26。对于非点状目标结构，还需权衡波长与定位精度之间的关系（阿贝衍射极限）。

高效的三维关联成像还要求载网具有良好的机械稳定性，并需谨慎操作。虽然可以使用标准的带碳支持膜的金或铜载网，但根据具体项目情况，使用更刚性的SiO2薄膜可显著提高成功率。然而，目前尚未明确确定以下哪一项是成功实现三维关联成像的最关键因素：(a) 机械稳定性，或 (b) 匹配基底与薄膜之间的热膨胀系数以减少冷冻皱褶27。此外，对于拾取脆弱的金载网，可使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂层的培养皿5。

除了确保样品稳定性外，还需谨慎选择 FLM 成像参数，以获得高质量的荧光图像序列，从而在 FIB 切割过程中实现最佳定位。建议对 FLM 数据测试不同的去噪28或反卷积技术，因为这些方法可显著改善标志点（fiducials）和细胞信号的定位效果。在将荧光信号与 FIB-SEM 图像进行关联时，对标记微珠（fiducial beads）的良好采样至关重要。这些微珠应均匀分布在细胞周围，并尽可能位于不同的 z 高度上。建议通过检查那些被有意排除在标志点模型之外、但可凭肉眼清晰关联的微珠的预测位置与实际位置，来验证关联结果的一致性。还应始终考虑 3DCT 的均方根误差（RMSE）值，以评估配准的一致性。

由于聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）腔室中研磨材料和残留水的沉积（即再污染）会在片层两侧添加非晶态物质，从而增加有效片层厚度，因此将精细研磨后的片层长时间保留在显微镜中通常会因额外的电子散射事件而降低透射电镜（TEM）数据质量。因此，研磨通常采用两步法进行：首先对所有位置进行粗研磨（即研磨至约800 nm），然后进行精研磨（至约150–250 nm），并在最后一个片层完成后立即卸载载网。然而，通过逐个位点处理目标区域，即在同一片层上连续完成粗研磨和精研磨，可获得更优的相关成像效果，因为这种方式不会给片层留下发生弯曲或变形的时间。但这种方法会根据系统的再污染速率，限制每张载网上可制备的片层数量。当再污染速率为20 nm/h时，可在1–1.5小时内制备4–6个片层。

整个载网或粗切 lamella 的移动超过 >300 nm 将导致相关性差或无法完成关联（另见下文讨论的局限性）。因此，应定期检查，例如通过比较聚焦离子束（FIB）切削前、中、后阶段的离子束（IB）图像。显示显著移动（>300 nm）的位点应予以舍弃。应优化样品制备（即载网类型、细胞密度和冷冻投入参数；参见方案第1节）和切削策略，以避免此类移动。如步骤3.6所述，通过逐位点切削并减小 lamella 宽度，可显著减少 lamella 弯曲。如前所述，尽管应力释放切口15的设计旨在减少 lamella 弯曲，但它们常导致解耦的 lamella 发生协同移动，从而实际上阻碍关联。可使用集成的荧光显微镜（FLM）系统来解决此问题。

2. 方法的改进与故障排除

在进入冷冻条件之前，强烈建议对活细胞成像中的样品进行充分的表征。优化细胞样品、处理方案，并在进入冷冻工作流程前明确预期的信号类型，可显著提高实验成功率。

在本工作流程中，使用配备低温载台的独立荧光显微镜对样品进行成像，随后将载网转移至聚焦离子束显微镜中。然而，该方法已在集成荧光显微镜的FIB-SEM系统中得到验证，因此无需转移样品即可获取荧光图像29,30,31。利用此类集成系统，可在聚焦离子束切削过程中及之后对感兴趣区域进行成像，以检测目标荧光信号是否存在，同时不会增加最终薄片被污染的风险。然而，必须注意所用显微镜的光学参数，例如，低数值孔径（NA）物镜将限制对定位标记微珠和目标信号定位的精确度。尽管如此，集成的荧光显微镜装置有助于更好地应对载网和薄片的轻微形变，因为荧光显微图像序列可不断更新，并与最新的扫描电镜（SEM）和离子束（IB）图像进行比对。

在FIB切割与TEM数据采集之间，除了对薄片进行荧光成像外，还可采用TEM后的相关成像来验证薄片位置的准确性及切割的正确性5,6。

在整个相关联的工作流程中，尤其是在进行透射电子显微镜（TEM）操作时，建议将投影的荧光数据叠加到聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）/TEM图像上。此类经典的关联显微成像（CLEM）视图有助于更直观地理解细胞的哪些部分被包含在薄片中，同时也可作为有效的验证手段，用于确认关联定位的准确性。

3. 该方法的局限性

3D 相关聚焦离子束（FIB）方法需要能够附着标记微珠的样品。因此，该方法目前仅限于投入冷冻的载网样品。对于高压冷冻（HPF）的（组织）样品，目前只能进行二维-二维的相关分析。潜在的解决方案可能是使用内部标记物（例如细胞器、染色的脂滴）32,33。最终的相关成功率取决于多种因素，包括样品质量、荧光显微镜系统、薄片厚度以及目标结构的大小。采用所述3D配准方法的关联精度在最终的离子束图像上估计约为200–300 nm，大致相当于FIB加工薄片的典型厚度7。因此，明显小于此尺寸的细胞结构目前难以精确定位。此外，加工区域过度移动（>300 nm）也会降低关联精度，这一问题可能通过将荧光显微镜（FLM）系统集成到FIB/SEM仪器中来解决。在加工过程中出现明显变形或弯曲的薄片，无论如何都应从后续流程中排除。

总体而言，目前冷冻荧光成像技术受限于阿贝衍射极限。随着超分辨冷冻荧光显微技术的日益广泛应用（以及商业化），尤其是在与聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）联用实现即时操作的情况下，对细胞结构的更精确靶向成像可能成为现实。

4. 方法的意义

与非靶向和事后关联技术相比，三维关联FIB切片技术能够在耗时且资源密集的透射电镜（TEM）步骤之前选择合适的区域，从而实现更高效的数据采集和项目规划。此外，关联的荧光数据提供了额外的信息层，对于解释断层图像以及将冷冻电子断层成像（cryo-ET）结果整合到多尺度研究中具有关键作用，尤其是在处理无定形蛋白组装体或尺寸过小而无法进行模板匹配及子断层平均分析的结构时。

5. 重要性及潜在的未来应用

结合先进的工作流程，如高压冷冻样品的低温提拉技术34,35、低温聚焦离子束-扫描电镜三维成像36以及超分辨率荧光成像26,37,38,39，三维靶向薄片制备技术不仅有望用于解析孤立细胞中的生物学过程，还可使组织和患者样本适用于聚焦离子束切削及低温电子断层扫描。因此，该技术将能够在高分辨率下解析病理过程，从而成为实现纳米级活检的关键组成部分。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢Inga Wolf对信息技术基础设施的支持，Florian Beck提供的计算支持，以及Oda H. Schiøtz对稿件的审阅。Philipp S. Erdmann的部分经费来自亚历山大·冯·洪堡返国研究员奖学金，Florian Wilfling的部分经费来自欧洲分子生物学组织长期奖学金（EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014）。Anna Bieber获得了勃林格殷格翰基金博士生奖学金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
自动网格Thermo Fisher Scientific / 自制1036173（无切口），1205101（带切口）
C型环Thermo Fisher Scientific1036171
配备冷冻模块的CorrsightThermo Fisher ScientificFLM 替代方案 1
Dynabeads MyOne COOHThermo Fisher Scientific65011推荐使用 1 µm 定位标记微珠
EM Grids R1/4 SiO2QuantifoilN1-S13nAu20-01
Falcon 4 相机，配备柱后Selectris X能量滤波器Thermo Fisher Scientific相机/滤波器替代方案 1
FIB Aquilos 1Thermo Fisher ScientificFIB 替代方案 1
FIB Aquilos 2Thermo Fisher ScientificFIB 替代方案 2
FIB Quanta 3D FEGThermo Fisher ScientificFIB 替代方案 3
FIB SciosThermo Fisher ScientificFIB 替代方案 4
K2 summit 相机，配备柱后能量滤波器 968 Quantum K2Gatan相机/滤波器替代方案 2
配备冷冻模块的Leica TCS SP8Thermo Fisher ScientificFLM 替代方案 2
等离子清洗机 PDC-3XGHarrick
聚四氟乙烯片（0.25 mm）plastx24.de11645裁剪至与滤纸相同尺寸
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2Thermo Fisher ScientificTEM 替代方案 1
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4Thermo Fisher ScientificTEM 替代方案 2
THUNDER Imager  EM Cryo CLEMThermo Fisher ScientificFLM 替代方案 3
Vitrobot Mark IVThermo Fisher Scientific也可使用手动冲压装置
Whatman 滤纸Sigma Aldrich10311807直径 55 mm；需裁剪以适配 Vitrobot

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