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方法文章

用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

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DOI：

10.3791/62889

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2021年8月13日

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1Grup d’Enginyeria de Materials (Gemat), Institut Químic de Sarrià (IQS), Universitat Ramon Llull (URL)

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外 还描述了必要的表征方法，并增加了关于免疫接种的概念验证。

摘要

疫苗接种是现代社会最重大的成功之一，在控制和预防疾病方面不可或缺。传统疫苗由完整或部分病原体组成。然而，挑战依然存在，开发新型疫苗技术势在必行。在此背景下，用于免疫目的的mRNA技术已展现出更优的性能，这一点已由两种预防SARS-CoV-2感染的mRNA疫苗快速获批所证实。除在预防病毒感染方面取得成功外，mRNA疫苗还可用于癌症的治疗性应用。

然而，由于核酸酶的存在，mRNA在体内不稳定且被迅速清除，导致其无法以裸露形式进行递送。在此背景下，纳米药物，特别是聚合物纳米颗粒，成为关键的mRNA递送系统。因此，本文旨在描述一种基于专有聚合物纳米颗粒的mRNA疫苗候选物的制备与检测方案。本文将讨论所用聚（β-氨基酯）聚合物的合成与化学表征、其与mRNA复合形成纳米颗粒的过程，以及其冻干方法。这一步骤对于降低储存与运输成本至关重要。最后，还将介绍用于验证其递送能力所需的各项检测 体外 转染并成熟模型树突状细胞的步骤将被标明。由于该方案具有高度通用性，可使这些疫苗用于预防或治疗多种疾病，因此将惠及疫苗研究领域的科学界。

引言

传染病对全球数百万人构成了严重威胁，至今仍是部分发展中国家的主要死亡原因之一。预防性疫苗接种是现代社会预防和控制传染病最有效的干预措施之一1,220 年科学领域的这些关键里程碑th-世纪的相关性已因近期由SARS-CoV-2病毒引发的全球新冠肺炎大流行而受到关注3认识到高效疫苗对遏制疾病传播的重要性，整个生物医学界的通力合作在不到一年的时间内成功推动了多种预防性疫苗上市4.

传统上，疫苗由减毒（具有活性但毒力降低）或灭活（无生命活性的病毒颗粒）的病毒组成。然而，对于一些不容许安全误差的疾病，使用病毒颗粒并不可行，此时则采用蛋白质亚单位。尽管如此，亚单位通常难以整合多个表位/抗原，且需要佐剂来增强疫苗的免疫效力5,6。因此，开发新型疫苗类型的需求显而易见。

正如当前大流行所展示的，基于核酸的新型疫苗候选物在避免漫长研发过程、提供高度通用性的同时，还能实现有效的患者免疫接种，具有显著优势。mRNA疫苗即为一例，其最初被设计为实验性癌症疫苗。这得益于mRNA能够自然地诱导抗原特异性T细胞反应3,5,6,7。由于mRNA是编码抗原蛋白的分子，仅需更换其序列，即可快速改造疫苗以针对同一微生物的不同变异株、不同菌株、其他病原微生物，甚至转化为癌症免疫治疗手段。此外，mRNA疫苗在大规模生产成本方面也具有优势。然而，mRNA存在一个显著障碍，限制了其裸露给药的应用：在富含核酸酶的生理环境中，其稳定性和完整性易受破坏。因此，需要采用一种纳米级载体来保护mRNA，并将其递送至抗原呈递细胞2,8。

在此背景下，聚（β-氨基酯）（pBAE）是一类具有生物相容性和可生物降解性的聚合物，因其带正电荷，能够高效地将mRNA包裹成纳米级颗粒9,10,11。这类聚合物含有酯键，可在生理条件下被酯酶轻易降解。在众多pBAE候选材料中，末端修饰有阳离子寡肽的pBAE表现出更强的能力，可形成较小的纳米颗粒，通过内吞作用高效穿透细胞膜并转染所包载的基因物质。此外，由于其具备缓冲能力，内体酸化过程可促进内体逃逸12,13。具体而言，一种特定类型的pBAE，其主链上含有疏水性基团（即所谓的C6 pBAE），以增强其稳定性，并结合末端寡肽（60%的聚合物修饰为三赖氨酸，40%修饰为三组氨酸），该体系在肠外给药后可选择性地转染抗原呈递细胞，诱导mRNA编码抗原的呈递，进而实现小鼠免疫，相关研究已近期发表14。此外，已有研究证实，此类制剂能够克服纳米医学制剂中的一个主要瓶颈步骤：可在不损失其功能活性的前提下进行冷冻干燥，从而实现在温和干燥环境下的长期稳定储存15。

在此背景下，本方案的目的是向科学界提供mRNA纳米颗粒的制备方法，通过描述该方案中的关键步骤，推动高效疫苗的生产，以用于传染病预防和肿瘤治疗的应用。

以下方案描述了合成寡肽末端修饰的聚（β-氨基酯）——OM-pBAE 聚合物的完整操作流程，该聚合物将用于后续的纳米颗粒制备。本方案中也包含了纳米颗粒的配方制备步骤。此外，还提供了确保实验成功的关键步骤及典型结果，以保证所获得的制剂能够满足必要的质量控制表征要求，从而判断结果为阳性或阴性。本方案的概要见图1。

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方案

1. 带末端寡肽的 pBAE 聚合物（OM-pBAE）的合成

  1. 聚合 C6-pBAE
    1. 将 5-氨基-1-戊醇（38 mmol；MW = 103.16 Da）和 1-己胺（38 mmol；MW = 101.19 Da）加入圆底玻璃烧瓶（100 mL）中，然后加入 1,4-丁二醇二丙烯酸酯（82 mmol；MW = 198.22 Da）。
    2. 将硅油浴预热至 90 °C，将圆底烧瓶置于油浴中，并借助磁力搅拌子搅拌混合物过夜（约 18 小时）。然后将产物从圆底烧瓶中取出，并在 -20 °C 冰箱中冷冻。
      注：产物呈粘稠粉末状，需借助刮刀从烧瓶中取出。必须通过 1H-NMR 验证所得聚合物的结构。NMR 谱图使用 400 MHz 仪器（见材料表）记录，以氘代氯仿和 D2O 作为溶剂。取约 10 mg 每种聚(β-氨基酯)样品，溶解于 1 mL 氘代溶剂中。
  2. 与肽反应制备 OM-pBAE
    1. 将 25 mL 0.1 M HCl 加入选定的肽（例如含三氟乙酸（TFA，200 mg）的肽 Cys-His-His-His）中，加入预先称重的可耐受冻干的 50 mL 离心管中，手动搅拌过夜，得到澄清溶液。
    2. 将溶液在 -80 °C 冷冻 1 小时，随后冻干得到肽盐酸盐。
      注：检查最终重量是否与理论值相符。
    3. 将 C6-pBAE（0.031 mmol）溶于二甲基亚砜中配成溶液。同时将肽盐酸盐（0.078 mmol）溶于二甲基亚砜中配成溶液。
    4. 将两种溶液混合于螺口管中并拧紧盖子。在 25 °C 恒温水浴中，使用磁力搅拌子搅拌混合溶液 20 小时。
    5. 将混合物加入 7:3（v/v）乙醚/丙酮中。将所得悬浮液在 4 °C 下以 25,000 × g 离心以去除溶剂。随后用 7:3（v/v）乙醚/丙酮洗涤沉淀两次。然后在真空（<0.2 atm）下干燥产物。
    6. 将产物配制成 100 mg/mL 的二甲基亚砜溶液。所得产物命名为 C6-肽-pBAE。必须通过 1H-NMR 验证所得聚合物的结构，以确认与末端丙烯酸酯相关的烯烃信号消失。若不立即使用，可将聚合物在 -20 °C 冷冻保存。

2. 聚合物复合物的形成

注意：所有操作均应在控温室内进行，以保持恒定温度。

  1. 解冻聚合物 C6-肽-pBAE 并涡旋溶液。
  2. 反复吹打混合聚合物，制备 12.5 mM（V1）的醋酸钠（NaAc）溶液，然后涡旋混合物并静置 10 分钟。
  3. 制备浓度为 0.5 mg/mL 的 mRNA 溶液，并通过吹打混匀（V2）。
    注意：必须避免对 mRNA 进行涡旋。
  4. 将聚合物混合物在最终浓度下涡旋，以实现 DMSO 中的聚合物储备液与醋酸盐缓冲液之间的均匀混合。
    注意：最终聚合物浓度取决于所选的 N/P（氮/磷酸基团）比值。该 N/P 比值因所使用的特定 mRNA 而异。例如，在 eGFP 包封中，如先前报道14，采用 25:1 的比值。
  5. 将遗传物质溶液与 C6-肽-pBAE 溶液（mRNA 浓度的 25 倍）按 1:1 的比例（Vi = V1 + V2）混合。
    注意：将 C6-肽-pBAE 置于微量离心管中，通过上下吹打加入 mRNA 进行混合。一旦配制完成，聚复合物、核酸和 C6-肽-pBAE 的浓度均被稀释至原来的一半。
  6. 在 25 °C 的金属浴中孵育 30 分钟。通过将样品加入预先装有 RNase-free 水的微量离心管中，按 1:2 的比例沉淀。
  7. 加入辅料。用移液枪上下吹打，加入与 mRNA 和 pBAE 混合物体积（Vi）相等的 20 mM HEPES 和 4% 蔗糖溶液。此时，样品已被稀释 3 倍。

3. 聚合物复合物的冻干

  1. 将前述聚集体溶液立即置于 -80 °C 冰箱中冷冻 1 小时。
  2. 按以下步骤进行初次干燥：(1) -60 °C、0.001 hPa 条件下 1 小时；(2) -40 °C、0.0001 hPa 条件下 1 小时；(3) -20 °C、0.0001 hPa 条件下 4 小时；(4) 5 °C、0.0001 hPa 条件下 12 小时。
  3. 立即于 -20 °C 保存，以避免使用前重新吸水。

4. 聚合物复合物重悬

注意：本方案描述了用于重建冻干 C6-多肽-pBAE 纳米颗粒的流程，以便后续用于表征或进一步应用。 体外 或 体内 分析。

  1. 在使用时，立即从 -20 °C 取出冻干的纳米颗粒，并迅速加入相应体积的去热原（DEPC）水，以重新分散固体，达到所需浓度。
    注意：若需保持原有浓度，则加入的体积应与纳米颗粒初始体积相同，但具体体积将根据每个实验的具体要求进行标注。
  2. 轻柔吹打至完全重悬，吹打过程中确保液体始终跟随移液枪头移动。
    注意：确保小瓶内壁无残留物质。
  3. 溶解后，剧烈上下吹打，避免产生气泡。
    注意：样品应呈现透明至半透明状态，浓度越高该特征越明显。
  4. 样品重悬后应置于冰上或 4 °C 保存，最长不超过 24 小时。避免再次冷冻。

5. 聚合物复合物的表征

  1. 动态光散射
    注意：纳米颗粒的流体动力学直径（nm）、多分散系数（PDI）以及表面电荷在以下条件下测定： 25 °C，633 nm 激光波长，以及 173° 信号检测器，使用Zeta电位分析仪（参见 材料表).
    1. 水动力直径（nm）
      1. 通过移液将基因材料充分混入聚合物组分中，制备纳米颗粒，使mRNA终浓度为0.25 mg/mL，具体操作如上文所述（步骤2）。
      2. 用过滤的稀释培养基预冲洗微量比色皿，以彻底清除其中的杂质。然后，向比色皿中加入至少 50 µL 样品溶液并盖上盖子。接着，将样品放入动态光散射（DLS）仪器中，确保样品池已正确插入。
        注意：稀释培养基需使用过滤器过滤 0.22 µm 注射器滤器
      3. 打开 标准操作程序 （标准操作程序）文件的创建并引入所需内容 样本名称. 选择 尺寸测量.
        注意：用于创建尺寸测量标准操作程序的所有参数均在下文提供 表1.
      4. 单击以使用动态光散射（DLS）运行粒径测量 播放.
        注意：三声蜂鸣音响起后，分析完成。
      5. 选择测量表中与样品对应的结果，以获得平均粒径、平均多分散系数（PDI）、标准偏差及图形。完成后，从DLS设备中取出样品池。
      6. 取出样品并保留用于zeta电位分析，用去离子水清洗并冲洗样品池。最后，在压缩空气气流下将清洗后的比色皿吹干。
    2. 表面电荷（mV）
      1. 通过移液将基因材料充分混入聚合物组分中，制备纳米颗粒，使mRNA终浓度为0.25 mg/mL（如上文步骤2“聚复合物形成”所述）。随后，将溶液冷冻并干燥。
        注意：在此情况下，为测量表面电荷，强烈建议在测量前先将样品进行冷冻干燥，然后在适当的缓冲液中重新分散样品，以模拟体液的pH值和电解质浓度条件。
      2. 用去离子水重悬冻干样品。用去离子水将样品稀释至1/10（终浓度为0.025 mg/mL）。
      3. 预冲洗一次性折叠毛细管池（Zeta电位比色皿），使用过滤后的稀释液彻底清除杂质。然后，用1 mL注射器将稀释后的纳米颗粒填充至比色皿中，并封闭两侧填充口。
        注意：纳米颗粒分散液必须填满比色皿中的可用体积（约1 mL），并需特别注意避免气泡产生，以免干扰测量。
      4. 将样品加入DLS中；确保样品池正确插入。
      5. 打开为zeta电位分析创建的标准操作程序（SOP）文件，并输入所需的参数 样本名称选择 Zeta电位测量.
        注：用于建立zeta电位测量标准操作程序的参数如下所示 表2.
      6. 通过点击 DLS 进行 zeta 电位测量 播放.
        注意：三声蜂鸣音后，分析完成。
      7. 在测量表中选择与样品对应的结果，以获得平均Zeta电位、标准偏差及图形。完成后，从DLS设备中取出样品池。
      8. 取出样品，如有需要可予以保留。随后，依次用去离子水、乙醇和水清洗比色皿，最后用压缩空气吹干已清洗的比色皿。
        注意：为分析数据，请使用推荐的软件。
  2. 纳米颗粒追踪分析（NTA）
    注意：纳米颗粒的流体动力学直径（nm）和浓度在以下条件下测定 25 °C，使用纳米颗粒跟踪分析仪，采用488 nm激光波长（参见 材料清单).
    1. NTA 与样品制备
      1. 打开计算机和设备。首先，检查所有组件是否均已正确连接。然后，启动推荐的软件。该软件将检测所有配件是否已正确连接。
      2. 将顶板（即 O 形圈细胞）连接到激光模块中。
        注意：请勿过度拧紧此部件。
      3. 首先使用1 mL注射器将缓冲液和/或去离子水加入腔室中。重复此操作至少两次。避免在腔室中引入气泡。
      4. 通过将用于DLS粒径测量的样品浓度用去离子水稀释1/1000来制备样品。至少准备1 mL，并将其装入1 mL注射器中，避免引入气泡。
      5. 使用注射器将样品注入腔室。然后，将激光模块插入NTA大腔室。
        注意：大室指用于测量时放置室的空间。
    2. 图像优化
      1. 首先，在 硬件，检查是否 相机 并选择适当的激光器。
        注意：此处仅有一个相机和488 nm蓝色激光。
      2. 从相机高度为0开始，然后按下 启动相机 在捕获窗口上。
        注意：此时调整以下参数。 光束位置 （可在屏幕上上下移动）。 相机水平：避免像素过饱和。 焦点（横向轮）：尽量实现最佳聚焦效果。相比未聚焦的颗粒，宁可存在带有光晕的颗粒。浓度：调整浓度，使每个视野内有10到100个颗粒。
    3. 视频记录
      1. 在软件中，转到 测量选择- SOP 窗口（左下方）并选择 标准测量.
        注意：设置程序以执行三次测量，每次30秒（以便软件进行平均值和标准差计算）。在“基础文件名”中提供名称及保存样本记录的文件夹路径。当标准操作程序（SOP）参数正确设置后，按下 创建 和 运行脚本第一次重复测量完成后，程序将提示添加新样品。然后，通过推动注射器的推杆，将样品的另一部分注入检测室。最后，重复操作第三次，以分析第三个重复样本。
    4. 视频处理
      1. 重新调整 屏幕增益 和 检测阈值 当完成这三项测量以分析所测颗粒时，此时每帧中应出现约100个颗粒以进行分析（预期出现较多的红色十字和较少的蓝色十字）。
      2. 分析完成后，可将结果导出为 PDF 文件。此外，还支持导出为视频和 Excel 文件。
    5. 清洗NTA
      注意：在分析下一个样本前，须关闭所有已打开的测量文件；由于生成的文件体积庞大，且受限于计算机性能，难以同时维持多个文件打开状态。
      1. 在进行后续测量前，通过反复冲洗水来清洁NTA样品室，直至观察不到任何颗粒；随后用所使用的缓冲液（PBS）冲洗，以继续进行测量。
      2. 每天最后一次测量完成后，排出腔室内的空气，并用显微镜级纸巾将其干燥。
      3. 通过透射电子显微镜（TEM）表征样品的尺寸和形貌。制备样品。 30 µL 最终体积的样品足以用于透射电子显微镜表征。
        注意：新鲜的和冻干后重悬的纳米颗粒均可进行测量。
      4. 滴加 10 µL 将样品滴加到碳支持膜铜网上，静置干燥10分钟。如有必要，用滤纸轻轻蘸去多余液体。
      5. 滴加 10 µL 用醋酸铀酰（2% w/v）溶液进行负染色，静置干燥1分钟。必要时用滤纸轻轻蘸去多余液体。
      6. 将样品放入显微镜中，在80 kV电压下进行扫描。
        注：可使用适当的软件对图像进行进一步分析。
  3. 包封效率
    1. 样品制备
      1. 将纳米颗粒配制为所需浓度并进行冷冻干燥。然后重新悬浮纳米颗粒，并稀释至最终浓度 6 µg/mL.
      2. 从20x贮存液配制1x TE缓冲液。
        注意：Vt（总体积）=（样本数 × 100 µL 样本数 × 4）（样本数 × 290 µL) + 2 mL。
      3. 用 TE 缓冲液配制 3 µg/µL 肝素原液中的 100 µg/µL.
        注意：Vt = 样本数 × 50 µL × 2.
      4. 制备标准品
      5. 制备一个RNA标准品，范围从 0.2 µg/mL 至 0.025 µg/mL 在1x Tris-EDTA（TE）缓冲液中（表 S1A).
        注意：若RNA标准品中的mRNA与核糖体RNA不同，则应使用mRNA。
      6. 使用肝素制备RNA:pBAE标准品（表 S1B）。配制肝素标准品（表 S1C).
      7. 按下述方法准备一个96孔板。
        1. 加载 295 µL 在96孔板的第一列中加入TE缓冲液（待分析样本数量对应的孔数）。然后，上样 50 µL 将1×TE缓冲液加入B和C泳道（每个样本设两个重复）。
        2. 加载 50 µL 1× TBE 缓冲液 3 µg/µL 将肝素加入 D 和 E 泳道（每个样本设两个重复）。接下来，上样 100 µL 每种标准品在 F、G 和 H 泳道中的重复样（每种标准品设两个重复）。
        3. 加载 5 µL 每份样品在泳道A中的浓度（每个孔中的浓度为 0.1 µg/mL）。用移液器充分混匀后上样 50 µL 每个样本在下方四个孔中的分布（其中两个孔含有 50 µL 1× TE 缓冲液和另外两个含有 1× TE 缓冲液的 3 µg/µL 肝素的
      8. 在30分钟内孵育样品 37 °C. 按照生产商说明书配制RiboGreen试剂（参见 材料表) 置于1x TE缓冲液中。
        注意：按1:200比例稀释并涡旋混匀。避光保存。Vt = 完整孔数 × 100 µL.
      9. 加载 100 µL 向每个孔中加入 RiboGreen 溶液。使用酶标仪在激发波长 500 nm、发射波长 525 nm 的条件下检测荧光。
    2. 结果分析
      1. 制备三条标准曲线
        注意：首先，核糖体RNA标准品。在该标准曲线中插值不含肝素的样品。其次，mRNA:pBAE与肝素复合物。在该标准曲线中插值含肝素的样品。第三，肝素。用于确认工作浓度处于线性范围内。
      2. 按以下方法计算包封率（EE%）：
        mRNA 包封效率计算公式，EE% = (1 - (游离 mRNA / 总 mRNA)) × 100，公式。

6. 体外 表征

  1. 荧光显微镜用于定性评估
    1. 转染24小时后，将96孔板置于显微镜下，使用10倍物镜开始观察细胞。
      注意：本实验使用HeLa细胞。通过透射模式（明场）定位细胞，并在此时调整焦距。
      1. 首先进行白平衡校正，以便软件参考样品背景。然后获取图像，用于在分析过程中与荧光图像叠加。
    2. 将显微镜模式切换至反射模式（荧光），并将滤光轮移至蓝色激光（488 nm）以观察eGFP。
      注意：此时必须调整曝光时间和增益。增益应调整在3至5之间，以避免伪影和背景信号过强。曝光时间的调整取决于转染效率（从毫秒到1秒不等）。
    3. 对所有实验条件或孔使用相同的曝光时间采集图像，以便比较所有样品。
  2. 流式细胞术（FC）用于定量评估
    1. 使用多通道移液器为流式细胞术实验准备96孔板。
      注意：处理半贴壁细胞（如JAWSII细胞系）时，回收全部培养基并转移至另一个96孔板中。请勿弃去该培养基，因其可能含有大量转染细胞。
    2. 用100 µL/孔的1×PBS清洗细胞（此处使用HeLa细胞），吸除PBS。随后每孔加入25 µL胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。
    3. 待细胞脱落后，加入先前回收的培养基以终止胰蛋白酶作用，并加入10%甲醛溶液31.25 µL/孔，固定20分钟（终浓度为2.5%）。
      注意：此时必须通过显微镜观察细胞状态，确认细胞已完全脱落。建议反复吹打数次，以促进细胞脱落并防止聚集，从而获得可靠结果。
    4. 开启流式细胞仪及配套软件。在软件中设置实验所需参数（如板类型、样品体积，以及样品间震荡、冲洗等其他参数）。
      注意：在步骤6.2.5中，流速应设为120 µL/min。每1分钟混合1个循环，每1个样品冲洗1个循环。混合对于保持细胞在液体中的均匀分散至关重要，有助于更准确地分析单个细胞；同时，样品间冲洗可清除细胞仪微流控系统中的残留物。最后，检查缓冲液是否充足，所有组件是否正确连接。
    5. 设置合适的参数以定量分析转染阳性细胞的比例。
      1. 首先，在前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）散点图上查看流式数据，以区分细胞与碎片。然后绘制另一个散点图，比较前向散射光的面积（FSC-A）与高度（FSC-H），用于设门并识别单个细胞。
        ​注意：未处理样本可用于设门，确定对应转染阳性细胞的群体。随后在直方图的适当通道中对转染阳性细胞进行定量分析。因此，转染阳性细胞在直方图中应表现为连续的事件分布。

7. 体外 功能测试：利用卵清蛋白（OVA）作为抗原模型mRNA，检测激活模拟免疫细胞的能力

  1. 转染前一天，在96孔板中每孔接种10,000个细胞（此处使用JAWSII细胞）。
    注意：根据实验条件所需，接种足够数量的孔以确保每个条件设三个重复。让细胞贴壁至少12小时（建议过夜培养）。
  2. 按照下方注意事项中的方法制备pBAEs纳米颗粒（NPs），用于每孔转染0.6 µg mRNA。
    注意：作为阳性对照，使用转染试剂进行细胞转染。此处，每孔使用0.1 µg mRNA和0.25 µL转染试剂。编码OVA的mRNA购自供应商（见材料表）。该mRNA经过多聚腺苷酸化修饰，采用5-甲氧基尿苷修饰，并针对哺乳动物系统进行了优化，且通过Cap1结构进行末端加帽，此为供应商的专有技术。
  3. 将96孔板置于37 °C、5% CO2的干燥空气培养箱中培养24小时。
    注意：培养结束后，不要吸除培养基，因其可能含有部分细胞。回收培养基并将其保存至另一孔或培养板中备用。
  4. 用25 µL 1x PBS洗涤孔中残留的细胞，随后吸除PBS，加入25 µL胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟以使细胞脱落。将先前回收的培养基加入对应孔中以终止胰蛋白酶反应。
  5. 在4 °C下以400 x g离心5分钟。吸除上清液，每孔加入50 µL 1x PBS和2.5%甲醛，于4 °C孵育20分钟以固定细胞。
  6. 重复步骤7.5和7.5.1。然后每孔加入50 µL 1x PBS和3% BSA（封闭缓冲液），于4 °C孵育30分钟。再次重复步骤7.5和7.5.1，随后每孔加入50 µL用1x PBS和3% BSA稀释的一抗（小鼠抗OVA抗体），于4 °C孵育30分钟。
  7. 重复步骤7.5和7.5.1，然后用每孔50 µL 1x PBS洗涤细胞。吸除上清液后，加入用1x PBS和3% BSA稀释的二抗溶液（抗小鼠AlexaFluor488/PerCP和Cy5.5-CD11b/APC-CD86），于4 °C孵育1小时。
  8. 在400 x g下离心5分钟。随后用每孔50 µL 1x PBS洗涤细胞。接着再次离心（400 x g，5分钟），吸除上清液，将细胞重悬于每孔100 µL 1x PBS和2.5%甲醛中。
  9. 按照上述方法（步骤6.2）进行流式细胞术分析。

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结果

聚合物的合成与表征
OM-pBAE 的合成步骤见图2。如图2A所示，获得 OM-pBAE 的第一步是通过将胺类（1-己胺和5-氨基-1-戊醇，比例为1:1）加入二丙烯酸酯（1,4-丁二醇二丙烯酸酯）中合成 C6-pBAE。该反应在90 °C下持续搅拌反应20小时。随后，将寡肽溶液加入上一步反应所得的 C6 聚合物溶液中（图2B）。最后，在25 °C下以 DMSO 作为溶剂，持续搅拌反应20小时完成合成。图2C展示了 OM-pBAE 的结构，即聚合反应的最终产物。所得聚合物通过1H-NMR 进行表征（见补充图S2）。在表征中，阳性结果是指含有7–10个单体单元（图中表示为 n + m），且两种单体单元各约占一半；而在此范围之外的任何其他数值均为阴性结果。

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讨论

去年新冠疫情暴发后，疫苗在传染病防控中的重要性凸显，成为关键组成部分8。全球科学家的努力使得多种疫苗得以推向市场。历史上首次，mRNA疫苗因其能够在数月内快速设计并适应任何新抗原的特性，实现了此前假说所预期的成功5,6,21。mRNA（信使核糖核酸）是指将DNA中编码信息用于驱动蛋白质合成的核酸分子。在此用于疫苗接种时，mRNA编码来自致病微生物的抗原蛋白（或在治疗性肿瘤疫苗中编码肿瘤抗原）8,22。因此，科学界亟需明确的mRNA疫苗合成方案。

基于这一设想，本文旨在描述一种利用专有聚合物纳米颗粒合成mRNA疫苗的简便方法24。如实验方案部分所述，首先通过两步法合成聚合物：第一步基于伯胺...

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披露

作者无任何披露事项，也无任何利益冲突。

致谢

感谢MINECO/FEDER（项目号：SAF2015-64927-C2-2-R、RTI2018-094734-B-C22 和 COV20/01100）提供的经费支持。CGF感谢IQS博士奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-丁二醇二丙烯酸酯Sigma Aldrich123048
1-己胺Sigma Aldrich219703
5-氨基-1-戊醇Sigma Aldrich411744
丙酮Panreac141007
CD11b 抗体BD550993
CD86 抗体Bioligend105007
氯化羟胺Panreac181023
氘代氯仿Sigma Aldrich151823
Cys-His-His-His 肽OntoresCustom
Cys-Lys-Lys-Lys 肽OntoresCustom
D2OSigma Aldrich151882
DEPC 试剂（用于制备无 RNase 水）Sigma AldrichD5758该试剂用于处理 MilliQ 水以去除缓冲液中的任何 RNase
乙醚Panreac212770
二甲基亚砜Sigma Aldrich276855
HEPESSigma AldrichH3375
EGFP mRNATriLink TechnologiesL-7601
OVA mRNATriLink TechnologiesL-7610
RiboGreen 试剂盒ThermoFisherR11490
乙酸钠Sigma Aldrich71196
蔗糖Sigma AldrichS0389
三氟乙酸Sigma Aldrich302031
胰蛋白酶-EDTAFisher Scientific11570626
α-小鼠 AlexaFluor488 抗体AbcamAb450105
仪器
纳米颗粒追踪分析仪Malvern PanalyticalNanoSight NS300
核磁共振波谱仪Varian400 MHz
ZetaSizerMalvern PanalyticalNano ZS用于测定 ζ 电位和流体动力学尺寸
软件
NanoSight NTA 软件Malvern PanalyticalMAN0515-02-EN-00
NovoExpress 软件Agilent未指定
ZetaSizer 软件Malvern PanalyticalDTS Application用于分析表面电荷和流体动力学尺寸

参考文献

  1. Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
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用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征
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