用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

摘要

本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外 还描述了必要的表征方法，并增加了关于免疫接种的概念验证。

摘要

疫苗接种是现代社会最重大的成功之一，在控制和预防疾病方面不可或缺。传统疫苗由完整或部分病原体组成。然而，挑战依然存在，开发新型疫苗技术势在必行。在此背景下，用于免疫目的的mRNA技术已展现出更优的性能，这一点已由两种预防SARS-CoV-2感染的mRNA疫苗快速获批所证实。除在预防病毒感染方面取得成功外，mRNA疫苗还可用于癌症的治疗性应用。

然而，由于核酸酶的存在，mRNA在体内不稳定且被迅速清除，导致其无法以裸露形式进行递送。在此背景下，纳米药物，特别是聚合物纳米颗粒，成为关键的mRNA递送系统。因此，本文旨在描述一种基于专有聚合物纳米颗粒的mRNA疫苗候选物的制备与检测方案。本文将讨论所用聚（β-氨基酯）聚合物的合成与化学表征、其与mRNA复合形成纳米颗粒的过程，以及其冻干方法。这一步骤对于降低储存与运输成本至关重要。最后，还将介绍用于验证其递送能力所需的各项检测 体外 转染并成熟模型树突状细胞的步骤将被标明。由于该方案具有高度通用性，可使这些疫苗用于预防或治疗多种疾病，因此将惠及疫苗研究领域的科学界。

引言

传染病对全球数百万人构成了严重威胁，至今仍是部分发展中国家的主要死亡原因之一。预防性疫苗接种是现代社会预防和控制传染病最有效的干预措施之一^1,220 年科学领域的这些关键里程碑^th-世纪的相关性已因近期由SARS-CoV-2病毒引发的全球新冠肺炎大流行而受到关注³认识到高效疫苗对遏制疾病传播的重要性，整个生物医学界的通力合作在不到一年的时间内成功推动了多种预防性疫苗上市⁴.

传统上，疫苗由减毒（具有活性但毒力降低）或灭活（无生命活性的病毒颗粒）的病毒组成。然而，对于一些不容许安全误差的疾病，使用病毒颗粒并不可行，此时则采用蛋白质亚单位。尽管如此，亚单位通常难以整合多个表位/抗原，且需要佐剂来增强疫苗的免疫效力^5,6。因此，开发新型疫苗类型的需求显而易见。

正如当前大流行所展示的，基于核酸的新型疫苗候选物在避免漫长研发过程、提供高度通用性的同时，还能实现有效的患者免疫接种，具有显著优势。mRNA疫苗即为一例，其最初被设计为实验性癌症疫苗。这得益于mRNA能够自然地诱导抗原特异....

方案

1. 带末端寡肽的 pBAE 聚合物（OM-pBAE）的合成

1. 聚合 C6-pBAE
   1. 将 5-氨基-1-戊醇（38 mmol；MW = 103.16 Da）和 1-己胺（38 mmol；MW = 101.19 Da）加入圆底玻璃烧瓶（100 mL）中，然后加入 1,4-丁二醇二丙烯酸酯（82 mmol；MW = 198.22 Da）。
   2. 将硅油浴预热至 90 °C，将圆底烧瓶置于油浴中，并借助磁力搅拌子搅拌混合物过夜（约 18 小时）。然后将产物从圆底烧瓶中取出，并在 -20 °C 冰箱中冷冻。
      注：产物呈粘稠粉末状，需借助刮刀从烧瓶中取出。必须通过 ¹H-NMR 验证所得聚合物的结构。NMR 谱图使用 400 MHz 仪器（见材料表）记录，以氘代氯仿和 D₂O 作为溶剂。取约 10 mg 每种聚(β-氨基酯)样品，溶解于 1 mL 氘代溶剂中。
2. 与肽反应制备 OM-pBAE
   1. 将 25 mL 0.1 M HCl 加入选定的肽（例如含三氟乙酸（TFA，200 mg）的肽 Cys-His-His-His）中，加入预先称重的可耐受冻干的 50 mL 离心管中，手动搅拌过夜，得到澄清溶液。
   2. 将溶液在 -80 °C 冷冻 1 小时，随后冻干得到肽盐酸盐。
      注：检查最终重量是否与理论值....

结果

聚合物的合成与表征
OM-pBAE 的合成步骤见图2。如图2A所示，获得 OM-pBAE 的第一步是通过将胺类（1-己胺和5-氨基-1-戊醇，比例为1:1）加入二丙烯酸酯（1,4-丁二醇二丙烯酸酯）中合成 C6-pBAE。该反应在90 °C下持续搅拌反应20小时。随后，将寡肽溶液加入上一步反应所得的 C6 聚合物溶液中（图2B）。最后，在25 °C下以 DMSO 作为溶剂，持续搅拌反应20小时完成合成。图2C展示了 OM-pBAE 的结构，即聚合反应的最终产物。所得聚合物通过¹H-NMR 进行表征（见补充图S2）。在表征中，阳性结果是指含有7–10个单体单元（图中表示为 n + m），且两种单体单元各约占一半；而在此范围之外的任何其他数值均为阴性结果。

讨论

去年新冠疫情暴发后，疫苗在传染病防控中的重要性凸显，成为关键组成部分⁸。全球科学家的努力使得多种疫苗得以推向市场。历史上首次，mRNA疫苗因其能够在数月内快速设计并适应任何新抗原的特性，实现了此前假说所预期的成功^5,6,21。mRNA（信使核糖核酸）是指将DNA中编码信息用于驱动蛋白质合成的核酸分子。在此用于疫苗接种时，mRNA编码来自致病微生物的抗原蛋白（或在治疗性肿瘤疫苗中编码肿瘤抗原）^8,22。因此，科学界亟需明确的mRNA疫苗合成方案。

基于这一设想，本文旨在描述一种利用专有聚合物纳米颗粒合成mRNA疫苗的简便方法²⁴。如实验方案部分所述，首先通过两步法合成聚合物：第一步基于伯胺.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,4-丁二醇二丙烯酸酯	Sigma Aldrich	123048
1-己胺	Sigma Aldrich	219703
5-氨基-1-戊醇	Sigma Aldrich	411744
丙酮	Panreac	141007
CD11b 抗体	BD	550993
CD86 抗体	Bioligend	105007
氯化羟胺	Panreac	181023
氘代氯仿	Sigma Aldrich	151823
Cys-His-His-His 肽	Ontores	Custom
Cys-Lys-Lys-Lys 肽	Ontores	Custom
D2O	Sigma Aldrich	151882
DEPC 试剂（用于制备无 RNase 水）	Sigma Aldrich	D5758	该试剂用于处理 MilliQ 水以去除缓冲液中的任何 RNase
乙醚	Panreac	212770
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	276855
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
EGFP mRNA	TriLink Technologies	L-7601
OVA mRNA	TriLink Technologies	L-7610
RiboGreen 试剂盒	ThermoFisher	R11490
乙酸钠	Sigma Aldrich	71196
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389
三氟乙酸	Sigma Aldrich	302031
胰蛋白酶-EDTA	Fisher Scientific	11570626
α-小鼠 AlexaFluor488 抗体	Abcam	Ab450105
仪器
纳米颗粒追踪分析仪	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
核磁共振波谱仪	Varian	400 MHz
ZetaSizer	Malvern Panalytical	Nano ZS	用于测定 ζ 电位和流体动力学尺寸
软件
NanoSight NTA 软件	Malvern Panalytical	MAN0515-02-EN-00
NovoExpress 软件	Agilent	未指定
ZetaSizer 软件	Malvern Panalytical	DTS Application	用于分析表面电荷和流体动力学尺寸