用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

摘要

本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外 还描述了必要的表征方法，并增加了关于免疫接种的概念验证。

摘要

疫苗接种是现代社会最重大的成功之一，在控制和预防疾病方面不可或缺。传统疫苗由完整的病原体或其组分构成。然而，挑战依然存在，开发新型疫苗技术势在必行。在此背景下，用于免疫目的的mRNA技术已展现出更优的性能，这一点已由两种预防SARS-CoV-2感染的mRNA疫苗快速获批所证实。除在预防病毒感染方面取得成功外，mRNA疫苗还可用于癌症的治疗性应用。

然而，由于核酸酶的存在，mRNA在体内不稳定且清除迅速，导致其无法以裸露形式递送。在此背景下，纳米药物，特别是聚合物纳米颗粒，成为关键的mRNA递送系统。因此，本文旨在描述基于专有聚合物纳米颗粒的mRNA疫苗候选物的制备与测试方案。本文将讨论所用聚（β-氨基酯）聚合物的合成与化学表征、其与mRNA复合形成纳米颗粒的过程以及其冻干方法。这一步骤对于降低储存与运输成本至关重要。最后，还将介绍用于验证其递送能力所需的各项测试 体外 转染并成熟化模型树突状细胞的步骤将被标明。由于该方案具有高度的通用性，可使这些疫苗用于预防或治疗多种疾病，因此将惠及从事疫苗研究的科学界。

引言

传染病对全球数百万人构成了严重威胁，至今仍是部分发展中国家的主要死亡原因之一。预防性疫苗接种是现代社会预防和控制传染病最有效的干预措施之一^1,220 年科学领域的关键里程碑^th-世纪的相关性已因近期由SARS-CoV-2病毒引发的全球新冠肺炎大流行而受到关注³认识到高效疫苗对遏制疾病传播的重要性，整个生物医学界的通力合作在不到一年的时间内成功推动了多种预防性疫苗上市⁴.

传统上，疫苗由减毒（具有活性但毒力降低）或灭活（无生命活性的病毒颗粒）的病毒组成。然而，对于一些不容许安全误差的疾病，使用病毒颗粒并不可行，此时则采用蛋白质亚单位替代。尽管如此，亚单位通常难以整合多个表位/抗原，且需要佐剂来增强疫苗的免疫效力^5,6。因此，开发新型疫苗类型的需求显而易见。

正如当前大流行所展示的，基于核酸的新型疫苗候选物在避免漫长的研发过程、提供高度通用性的同时，还能实现有效的患者免疫接种，具有显著优势。mRNA疫苗即为一例，其最初被设计为实验性癌症疫苗。这得益于mRNA能够自然地诱导抗原特异性T细胞反应^3,5,6,7。由于mRNA是编码抗原蛋白的分子，仅需更换其序列，即可快速调整疫苗以针对同一微生物的不同变异株、不同菌株、其他病原微生物，甚至可用于癌症免疫治疗。此外，mRNA疫苗在大规模生产成本方面也具有优势。然而，mRNA存在一个重大障碍，限制了其裸露给药的应用：在富含核酸酶的生理环境中，其稳定性和完整性易受破坏。因此，需要采用一种纳米级载体来保护mRNA，并将其递送至抗原呈递细胞^2,8。

在此背景下，聚（β-氨基酯）（pBAE）是一类具有生物相容性和可生物降解性的聚合物，因其带正电荷，能够高效地将mRNA包裹成纳米级颗粒^9,10,11。这类聚合物含有酯键，可在生理条件下被酯酶轻易降解。在众多pBAE候选材料中，末端修饰有阳离子寡肽的pBAE表现出更强的能力，可形成较小的纳米颗粒，通过内吞作用高效穿透细胞膜并转染所包载的基因物质。此外，由于其具备缓冲能力，可在内体酸化过程中促进内体逃逸^12,13。具体而言，一种特定类型的pBAE，其主链上含有疏水性基团（即所谓的C6 pBAE），以增强其稳定性，并结合末端寡肽（60%的聚合物修饰为三赖氨酸，40%的聚合物修饰为三组氨酸），在肠外给药后可选择性地转染抗原呈递细胞，诱导mRNA编码抗原的呈递，进而实现小鼠免疫，该研究成果近期已有报道¹⁴。此外，已有研究证实，这些制剂能够克服纳米医学制剂中的一个主要瓶颈步骤：可在不损失其功能性的前提下进行冷冻干燥，从而实现常温干燥环境下的长期稳定储存¹⁵。

在此背景下，本方案的目的是向科学界提供mRNA纳米颗粒的制备方法，通过描述该方案中的关键步骤，推动高效疫苗的生产，以用于传染病预防和肿瘤治疗的应用。

以下方案描述了合成寡肽末端修饰的聚（β-氨基酯）——OM-pBAE 聚合物的完整操作流程，该聚合物将用于后续的纳米颗粒制备。本方案中也包含了纳米颗粒的配方制备步骤。此外，还提供了确保实验成功的关键步骤及典型结果，以保证所获得的制剂能够满足必要的质量控制表征要求，从而判断结果为阳性或阴性。本方案的概要见图1。

方案

1. 带末端寡肽的 pBAE 聚合物（OM-pBAE）的合成

1. 聚合 C6-pBAE
   1. 将5-氨基-1-戊醇（38 mmol；分子量 = 103.16 Da）和1-己胺（38 mmol；分子量 = 101.19 Da）加入圆底玻璃烧瓶（100 mL）中。然后加入1,4-丁二醇二丙烯酸酯（82 mmol；分子量 = 198.22 Da）。
   2. 将硅油浴预热至90 °C，将圆底烧瓶置于油浴中，并借助磁力搅拌子搅拌混合物过夜（约18 h）。随后将产物从圆底烧瓶中取出，置于-20 °C冰箱中冷冻。
      注：产物呈粘稠粉末状，需借助刮刀从烧瓶中取出。必须通过¹H-NMR验证所得聚合物的结构。NMR谱图在400 MHz仪器（见材料表）上记录，使用氘代氯仿和D₂O作为溶剂。取约10 mg每种聚β-氨基酯，溶解于1 mL氘代溶剂中。
2. 与肽反应制备OM-pBAE
   1. 向选定的肽（例如Cys-His-His-His肽，含三氟乙酸（TFA，200 mg））中加入25 mL 0.1 M HCl，放入预先称重的50 mL离心管中（该离心管需可耐受冻干），手动搅拌过夜，以获得澄清溶液。
   2. 将溶液在-80 °C冷冻1 h，随后冻干得到肽盐酸盐。
      注：检查最终重量是否与理论值相符。
   3. 将C6-pBAE（0.031 mmol）溶于二甲基亚砜，配制成溶液。同时将肽盐酸盐（0.078 mmol）溶于二甲基亚砜，配制成另一溶液。
   4. 将两种溶液混合于螺口管中，拧紧盖子。在25 °C恒温水浴中，使用磁力搅拌子搅拌混合溶液20 h。
   5. 将混合物加入7:3（v/v）乙醚/丙酮中。在4 °C下以25,000 × g离心，去除溶剂。随后用7:3（v/v）乙醚/丙酮洗涤沉淀两次。然后在真空条件下干燥产物（<0.2 atm）。
   6. 将产物溶于二甲基亚砜，配制成100 mg/mL的溶液。所得产物命名为C6-肽-pBAE。必须通过¹H-NMR验证所得聚合物的结构，以确认末端丙烯酸酯相关的烯烃信号消失。若不立即使用，可将聚合物在-20 °C冷冻保存。

2. 聚合物复合物的形成

注意：所有操作均应在控温室内进行，以保持恒定温度。

1. 解冻聚合物 C6-肽-pBAE 并涡旋溶液。
2. 用移液器反复吹打聚合物混合物，并在醋酸钠（NaAc）中配制 12.5 mM（V₁）的溶液。然后涡旋混合物并静置 10 分钟。
3. 将 mRNA 配制成 0.5 mg/mL 的浓度，并通过移液吹打混合（V₂）。
   注意：必须避免涡旋 mRNA。
4. 将聚合物混合物在最终浓度下涡旋，以实现 DMSO 中的聚合物储备液与醋酸盐缓冲液之间的均匀混合。
   注意：最终聚合物浓度取决于所选的 N/P（氮/磷酸基团）比值。该 N/P 比值因所使用的特定 mRNA 而异。例如，在封装 eGFP 时，如先前报道¹⁴，采用 25:1 的比值。
5. 按 1:1 的比例混合遗传物质溶液与 C6-肽-pBAE 溶液（pBAE 浓度为 mRNA 浓度的 25 倍）（V_i = V₁ + V₂）。
   注意：将 C6-肽-pBAE 置于微量离心管中，再通过上下移液将 mRNA 加入并混合。一旦配制完成，聚复合物、核酸及 C6-肽-pBAE 的浓度均被稀释一半。
6. 在 25 °C 下于恒温金属块中孵育 30 分钟。通过将样品加入预先装有 RNase 自由水的微量离心管中，按 1:2 比例沉淀。
7. 加入辅料。用移液器上下吹打，加入与 mRNA 和 pBAE 混合物体积相等的 20 mM HEPES 和 4% 蔗糖溶液（V_i）。此时，样品已被稀释 3 倍。

3. 聚合物复合物的冻干

1. 将上述聚集体溶液立即置于 -80 °C 超低温冰箱中冷冻 1 小时。
2. 按以下步骤进行初次干燥：(1) -60 °C、0.001 hPa 条件下 1 小时；(2) -40 °C、0.0001 hPa 条件下 1 小时；(3) -20 °C、0.0001 hPa 条件下 4 小时；(4) 5 °C、0.0001 hPa 条件下 12 小时。
3. 立即于 -20 °C 保存，以避免使用前重新吸水。

4. 聚合物复合物重悬

注意：本方案描述了用于重建冻干 C6-肽-pBAE 纳米颗粒的步骤，以便后续进行表征或进一步使用， 体外 或 体内 分析。

1. 在使用时，立即从 -20 °C 取出冻干的纳米颗粒，并迅速加入相应体积的去热原（DEPC）水，以重新分散固体，达到所需浓度。
   注意：若需达到与初始浓度相同的浓度，则加入的体积应与纳米颗粒的初始体积相同，但具体体积将根据每个实验的具体要求进行标注。
2. 轻柔吹打至完全重悬，吹打过程中确保液体始终跟随移液枪头移动。
   注意：确保小瓶内壁无任何残留物质。
3. 溶解后，剧烈上下吹打，避免产生气泡。
   注意：样品应呈现透明至半透明状态，浓度越高该特征越明显。
4. 样品重悬后，置于冰上或 4 °C 保存，最长保存时间不超过 24 小时。避免再次冷冻。

5. 聚合物复合物的表征

1. 动态光散射
   注意：使用Zeta电位分析仪（见材料表）在25 °C、633 nm激光波长和173°信号检测器条件下测定纳米颗粒的流体动力学直径（nm）、多分散指数（PDI）和表面电荷。
   1. 流体动力学直径（nm）
      1. 通过移液将基因材料加入聚合物组分中，充分混合mRNA与pBAE以制备纳米颗粒，mRNA终浓度为0.25 mg/mL，具体操作如上文所述（步骤2）。
      2. 使用过滤后的稀释介质预冲洗微量比色皿，彻底清除杂质。然后向比色皿中加入至少50 µL样品溶液并盖上盖子。接着将样品放入DLS仪器中，确保样品池正确插入。
         注意：稀释介质需使用0.22 µm注射器滤膜过滤。
      3. 打开已创建的标准操作程序（SOP）文件，输入所需的样品名称，选择粒径测量。
         注意：用于创建粒径测量SOP的所有参数详见表1。
      4. 点击播放按钮，使用DLS运行粒径测量。
         注意：三声蜂鸣音响起后，分析完成。
      5. 在测量表中选择对应样品的结果，获取平均粒径、平均PDI、标准偏差及图形数据。完成后，从DLS设备中取出样品池。
      6. 取出样品并保留用于ζ电位分析，用去离子水清洗并冲洗样品池。最后，在压缩空气气流下干燥清洗后的比色皿。
   2. 表面电荷（mV）
      1. 通过移液将基因材料加入聚合物组分中，充分混合mRNA与pBAE以制备纳米颗粒，mRNA终浓度为0.25 mg/mL，具体操作如上文所述（步骤2，聚复合物形成）。随后，冷冻并干燥溶液。
         注意：在此情况下，为测量表面电荷，强烈建议在适当缓冲液中重新分散样品前先进行冻干处理，以模拟体内的pH值和电解质浓度条件。
      2. 使用水重悬冻干样品。将样品用水稀释10倍（终浓度为0.025 mg/mL）。
      3. 使用过滤后的稀释介质预冲洗一次性折叠毛细管细胞（ζ电位比色皿），彻底清除杂质。然后使用1 mL注射器将稀释后的纳米颗粒填充至比色皿中，并封闭两侧填充口。
         注意：纳米颗粒分散液必须填满比色皿中的可用体积（约1 mL），特别注意避免气泡形成，否则可能干扰测量。
      4. 将样品放入DLS仪器中；确保样品池正确插入。
      5. 打开为ζ电位分析创建的SOP文件，输入所需的样品名称，选择ζ电位测量。
         注意：用于创建ζ电位测量SOP的参数详见表2。
      6. 点击播放按钮，使用DLS运行ζ电位测量。
         注意：三声蜂鸣音响起后，分析完成。
      7. 在测量表中选择对应样品的结果，获取平均ζ电位、标准偏差及图形数据。完成后，从DLS设备中取出样品池。
      8. 取出样品，如有需要可保留。接着依次用去离子水、乙醇和水再次清洗并冲洗比色皿。最后，在压缩空气气流下干燥清洗后的比色皿。
         注意：数据分析时请使用推荐的软件。
2. 纳米颗粒追踪分析（NTA）
   注意：使用纳米颗粒追踪分析仪（见材料表）在25 °C、488 nm激光波长条件下测定纳米颗粒的流体动力学直径（nm）和浓度。
   1. NTA与样品准备
      1. 打开计算机和设备。首先检查所有组件是否正确连接。然后启动推荐的软件。软件将自动检测所有附件是否正确连接。
      2. 将顶板（即O型圈样品池）连接至激光模块。
         注意：请勿过度拧紧此部件。
      3. 首先使用1 mL注射器将缓冲液和/或去离子水注入样品室。重复该步骤至少两次。避免在样品室中引入气泡。
      4. 将DLS粒径测量所用浓度的样品用去离子水稀释1000倍来制备样品。准备至少1 mL，并将其装入1 mL注射器中，避免引入气泡。
      5. 使用注射器将样品注入样品室。然后将激光模块插入NTA大样品室中。
         注意：“大样品室”指用于放置样品室进行测量的空间。
   2. 图像优化
      1. 首先在硬件设置中，确认已选择相机和正确的激光器。
         注意：此处仅有一个相机和一个488 nm蓝色激光器。
      2. 将相机增益设为0，然后在采集窗口中点击启动相机。
         注意：此时需调整以下参数：光束位置（可在屏幕上上下移动）；相机增益：避免像素过饱和；聚焦（横向旋钮）：尽可能清晰对焦，宁可出现颗粒光晕也不要失焦；浓度：调整至每视野10至100个颗粒为宜。
   3. 视频录制
      1. 在软件中进入测量选择- SOP窗口（左下角），选择标准测量。
         注意：程序设置为执行三次每次30秒的测量（以便软件计算均值和标准偏差）。在“基础文件名”中提供名称和文件夹路径以保存样品记录。当SOP参数正确设置后，点击创建和运行脚本。完成第一次重复测量后，程序将提示添加新样品。此时需推动注射器活塞向样品室注入另一份样品。最后重复第三次，以分析第三个重复样品。
   4. 视频处理
      1. 完成三次测量后，重新调整屏幕增益和检测阈值以分析所测颗粒。此时每帧应显示约100个颗粒以进行分析（预期为高红叉、低蓝叉）。
      2. 分析完成后，将结果导出为pdf文件。此外，也可导出为视频或Excel文件。
   5. NTA清洁
      注意：在分析下一个样品前，请关闭所有已打开的测量文件；由于生成的文件体积巨大，根据计算机性能，同时保持多个文件打开较为困难。
      1. 在进行后续测量前，反复用水冲洗NTA样品室，直至观察不到任何颗粒；随后用所用缓冲液（PBS）冲洗，以继续后续测量。
      2. 当天最后一次测量完成后，向样品室中通入空气，并用显微镜级纸巾干燥。
      3. 通过透射电子显微镜（TEM）表征颗粒的尺寸和形貌。准备样品。最终体积30 µL足以用于TEM表征。
         注意：新鲜样品和冻干后重悬的纳米颗粒均可测量。
      4. 取10 µL样品滴加到碳支持铜网上，静置干燥10分钟。如有必要，可轻轻接触滤纸以去除多余液体。
      5. 滴加10 µL醋酸铀酰（2% w/v）溶液进行负染色，静置干燥1分钟。如有必要，可轻轻接触滤纸以去除多余液体。
      6. 将样品放入显微镜中进行扫描（工作电压80 kV）。
         注意：可使用适当的软件对图像进行进一步分析。
3. 包封效率
   1. 样品准备
      1. 按所需浓度制备纳米颗粒，并进行冷冻干燥。然后重悬纳米颗粒，并稀释至终浓度为6 µg/mL。
      2. 从20x储存液配制1x TE缓冲液。
         注意：Vt（总体积）=（样品数 × 100 µL × 4）+（样品数 × 290 µL）+ 2 mL。
      3. 从100 µg/µL储存液配制含3 µg/µL肝素的TE缓冲液。
         注意：Vt = 样品数 × 50 µL × 2。
      4. 准备标准品
      5. 在1x Tris-EDTA（TE）缓冲液中配制RNA标准品，浓度范围为0.2 µg/mL至0.025 µg/mL（表S1A）。
         注意：若使用的RNA与核糖体RNA不同，则RNA标准品中应使用该mRNA。
      6. 配制含肝素的RNA:pBAE标准品（表S1B）。配制肝素标准品（表S1C）。
      7. 按如下方式准备96孔板。
         1. 在96孔板的第一列加入295 µL TE缓冲液（分析样品数对应的孔数）。然后在B列和C列各加入50 µL 1x TE缓冲液（每个样品设两个复孔）。
         2. 在D列和E列各加入50 µL含3 µg/µL肝素的1x TBE缓冲液（每个样品设两个复孔）。接着在F、G和H列各加入100 µL各标准品（每个标准品设两个复孔）。
         3. 在A列各孔中加入5 µL各样品（每孔终浓度为0.1 µg/mL）。通过移液充分混匀，然后将每份样品各取50 µL加入下方四个孔中（其中两个孔含50 µL 1x TE缓冲液，另两个孔含含3 µg/µL肝素的1x TE缓冲液）。
      8. 将样品在37 °C孵育30分钟。按照制造商说明书（见材料表）在1x TE缓冲液中配制RiboGreen试剂。
         注意：稀释1:200，涡旋混匀，避光保存。Vt = 完整孔数 × 100 µL。
      9. 向每孔加入100 µL RiboGreen溶液。使用微孔板读数仪检测荧光，激发波长500 nm，发射波长525 nm。
   2. 结果分析
      1. 绘制三条校准曲线
         注意：首先为核糖体RNA标准品绘制曲线，将不含肝素的样品插值到该曲线中；其次为含肝素的mRNA:pBAE标准品绘制曲线，将含肝素的样品插值到该曲线中；第三为肝素标准品绘制曲线，用于确认工作浓度处于线性范围内。
      2. 按如下公式计算包封效率（EE%）：
         

6. 体外 表征

1. 用于定性评估的荧光显微镜观察
   1. 转染24小时后，将96孔板放置于显微镜载物台上，使用10倍物镜开始观察细胞。
      注意：本实验以HeLa细胞为例。通过透射光模式（明场）定位细胞，并在此时调整焦距。
      1. 首先进行白平衡校正，使软件参考样品背景。然后获取一幅图像，以便在后续分析中与荧光图像叠加。
   2. 将显微镜切换至反射模式（荧光模式），并将滤光片轮移至蓝色激光（488 nm）以观察eGFP。
      注意：此时必须调整曝光时间和增益。增益应设置在3至5之间，以避免伪影和背景信号过强。曝光时间的调整取决于转染效率（从毫秒到1秒不等）。
   3. 对所有实验条件或孔位使用相同的曝光时间采集图像，以便对所有样品进行比较。
2. 用于定量评估的流式细胞术（FC）
   1. 使用多通道移液器准备用于流式细胞术实验的96孔板。
      注意：处理半贴壁细胞（如JAWSII细胞系）时，应收集全部培养基并转移至另一个96孔板中。请勿弃去该培养基，因其可能含有大量转染后的细胞。
   2. 用每孔100 µL的1×PBS清洗细胞（本实验使用HeLa细胞），吸除PBS。随后每孔加入25 µL胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。
   3. 待细胞脱落后，加入先前回收的培养基以终止胰蛋白酶作用，并加入每孔31.25 µL的10%甲醛固定细胞，固定20分钟（终浓度为2.5%）。
      注意：此时必须通过显微镜观察细胞状态，确认细胞已完全脱落。建议反复吹打数次，以促进细胞脱落并防止细胞聚集，从而获得可靠的结果。
   4. 开启流式细胞仪及配套软件。在软件中设置实验所需参数（如板类型、样品体积，以及样品间振荡、冲洗等其他参数）。
      注意：在步骤6.2.5中，流速应设为120 µL/min。每1分钟混合1个循环，每检测1个孔冲洗1个循环。混合对于维持细胞在液体中的均匀分散、实现单个细胞的准确分析至关重要；同时，样品间冲洗可清除细胞仪微流控系统中的残留物。最后，检查缓冲液是否充足，各组件连接是否正确。
   5. 设置合适的参数以定量分析转染阳性细胞的比例。
      1. 首先在前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）的散点图上查看流式数据，以区分细胞与碎片。然后绘制另一个散点图，比较前向散射光的幅度（FSC-A）与高度（FSC-H），用于设门并筛选单个细胞。
         ​注意：未处理组可用于设门，界定转染阳性细胞对应的细胞群。随后在直方图的相应通道中对转染阳性细胞进行定量分析。因此，转染阳性细胞应在直方图上表现为连续的事件群。

7. 体外 功能测试：利用卵清蛋白（OVA）作为抗原模型mRNA，检测激活模型免疫细胞的能力

1. 转染前一天，在96孔板中每孔接种10,000个细胞（此处使用JAWSII细胞）。
   注意：根据实验条件需要，接种足够数量的孔，确保每个条件设三个重复。让细胞贴壁至少12小时（建议过夜培养）。
2. 按照下方注意事项中的方法制备pBAEs纳米颗粒（NPs），用于每孔转染0.6 µg mRNA。
   注意：作为阳性对照，使用转染试剂进行细胞转染。此处每孔使用0.1 µg mRNA和0.25 µL转染试剂。编码OVA的mRNA购自供应商（见材料表）。该mRNA经过多聚腺苷酸化修饰，采用5-甲氧基尿苷修饰，并针对哺乳动物系统进行了优化，且通过Cap1结构进行末端加帽，此为供应商的专有技术。
3. 将96孔板置于37 °C、5% CO₂的干燥空气培养箱中培养24小时。
   注意：培养结束后，不要吸除培养基，因其可能含有部分细胞。收集细胞并转移至另一孔或新板中保存。
4. 用25 µL 1× PBS洗涤孔中残留的细胞，随后吸除PBS，加入25 µL胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟以使细胞脱落。将先前回收的培养基加入对应孔中以终止胰蛋白酶反应。
5. 在4 °C下以400 × g离心5分钟。吸除上清液，每孔加入50 µL 1× PBS和2.5%甲醛溶液，于4 °C孵育20分钟以固定细胞。
6. 重复步骤7.5和7.5.1。然后每孔加入50 µL含3% BSA的1× PBS（封闭缓冲液），于4 °C孵育30分钟。再次重复步骤7.5和7.5.1，随后每孔加入50 µL用含3% BSA的1× PBS稀释的一抗（小鼠抗OVA抗体），于4 °C孵育30分钟。
7. 重复步骤7.5和7.5.1，然后用每孔50 µL 1× PBS洗涤细胞。吸除液体后，每孔加入用含3% BSA的1× PBS稀释的二抗溶液（α-小鼠-AlexaFluor488/PerCP 和 Cy5.5-CD11b/APC-CD86），于4 °C孵育1小时。
8. 在400 × g下离心5分钟。随后用每孔50 µL 1× PBS洗涤细胞。接着再次离心（400 × g，5分钟），吸除上清液，每孔用100 µL含2.5%甲醛的1× PBS重悬细胞。
9. 按照上述方法（步骤6.2）进行流式细胞术分析。

结果

聚合物合成与表征
OM-pBAE 的合成步骤见图2。如图2A所示，获得 OM-pBAE 的第一步是通过将胺类（1-己胺和5-氨基-1-戊醇，比例为1:1）加入二丙烯酸酯（1,4-丁二醇二丙烯酸酯）中合成 C6-pBAE。该反应在90 °C下持续20小时，并持续搅拌。随后，将寡肽溶液加入上一步反应所得的 C6 聚合物溶液中（图2B）。最后，在25 °C下以 DMSO 作为溶剂，持续搅拌反应20小时完成合成。图2C展示了 OM-pBAE 的结构，即聚合反应的最终产物。所得聚合物通过¹H-NMR 进行表征（见补充图S2）。在表征中，阳性结果是指含有7–10个单体单元（图中 n + m）且两种单体单元各约占一半的聚合物；而在此范围之外的任何其他数值均为阴性结果。

讨论

去年新冠疫情暴发后，疫苗在传染病防控中的重要性凸显，已成为关键组成部分⁸。全球科学家的努力使得多种疫苗得以投入市场。历史上首次，mRNA疫苗展现出此前假想的成功效果，这得益于其能够在数月内快速设计并适应任何新抗原的特性^5,6,21。mRNA（信使核糖核酸）是指将DNA中编码的信息用于驱动蛋白质合成的核酸分子。在此背景下，为疫苗接种目的，mRNA编码一种来源于致病微生物的抗原蛋白（或在治疗性肿瘤疫苗中编码肿瘤抗原）^8,22。因此，科学界亟需明确的mRNA疫苗合成操作规程。

基于这一设想，本文旨在描述一种利用专有聚合物纳米颗粒合成mRNA疫苗的简便方法²⁴。如方案部分所述，首先通过两步法合成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,4-丁二醇二丙烯酸酯	Sigma Aldrich	123048
1-己胺	Sigma Aldrich	219703
5-氨基-1-戊醇	Sigma Aldrich	411744
丙酮	Panreac	141007
CD11b 抗体	BD	550993
CD86 抗体	Bioligend	105007
氯化羟胺	Panreac	181023
氘代氯仿	Sigma Aldrich	151823
Cys-His-His-His 肽	Ontores	Custom
Cys-Lys-Lys-Lys 肽	Ontores	Custom
D2O	Sigma Aldrich	151882
DEPC 试剂（用于制备无 RNase 水）	Sigma Aldrich	D5758	该试剂用于处理 MilliQ 水，以去除缓冲液中的任何 RNase
乙醚	Panreac	212770
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	276855
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
mRNA EGFP	TriLink Technologies	L-7601
mRNA OVA	TriLink Technologies	L-7610
RiboGreen 试剂盒	ThermoFisher	R11490
乙酸钠	Sigma Aldrich	71196
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389
三氟乙酸	Sigma Aldrich	302031
胰蛋白酶-EDTA	Fisher Scientific	11570626
α-小鼠 AlexaFluor488 抗体	Abcam	Ab450105
仪器
纳米颗粒追踪分析仪	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
核磁共振波谱仪	Varian	400 MHz
ZetaSizer	Malvern Panalytical	Nano ZS	用于测定 ζ 电位和流体动力学尺寸
软件
NanoSight NTA 软件	Malvern Panalytical	MAN0515-02-EN-00
NovoExpress 软件	Agilent	未指定
ZetaSizer 软件	Malvern Panalytical	DTS Application	用于分析表面电荷和流体动力学尺寸