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方法文章

新鲜分离小鼠肝细胞悬液中脂肪酸β-氧化的测定

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DOI：

10.3791/62904

⸱

2021年9月9日

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, West Virginia University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

脂肪酸β-氧化是一种重要的代谢途径，在包括肝细胞在内的多种细胞类型中负责能量生成。本文介绍一种利用14C标记的棕榈酸测定 freshly isolated primary hepatocytes（原代肝细胞）中脂肪酸β-氧化的方法。

摘要

脂肪酸β-氧化是肝脏满足能量需求的关键代谢途径，可为其他过程提供底物和辅因子，例如酮体生成和糖异生，这些过程对于维持全身葡萄糖稳态以及在禁食状态下支持肝外器官功能至关重要。脂肪酸β-氧化发生于线粒体和过氧化物酶体中，并通过多种机制进行调控，包括脂肪酸的摄取与活化、酶的表达水平，以及辅因子（如辅酶A和NAD+）的可利用性。在测定肝匀浆中脂肪酸β-氧化的实验中，细胞裂解以及常加入超生理浓度辅因子的做法会掩盖这些调控机制的作用。此外，匀浆中细胞器的完整性难以控制，且不同制备样品间可能存在显著差异。在完整原代肝细胞中测定脂肪酸β-氧化可克服上述缺陷。本方案描述了一种利用新鲜分离的小鼠原代肝细胞悬液，与14C标记的棕榈酸共同孵育来测定脂肪酸β-氧化的方法。由于避免了数小时至数天的培养过程，该方法能够更好地保留肝脏原有的蛋白质表达水平和代谢通路活性，包括在来自禁食小鼠的肝细胞中观察到的脂肪酸β-氧化激活现象，相较于进食小鼠的肝细胞具有明显优势。

引言

脂肪酸β-氧化是脂质代谢中的一个关键过程，提供了一条分解代谢途径，以平衡脂肪酸的合成及膳食摄入。该过程为多种器官提供能量，包括心肌、肾皮质和饥饿状态下的肝脏，所利用的脂肪酸来源于膳食、脂肪组织中的脂解作用以及体内甘油三酯的储存1,2。

通过β-氧化途径对脂肪酸进行氧化，会逐次将脂肪酰链缩短两个碳原子，并以乙酰辅酶A的形式释放，该过程发生于线粒体和过氧化物酶体中。尽管大多数脂肪酸仅经历β-氧化，但某些脂肪酸在进入该途径前会在其他碳位点发生氧化。例如，3-甲基取代的脂肪酸（如植烷酸）在进入β-氧化途径前，需先在过氧化物酶体中通过α-氧化去除一个碳原子。类似地，某些脂肪酸首先在内质网中通过末端甲基的氧化（ω-氧化）转化为二羧基脂肪酸，随后更倾向于在过氧化物酶体中经由β-氧化进一步降解3。

无论何种特定细胞器，脂肪酸都必须首先转化为辅酶A（CoA）硫酯，即酰基-CoA，才能通过β-氧化途径进行氧化。长链酰基-CoA在进入线粒体基质进行β-氧化时，需依赖肉碱穿梭系统进行转运，其中肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1）催化酰基-CoA转化为酰基肉碱，是该过程的限速酶。4一旦转运至线粒体基质，酰基辅酶A重新生成，并作为线粒体β-氧化系统的底物。在禁食状态下，肝脏线粒体通过β-氧化产生的乙酰辅酶A主要进入酮体生成途径。过氧化物酶体是极长链、支链及二羧脂肪酸β-氧化的主要场所。过氧化物酶体无需依赖肉碱穿梭系统来导入脂肪酸底物，而是 通过ATP结合盒（ABC）转运蛋白ABCD1-3的活性导入相应的酰基辅酶A5在过氧化物酶体中，酰基辅酶A随后被一组特定的酶氧化，这组酶不同于线粒体脂肪酸β-氧化系统。线粒体和过氧化物酶体均需要NAD的供应。+ 以及游离辅酶A用于氧化脂肪酰链。研究表明，肝脏中的辅酶A水平在禁食状态下会升高，以支持此状态下脂肪酸氧化速率的增加6此外，过氧化物酶体中辅酶A的降解增加，导致过氧化物酶体脂肪酸氧化的选择性降低7因此，细胞内脂肪酸氧化过程受到参与脂肪酸活化、转运和氧化的酶的表达水平与活性，以及多种亚细胞区域中辅因子和其他代谢物浓度的共同调控。

使用组织匀浆测定脂肪酸氧化的实验方法会破坏调控和维持该过程的细胞结构，导致所获得的数据无法准确反映 体内 代谢。尽管使用贴壁原代肝细胞的技术能够维持这一系统，但将分离的细胞进行长时间培养会导致该系统的功能丧失 体内 基因表达谱，即细胞在动物体内存活时所具有的基因表达状态8,9. 以下方案描述了一种分离原代肝细胞并立即在分离后以悬浮状态检测其脂肪酸β-氧化能力的方法，采用[1-14C]棕榈酸。该检测基于测量与β-氧化产生的酸溶性代谢物（ASM）或产物（如乙酰-CoA）相关的放射性。14C]棕榈酸10,11.

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方案

所有在小鼠（C57BL/6J，雄性，9-11 周龄）上进行的实验程序均经西弗吉尼亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 肝细胞分离

  1. 准备
    1. 在肝细胞分离前的几天，配制 表1 中列出的缓冲液和细胞培养基。在手术操作区域附近设置一个温度为 37 °C 的水浴锅。
    2. 在肝细胞分离当天，在超净工作台内，将 35 mL 缓冲液1转移至无菌的 50 mL 离心管中，并将 70 mL 缓冲液2转移至无菌的 100 mL 烧杯或瓶中。
    3. 向两种缓冲液中均加入抗生素：庆大霉素（50 µg/mL）和青霉素/链霉素（1x）。
    4. 将步骤 1.1.3 中配制的缓冲液2取 20 mL 转移至一个 100 mm 细胞培养皿中，并置于冰上。
    5. 将剩余的 50 mL 缓冲液2转移至一个无菌的 50 mL 离心管中。将含有抗生素的缓冲液1和缓冲液2的 50 mL 离心管放入 37 °C 水浴锅中，预热至少 15 分钟后再开始灌注。
      注意：若在同一次实验中进行多次肝细胞分离，请相应增加含抗生素的缓冲液1和缓冲液2的分装份数。
    6. 解冻一份胶原酶溶液，并保持在冰上。
      注意：若储存得当，胶原酶溶液在冻融不超过 3 次、且在配制后 3 周内使用的情况下，酶活性无明显损失。
    7. 准备好手术器械和蠕动泵。通过循环 15 mL 70% 乙醇，再用 15 mL 无菌水冲洗，对蠕动泵的管路进行灭菌。
    8. 将一根 22 G 针头连接至出口管路（图1A）。导管的中空滤器可作为良好的连接件。用缓冲液1充满管路，并检查管路、连接件和针头，确保无气泡残留。

微型泵装置与啮齿类动物解剖用于变流量研究；图示为带导管的手术操作。
图 1：灌流装置与灌流肝脏。（A）蠕动泵，其出口管路连接用于插管并灌流肝脏的针头。（B）成功插管的标志是肝脏立即且均匀地变白。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 肝脏灌注与解离
    1. 使用医用级空气作为载气，通过异氟烷吸入麻醉小鼠，诱导阶段使用4%异氟烷，维持麻醉时使用1.5%异氟烷。通过评估足底反射的消失来确认麻醉深度。
    2. 当小鼠对脚趾夹捏无反应时，将其仰卧位固定于手术板上，伸展四肢并用针固定。
    3. 用70%乙醇充分喷洒小鼠的腹部和胸部。
    4. 使用镊子提起腹部基部附近的皮肤和腹壁，沿中线两侧横向剪开至膈肌，以暴露器官。
    5. 将肠道移至右侧，并轻轻翻起肝脏叶，暴露下腔静脉（IVC）。在小鼠背部下方插入一个小的圆柱形物体（如针帽），使下腔静脉轻微倾斜，便于插管（图1B）。
    6. 将泵调至最低转速，使缓冲液1（Buffer 1）开始流动，随后将针插入下腔静脉（IVC）。
    7. 剪开门静脉以释放压力，使血液和灌注缓冲液得以排出，然后立即将流速提高至7 mL/min。若操作正确，肝脏将在数秒内均匀变白（图1B）。
    8. 为获得更一致的结果，在整个灌注过程中用手固定针的位置。
    9. 使用预热的缓冲液1（Buffer 1）灌注肝脏。为避免引入气泡，确保插入缓冲液1管中的导管始终完全浸没。
    10. 灌注过程中，向缓冲液2（Buffer 2）中加入130 µL胶原酶溶液，并用移液器上下吹打或使用5 mL或10 mL血清移液器搅拌混合。
    11. 当含缓冲液1（Buffer 1）的管中液体体积减少至约5 mL时，缓慢沿管壁加入5 mL缓冲液2（Buffer 2）。目的是在从缓冲液1切换至缓冲液2时避免引入气泡。
    12. 等待体积再次减少至5 mL，再缓慢加入另外5 mL缓冲液2（Buffer 2）。重复一次。随着缓冲液2（Buffer 2）替代缓冲液1（Buffer 1）并开始组织解离，肝脏将出现肿胀。
    13. 将剩余的缓冲液2（Buffer 2）全部加入最初盛有缓冲液1（Buffer 1）的管中。当管中剩余约5–10 mL缓冲液2（Buffer 2）时，停止灌注。
      注：在缓冲液2（Buffer 2）灌注肝脏期间，可用镊子间歇性夹闭门静脉5秒。此步骤为可选，但由此引起的肝脏内压力升高可改善组织解离效果，从而提高最终肝细胞产量。
    14. 小心切除肝脏，并转移至100 mm培养皿中，该培养皿内已预先放置步骤1.1.4中保留的20 mL冰浴缓冲液2（Buffer 2）。
    15. 在层流罩下，使用手术剪刀和镊子轻轻将肝脏剪碎。
    16. 向肝细胞悬液中加入约20 mL冰浴M199培养基，并使用注射器推杆轻柔推动，使悬液通过100 µm细胞滤网，以促进更大肝组织块中残留肝细胞的释放。
    17. 用额外的M199培养基冲洗100 mm培养皿和细胞滤网，直至收集管装满。
    18. 将悬液在4 °C下以50 × g离心2分钟。小心吸除上清液，并通过轻柔摇晃将肝细胞沉淀重悬于30 mL冷M199培养基中。
    19. 按步骤1.2.18所述方式再次沉淀肝细胞。重复洗涤一次。
    20. 将肝细胞重悬于10 mL预热的M199培养基中，使用台盼蓝排斥法结合血细胞计数板测定细胞活力和产量12。
    21. 将细胞用预热至37 °C的M199培养基稀释至最终浓度为1.0 × 106个活细胞/mL，并立即开始实验。

2. 脂肪酸β-氧化测定

注意：该检测需设置三个重复，每个反应体系包含 750,000 个细胞、1.35 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）、100 µM 棕榈酸和 0.4 µCi [1-14C]棕榈酸，最终体积为 2 mL。
警告：放射性化合物具有危害性。放射性物质的购买、操作、储存和处置必须遵守机构、州和联邦的相关法规。

  1. 准备
    1. 在测定前的几天，配制棕榈酸和BSA溶液（表1) 并于 -20 °C.
    2. 在检测当天，开始肝脏灌注前，先完成步骤 2.1.3-2.1.9。
    3. 解冻棕榈酸和 BSA 溶液。配制足够进行多个反应并额外多出 20%–30% 的底物混合液，典型的检测设置如图所示 表 2.
    4. 等分试样 13.5 µL 每反应在微量离心管中加入 BSA 溶液，并升温至 41 °C，然后加入 1 µL 每次反应加入200 mM棕榈酸溶液（BSA：棕榈酸摩尔比 = 1:5）。
      注意：使用有机溶剂配制的溶液（如放射性与非放射性棕榈酸溶液）宜采用正向置换移液器及配套吸头进行分装。
    5. 剧烈涡旋并孵育于 41 °C 以促进可溶性棕榈酸：BSA 复合物的形成。孵育期间偶尔涡旋混匀。
    6. 混合物最初会呈现浑浊状态，但在20-30分钟孵育后将完全澄清 41 °C. 保持 41 °C 待反应开始前保存。
    7. 等分试样 133 µL 加入1 M高氯酸0.5 mL至1.5 mL微量离心管中以终止反应。
      警告：高氯酸是一种强酸和强氧化剂。操作该化合物时必须佩戴适当的防护装备。
    8. 等分试样 485.5 µL 每反应将 M199 加入管中并保持 37 °C 在开始反应之前，稀释在步骤 2.1.4-2.1.6 中制备的放射性标记 BSA：棕榈酸复合物。
    9. 分配 750 µL 在若干个14 mL圆底试管中加入M199培养基，试管数量与样本数相同。如需抑制脂肪酸β-氧化，可加入抑制剂如依托莫西（etomoxir）、鱼藤酮（rotenone）和抗霉素（antimycin），并设置溶剂对照组（vehicle control）表 2).
    10. 在肝细胞洗涤步骤期间，距离反应开始前10–15分钟，将2.1.9步骤中准备的试管转移至设定为 37 °C 并在 180-200 rpm 条件下振荡。
  2. 启动、终止及分析脂肪酸β-氧化反应
    1. 如果肝细胞的活力符合要求（通常 ≥ 75%）， 图2），每种反应转移 0.8 µL 的[1-14C]棕榈酸（0.5 mCi/mL）加入至含有澄清BSA:棕榈酸溶液的微量离心管中（步骤2.1.4–2.1.6）。涡旋混匀后，放回水浴中 41 °C.
    2. 使肝细胞达到平衡 37 °C 并在最终肝细胞重悬后（步骤 1.2.21），立即加入抑制剂（如有）进行预孵育，转移 750 µL 用1 mL移液器将肝细胞悬液加入振荡水浴中的每个14 mL圆底管（步骤2.1.9-2.1.10），然后低速涡旋振荡短暂混匀。
    3. 每次添加间隔30秒，孵育15分钟。为保存用于蛋白质测定的样品，另取一份肝细胞等分试样转移至1.5 mL微量离心管中，在3,000 × g下离心5分钟。
      注意：在分装过程中，需持续轻轻晃动肝细胞悬液或用1 mL移液器轻轻搅拌，以防止细胞沉降，避免各样本间细胞数量出现较大差异。
    4. 移除上清液，并将沉淀物储存在 -80 °C 直到准备测量样品中的总蛋白量以标准化结果时图3).
    5. 当肝细胞处于预孵育阶段时 37 °C，将放射性BSA：棕榈酸复合物加入2.1.8中的温培养基中，并保持在 37 °C 待反应开始前保存。此为最终底物混合液。
    6. 开始反应时，将肝细胞从水浴中取出并加入 500 µL 底物混合物
    7. 低速涡旋振荡5秒，充分重悬细胞，然后放回水浴。所有样品依次操作，间隔30秒。
    8. 孵育15分钟。启动一组反应并立即终止（见步骤2.2.10–2.2.11），以测定背景放射性（表2).
    9. 转移等量的两份样品（200-250 µL) 剩余底物混合物加入至 6 mL 闪烁瓶中，留置待计数。利用这些计数结果计算与可用于氧化的总纳摩尔（nmoles）棕榈酸相对应的放射活性 500 µL 底物混合物
    10. 为终止反应，将肝细胞从水浴中取出，以中等速度涡旋振荡重悬肝细胞，然后转移 400 µL 将肝细胞悬液加入含有高氯酸的微量离心管中。
    11. 立即盖上管盖。对所有样品重复此操作，每次间隔30 s。
    12. 剧烈涡旋1.5 mL微量离心管，并以13,000 x g 10 分钟
    13. 转移 300 µL 将上清液转移至6 mL闪烁瓶中，加入4 mL闪烁液，使用闪烁计数器对样品及底物混合物等分试样（步骤2.2.9）进行放射性计数。
      注意：离心后，应在通风橱内打开管子，以避免吸入气溶胶 14C-CO2 由完全氧化产生的 14脂肪酸β-氧化生成的C-乙酰辅酶A在酸性条件下被释放。
缓冲液/培养基组分用量终浓度操作说明
溶液 C
KCl 1.79 g480 mM加水至 50 mL。4 °C 保存
MgSO4 七水合物 1.48 g120 mM
KH2PO4 0.81 g119 mM
无钙克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（KHB）
NaCl7.0 g 120 mM加水至 900 mL，调节 pH 至 7.4，定容至 1 L。4 °C 保存
NaHCO32.0 g 24 mM
1 M HEPES（pH 7.45）5 mL 5 mM
葡萄糖1 或 2 g 5.6 或 11 mM
溶液 C10 mL
缓冲液 1
KHB500 mL混合组分并过滤除菌。4 °C 保存
50 mM EGTA1.0 mL 0.1 mM
缓冲液 2
KHB500 mL混合组分并过滤除菌。4 °C 保存
1 M CaCl2 二水合物686 µL 1.4 mM
庆大霉素溶液
硫酸庆大霉素0.5 g50 mg/mL加水至 10 mL 并过滤除菌。分装后 -20 °C 保存
胶原酶溶液
I 型和 II 型胶原酶混合物10 mg7 mg/mL将瓶内全部内容物溶于 1.43 mL 水中。分装后 -20 °C 保存
M199 培养基
M1991 袋加水至 900 mL 并调节 pH 至 7.2–7.4。定容至 1 L 并过滤除菌。4 °C 保存
NaHCO32.2 g 26 mM
1 M HEPES（细胞培养级）25 mL 25 mM
额外葡萄糖（仅用于喂食小鼠）1 g 11 mM
BSA 溶液
无脂肪酸 BSA400 mg20% (w/v)溶于 2 mL 水中。分装后 -20 °C 保存
非放射性棕榈酸溶液
棕榈酸103 mg200 mM溶于 2 mL 乙醇中，-20 °C 保存
1 M 高氯酸
70% 高氯酸3.5 mL1 M加水稀释至 40 mL。室温保存

表1：肝细胞分离和脂肪酸β-氧化测定所需的缓冲液、培养基及其他溶液

反应编号M199 ± 抑制剂肝细胞悬液 (µL)底物混合液 (µL)
体积 (µL)依托莫西
1750-在 37 °C 预热750在 37 °C 预孵育 15 分钟500在 37 °C 孵育 15 分钟
2
3
4+
5
6
7+立即终止
8
9

表2：在有无依他莫西存在下，对肝细胞悬液进行三重测定的实验设置示例。

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结果

此处所述的肝脏灌注通常可获得每肝脏3000万至4000万个细胞，台盼蓝排斥法测定的平均细胞活力为80%（图2）。用于配制灌注缓冲液1和2的克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（KHB）中，葡萄糖的典型浓度为11 mM。在测定禁食小鼠分离肝细胞中脂肪酸β-氧化时，可降低KHB中的葡萄糖浓度，以更好地模拟禁食状态。如图2所示，将葡萄糖浓度降低至5.6 mM对肝细胞的得率或活力均无不利影响。

表2 显示了在有或无依他莫西（etomoxir）存在条件下，对肝细胞悬液进行三复孔测定的典型实验装置；依他莫西是一种强效的CPT1抑制剂，因而可抑制线粒体脂肪酸氧化10,13. 在存在此类或其他线粒体脂肪酸氧化抑制剂的情况下，任何残留的 14由[1-14C]棕榈酸氧化生成的C标记产物可归因于过氧化物酶体中β-氧化的第一轮循...

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讨论

在肝脏灌注过程中，必须避免引入气泡，因为气泡会阻塞肝脏中的微毛细血管，阻碍或限制缓冲液的循环，从而整体降低肝细胞的得率和存活率20,21。采取一些预防措施，例如在插管下腔静脉之前仔细检查充满缓冲液的进样管路，以及在从缓冲液1切换至缓冲液2时避免将进样管路从盛有缓冲液1的管子中提起（如本文所述），可有效减少灌注失败的次数（存活率<70%）。在灌注系统中使用除泡装置也可显著降低此类风险20,21。

胶原酶活性是分离肝细胞的另一个关键参数，传统上需要对每一批新获得的胶原酶进行测试和优化12,20。使用高纯度且成分明确的胶原酶混合物可显著降低批间差异，从而无需对每一批新胶原酶进行测试。此外，当使用这些混合酶时，通常只需对使用体积进行微...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院资助 R35GM119528，资助对象为 Roberta Leonardi。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(R)-(+)-依替莫西尔钠盐Tocris Bioscience4539/10
[1-14C]-棕榈酸，50–60 mCi/mmol，0.5 mCi/mLAmerican Radiolabeled ChemicalsARC 0172A
1 M HEPES，无菌Corning25060CI
10 µL 一次性排代式移液器毛细管/活塞Mettler Toledo17008604
1000 µL、200 µL 和 10 µL 移液器及吸头
5 mL、10 mL 和 25 mL 血清移液管
50 mL 无菌离心管CellTreat229421
70% 高氯酸Fisher ScientificA2296-1LB
牛血清白蛋白（BSA），无脂肪酸Fisher ScientificBP9704100
CaCl2 二水合物MilliporeSigma223506
D-(+)-葡萄糖MilliporeSigmaG7021
EGTAGold BiotechnologyE-217
乙醇Pharmco111000200CSPP
过滤系统，0.22 μm PES 滤膜，500 mL，无菌CellTreat229707
硫酸庆大霉素Gold BiotechnologyG-400-25
HDPE，6.5 mL 闪烁瓶Fisher Scientific03-342-3
血细胞计数板
22 G，1.5 英寸皮下注射针头BD Biosciences305156
异氟烷VetOne502017
KClFisher ScientificBP366-1
KH2PO4MilliporeSigmaP5655
Liberase TM 研究级酶MilliporeSigma5401119001纯化的胶原酶 I 和 II 的确定混合物，含中等浓度的嗜热菌蛋白酶
M199 培养基MilliporeSigmaM5017
MgSO4 七水合物MilliporeSigmaM1880
微量离心机Fisher ScientificaccuSpin Micro 17
显微解剖剪刀Roboz Surgical Instrument CoRS-5980
NaClChem-Impex International30070
NaHCO3Acros Organics424270010
棕榈酸MilliporeSigmaP0500
青霉素/链霉素（100倍浓缩液）Gibco15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）Cytiva Life SciencesSH30256.01
排代式移液器 MR-10，10 µLMettler Toledo17008575
带50 mL锥形管转子的制冷离心机Eppendorf5810 R
圆底聚丙烯培养管，14 mLFisher Scientific14-956-9A
闪烁计数器Perkin ElmerTriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD 闪烁液Fisher ScientificSX18-4
振荡水浴锅，30 L 容量New Brunswick Scientific 型号 G76
无菌细胞滤网，100 µmFisher Scientific22363549
持针钳（拇指式敷料钳）Roboz Surgical Instrument CoRS-8120
台盼蓝Corning25900CI
可调流速蠕动泵Fisher Scientific138762
水浴锅，2–2.5 L 容量

参考文献

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