新鲜分离小鼠肝细胞悬液中脂肪酸β-氧化的测定

摘要

脂肪酸β-氧化是一种重要的代谢途径，在包括肝细胞在内的多种细胞类型中负责能量生成。本文介绍一种利用¹⁴C标记的棕榈酸测定 freshly isolated primary hepatocytes（原代肝细胞）中脂肪酸β-氧化的方法。

摘要

脂肪酸β-氧化是肝脏满足能量需求的关键代谢途径，可为其他过程提供底物和辅因子，例如酮体生成和糖异生，这些过程对于维持全身葡萄糖稳态以及在禁食状态下支持肝外器官功能至关重要。脂肪酸β-氧化发生于线粒体和过氧化物酶体中，并通过多种机制进行调控，包括脂肪酸的摄取与活化、酶的表达水平，以及辅因子（如辅酶A和NAD⁺）的可利用性。在测定肝匀浆中脂肪酸β-氧化的实验中，细胞裂解以及常加入超生理浓度辅因子的做法会掩盖这些调控机制的作用。此外，匀浆中细胞器的完整性难以控制，且不同制备样品间可能存在显著差异。在完整原代肝细胞中测定脂肪酸β-氧化可克服上述缺陷。本方案描述了一种利用新鲜分离的小鼠原代肝细胞悬液，与¹⁴C标记的棕榈酸共同孵育来测定脂肪酸β-氧化的方法。由于避免了数小时至数天的培养过程，该方法能够更好地保留肝脏原有的蛋白质表达水平和代谢通路活性，包括在来自禁食小鼠的肝细胞中观察到的脂肪酸β-氧化激活现象，相较于进食小鼠的肝细胞具有明显优势。

引言

脂肪酸β-氧化是脂质代谢中的一个关键过程，提供了一条分解代谢途径，以平衡脂肪酸的合成及膳食摄入。该过程为多种器官提供能量，包括心肌、肾皮质和饥饿状态下的肝脏，所利用的脂肪酸来源于膳食、脂肪组织中的脂解作用以及体内甘油三酯的储存^1,2。

通过β-氧化途径对脂肪酸进行氧化，会逐次将脂肪酰链缩短两个碳原子，并以乙酰辅酶A的形式释放，该过程发生于线粒体和过氧化物酶体中。尽管大多数脂肪酸仅经历β-氧化，但某些脂肪酸在进入该途径前会在其他碳位点发生氧化。例如，3-甲基取代的脂肪酸（如植烷酸）在进入β-氧化途径前，需先在过氧化物酶体中通过α-氧化去除一个碳原子。类似地，某些脂肪酸首先在内质网中通过末端甲基的氧化（ω-氧化）转化为二羧基脂肪酸，随后更倾向于在过氧化物酶体中经由β-氧化进一步降解³。

无论何种特定细胞器，脂肪酸都必须首先转化为辅酶A（CoA）硫酯，即酰基-CoA，才能通过β-氧化途径进行氧化。长链酰基-CoA在进入线粒体基质进行β-氧化时，需依赖肉碱穿梭系统进行转运，其中肉碱棕榈酰转移酶1（CPT1）催化酰基-CoA转化为酰基肉碱，是该过程的限速酶。⁴一旦转运至线粒体基质，酰基辅酶A重新生成，并作为线粒体β-氧化....

方案

所有在小鼠（C57BL/6J，雄性，9-11 周龄）上进行的实验程序均经西弗吉尼亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 肝细胞分离

1. 准备
   1. 在肝细胞分离前的几天，配制 表1 中列出的缓冲液和细胞培养基。在手术操作区域附近设置一个温度为 37 °C 的水浴锅。
   2. 在肝细胞分离当天，在超净工作台内，将 35 mL 缓冲液1转移至无菌的 50 mL 离心管中，并将 70 mL 缓冲液2转移至无菌的 100 mL 烧杯或瓶中。
   3. 向两种缓冲液中均加入抗生素：庆大霉素（50 µg/mL）和青霉素/链霉素（1x）。
   4. 将步骤 1.1.3 中配制的缓冲液2取 20 mL 转移至一个 100 mm 细胞培养皿中，并置于冰上。
   5. 将剩余的 50 mL 缓冲液2转移至一个无菌的 50 mL 离心管中。将含有抗生素的缓冲液1和缓冲液2的 50 mL 离心管放入 37 °C 水浴锅中，预热至少 15 分钟后再开始灌注。
      注意：若在同一次实验中进行多次肝细胞分离，请相应增加含抗生素的缓冲液1和缓冲液2的分装份数。
   6. 解冻一份胶原酶溶液，并保持在冰上。
      注意：若储存得当，胶原酶溶液在冻融不超过 3 次、且在配制后 3 周内使用的情况下，酶活性无明显损失。
   7. 准备好手....

结果

此处所述的肝脏灌注通常可获得每肝脏3000万至4000万个细胞，台盼蓝排斥法测定的平均细胞活力为80%（图2）。用于配制灌注缓冲液1和2的克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（KHB）中，葡萄糖的典型浓度为11 mM。在测定禁食小鼠分离肝细胞中脂肪酸β-氧化时，可降低KHB中的葡萄糖浓度，以更好地模拟禁食状态。如图2所示，将葡萄糖浓度降低至5.6 mM对肝细胞的得率或活力均无不利影响。

表2 显示了在有或无依他莫西（etomoxir）存在条件下，对肝细胞悬液进行三复孔测定的典型实验装置；依他莫西是一种强效的CPT1抑制剂，因而可抑制线粒体脂肪酸氧化^10,13. 在存在此类或其他线粒体脂肪酸氧化抑制剂的情况下，任何残留的 ¹⁴由[1-14C]棕榈酸氧化生成的C标记产物可归因于过氧化物酶体中β-氧化的第一轮循.......

讨论

在肝脏灌注过程中，必须避免引入气泡，因为气泡会阻塞肝脏中的微毛细血管，阻碍或限制缓冲液的循环，从而整体降低肝细胞的得率和存活率^20,21。采取一些预防措施，例如在插管下腔静脉之前仔细检查充满缓冲液的进样管路，以及在从缓冲液1切换至缓冲液2时避免将进样管路从盛有缓冲液1的管子中提起（如本文所述），可有效减少灌注失败的次数（存活率<70%）。在灌注系统中使用除泡装置也可显著降低此类风险^20,21。

胶原酶活性是分离肝细胞的另一个关键参数，传统上需要对每一批新获得的胶原酶进行测试和优化^12,20。使用高纯度且成分明确的胶原酶混合物可显著降低批间差异，从而无需对每一批新胶原酶进行测试。此外，当使用这些混合酶时，通常只需对使用体积进行微.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(R)-(+)-依替莫西尔钠盐	Tocris Bioscience	4539/10
[1-14C]-棕榈酸，50–60 mCi/mmol，0.5 mCi/mL	American Radiolabeled Chemicals	ARC 0172A
1 M HEPES，无菌	Corning	25060CI
10 µL 一次性排代式移液器毛细管/活塞	Mettler Toledo	17008604
1000 µL、200 µL 和 10 µL 移液器及吸头
5 mL、10 mL 和 25 mL 血清移液管
50 mL 无菌离心管	CellTreat	229421
70% 高氯酸	Fisher Scientific	A2296-1LB
牛血清白蛋白（BSA），无脂肪酸	Fisher Scientific	BP9704100
CaCl2 二水合物	MilliporeSigma	223506
D-(+)-葡萄糖	MilliporeSigma	G7021
EGTA	Gold Biotechnology	E-217
乙醇	Pharmco	111000200CSPP
过滤系统，0.22 μm PES 滤膜，500 mL，无菌	CellTreat	229707
硫酸庆大霉素	Gold Biotechnology	G-400-25
HDPE，6.5 mL 闪烁瓶	Fisher Scientific	03-342-3
血细胞计数板
22 G，1.5 英寸皮下注射针头	BD Biosciences	305156
异氟烷	VetOne	502017
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
KH2PO4	MilliporeSigma	P5655
Liberase TM 研究级酶	MilliporeSigma	5401119001	纯化的胶原酶 I 和 II 的确定混合物，含中等浓度的嗜热菌蛋白酶
M199 培养基	MilliporeSigma	M5017
MgSO4 七水合物	MilliporeSigma	M1880
微量离心机	Fisher Scientific		accuSpin Micro 17
显微解剖剪刀	Roboz Surgical Instrument Co	RS-5980
NaCl	Chem-Impex International	30070
NaHCO3	Acros Organics	424270010
棕榈酸	MilliporeSigma	P0500
青霉素/链霉素（100倍浓缩液）	Gibco	15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）	Cytiva Life Sciences	SH30256.01
排代式移液器 MR-10，10 µL	Mettler Toledo	17008575
带50 mL锥形管转子的制冷离心机	Eppendorf		5810 R
圆底聚丙烯培养管，14 mL	Fisher Scientific	14-956-9A
闪烁计数器	Perkin Elmer		TriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD 闪烁液	Fisher Scientific	SX18-4
振荡水浴锅，30 L 容量	New Brunswick Scientific		型号 G76
无菌细胞滤网，100 µm	Fisher Scientific	22363549
持针钳（拇指式敷料钳）	Roboz Surgical Instrument Co	RS-8120
台盼蓝	Corning	25900CI
可调流速蠕动泵	Fisher Scientific	138762
水浴锅，2–2.5 L 容量