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方法文章

通过胸腺肾包膜移植、CD34+ 细胞注射及细胞因子递送制备人源化小鼠

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DOI：

10.3791/62906

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2021年9月27日

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1The Wistar Institute

本文内容

摘要

人源化小鼠模型能够更准确地模拟人类免疫微环境。本文描述了通过移植人类胸腺组织、注射人类CD34+细胞，并靶向递送人类细胞因子转基因以促进CD34+细胞增殖与分化的途径来构建此类模型的过程。

摘要

动物模型为转化研究提供了至关重要的桥梁 体外 和 体内 生物医学研究。人源化小鼠模型为人源系统的表征提供了桥梁，从而能够更准确地研究发病机制、生物标志物以及许多其他科学问题。在本方法中，将免疫缺陷型 NOD-scid IL2Rγnull（NSG）小鼠植入自体胸腺，并注射肝脏来源的 CD34+ 细胞，随后通过一系列注射递送细胞因子。与其他类似模型相比，本模型通过AAV8或基于DNA的pMV101载体编码的转基因递送细胞因子和生长因子，促进了免疫细胞更佳的重建效果。此外，该模型具有长期稳定性，经重建的小鼠在CD34+ 注射。通过该模型，我们希望提供一种稳定且具有显著效果的方法，用于在小鼠模型中研究免疫治疗和人类疾病，从而表明对可预测性临床前模型的需求。

引言

尽管动物模型加深了人们对细胞和分子系统的理解，但在阐明物种特异性系统（如免疫、生理学及其他病理学领域）的复杂性方面，挑战依然存在。历史上，非人灵长类动物（NHP），如黑猩猩，曾被用于弥补模型研究中的不足；然而，NHP 模型成本高昂且难以获取，尤其是在欧洲已禁止使用这类动物的情况下1。

在成功进行移植手术后，小鼠系统可重建人类免疫系统，这一点已通过淋巴器官的细胞重聚现象得到证实。具有功能性人类免疫系统的小鼠的开发，为在多种情境下开展人类免疫学的转化研究提供了机会。通过将人类细胞和组织移植到免疫缺陷小鼠体内，可成功重建具有功能的人类免疫系统，从而促进对造血作用、免疫学、基因治疗2、传染病3、癌症4以及再生医学5的研究。我们课题组及部分合作者已发表利用该模型开展的研究成果，建立了皮肤黑色素瘤的临床前模型6。该模型具有高度的通用性，可广泛应用于黑色素瘤及免疫治疗研究之外的众多研究领域。

外周血单个核细胞（PBMCs）常用于人源化，因其可有效重建在免疫耐受中具有明确作用的T细胞；然而，由于PBMCs自我更新能力较低且含有大量已定向分化的成熟细胞系，因此常被来源于胎肝的人类干细胞（HSC）产品所替代7。将此类衍生的HSC产品与将人胸腺植入NSG小鼠肾包膜下的操作相结合，可构建支持人类T细胞发育的体系。该模型称为骨髓-肝-胸腺（BLT）模型，具有显著优势，因其能够支持多细胞系造血、在自体胸腺中进行T细胞教育以及实现HLA限制性8。

本论文提出了一种经过改良的BLT模型，额外加入了细胞因子递送。研究表明，促炎性细胞因子能够增强效应免疫细胞的功能，特别是基于IL-15的免疫疗法9。在人源化小鼠（Hu-mice）外周血中，可在注射人CD34+细胞后约8–12周检测到CD45+淋巴细胞，其重建水平明显高于普通NSG小鼠的循环血液。利用腺相关病毒载体递送人IL-3、IL-7和GM-CSF后，与未接受细胞因子处理的小鼠相比，循环中人CD45+细胞水平有所升高。加入DNA Combo II细胞因子（SCF、FLT3、CKIT和THPO）可促进T细胞和髓系细胞的分化10。相较于其他Hu-mice模型，该方法通过递送细胞因子实现了差异化，这一优势已有发表数据支持10。

该模型具备天然和适应性人类免疫反应，已使研究人员能够发表有关治疗耐药性和肿瘤微环境的数据10。只要实验室能够获取组织样本以应用此方法，该人源化小鼠模型便具有巨大潜力，不仅可供其他实验室研究类似领域，还可拓展至免疫治疗及其他临床前研究方向。

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方案

所有涉及动物使用的实验方案均受到威尔斯塔研究所机构动物护理与使用委员会（IACUC）的严格监督。本实验室遵循该委员会及驻场兽医制定的指导方针，以确保所用动物的健康、安全与福利。在实施本方案之前，必须获得兽医和IACUC的批准；根据上述动物福利相关方的建议，操作人员在具体手术技术和动物操作方面可对本方案进行适当调整。

注意：组织样本可冷冻保存，直至准备使用。此外，CD34+ 分离可在肾移植手术当天或次日进行。此信息将决定白消安的注射时间：若计划在分离当天进行手术，则应在接收组织前预先注射白消安以作准备。对30只5至7周龄的雌性NSG小鼠进行处理，每只注射30 mg/kg（100 µL，1x PBS）新鲜配制的骨髓清除药物白消安，腹腔注射，于手术前24小时给予。

1. CD34+ 细胞的分离

  1. 通过将 100 mg 胶原酶/分散酶溶解于 50 mL RPMI1640 中来制备消化液。使用 0.22 µm 真空滤器对消化液进行灭菌。
  2. 将胎肝（>20 周龄）置于 50 mL RPMI1640 培养基中。吸除并弃去培养基，仅在含有肝脏的试管中保留 10 mL。
  3. 在 50 mL 锥形管中，用含 100 µg/mL 抗生素 Primocin 的 RPMI1640 溶液洗涤组织两次，每次洗涤后抽吸去除培养基。抽吸前务必让组织充分沉降至管底。
  4. 将无菌组织筛置于 200 mL 无菌烧杯中。
  5. 将胎肝倒入筛中，并用 10 mL 无菌塑料注射器的末端研磨组织。
  6. 用 50 mL 含 100 µg/mL 抗生素 Primocin 的 RPMI1640 冲洗筛中残留的肝细胞，随后再用 50 mL 含胶原酶/分散酶（2 mg/mL）的 RPMI1640 培养基冲洗。此时 200 mL 烧杯中含有含 Primocin 的 RPMI1640、含胶原酶/分散酶的 RPMI1640 以及匀浆后的肝脏组织。
  7. 将混合液分装至四个 50 mL 锥形管中，于 37 °C 水浴中孵育 1 小时，每 15 分钟轻轻振荡一次。
  8. 在四个 50 mL 锥形管中各加入 15 mL Ficoll。
  9. 小心地将匀浆后的肝脏溶液分层加至 Ficoll 液面上方，每管约加 35 mL。注意不要扰动界面。
  10. 将离心管放入离心机，以 800 × g 离心 1 小时，加速度和刹车设置为最低。
  11. 从离心机中取出离心管，收集界面层细胞（10–15 mL）至两个 50 mL 锥形管中。
  12. 加入 1× PBS 至 50 mL 以洗涤细胞沉淀，300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  13. 用 10 mL ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液重悬沉淀，孵育 5–10 分钟，然后用 1× PBS 补充至管满。
  14. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板在显微镜下手动计数细胞。300 × g 离心 5 分钟。
    注意：若细胞数量低于 5000 万个，肝单个核细胞可直接从此步骤用于注射。
  15. 抽吸去除 PBS，将细胞沉淀重悬于 300 μL 分离缓冲液（含 2 mM EDTA、5 µg/mL BSA 的 1× PBS）中，适用于 100 × 106 个或更少的细胞。若细胞数量超过 100 × 106，则按上述比例计算所需缓冲液体积（例如，细胞数量加倍，缓冲液体积也加倍）。
  16. 加入 100 µL FcR 封闭试剂，孵育 2–5 分钟。
  17. 加入 100 µL CD34 微珠抗体，充分混匀后冰上孵育 30 分钟；15 分钟时手动轻轻振荡混匀。
  18. 加入 7–10 mL 分离缓冲液，并依次通过 100 µm、70 µm 和 40 µm 细胞筛过滤。
  19. 将基于柱的细胞分离器置于磁力架中，在其下方放置一个 15 mL 锥形管以收集穿流液和缓冲液。
  20. 用 500 µL 分离缓冲液预润洗柱子。
  21. 将细胞悬液倒入柱中。
  22. 用已收集在锥形管中的穿流液和缓冲液再次填充柱子。
  23. 用 500 µL 分离缓冲液洗涤柱子 3 次。
  24. 弃去穿流液，更换为一个新的 15 mL 聚苯乙烯管。
  25. 向柱中加入 1 mL 分离缓冲液，将柱子从磁力架上取下，一次性快速推下活塞以洗脱细胞。
  26. 计数细胞，并用 1× PBS 重悬用于注射。置于冰上保存直至使用。

2. 胸腺加工

  1. 用 5–8 mL RPMI1640 洗涤自体胸腺（>20 周龄），让组织自然沉降。小心使用负压吸除上清液，避免接触胸腺组织。重复此步骤一次。
  2. 将胸腺悬浮于 10 mL 室温 RPMI1640 培养基中，加入 Primocin（100 µg/mL）。
  3. 将胸腺转移至经组织处理的培养皿中，确保胸腺完全被含 Primocin 的培养基覆盖。
  4. 在室温下孵育 30–45 分钟。
  5. 用负压吸除含 Primocin 的培养基。用 5–8 mL RPMI1640 洗涤胸腺，吸除上清液后重复洗涤一次。
  6. 将胸腺悬浮于 5–8 mL RPMI1640 中。
  7. 使用两把手术刀将胸腺切成 1 mm × 2 mm 的组织片段，以备移植。
    ​注意：该组织将用于小鼠移植，因此需确保胸腺切片能够相对容易地通过负压吸入和推出注射器及其连接的 22 G Hamilton 针头。

3. 肾包膜下移植与CD34细胞注射

  1. 手术前检查小鼠的一般健康状况。剃除小鼠左侧体侧约 3" × 2" 区域的毛发以暴露手术部位。
  2. 在麻醉诱导舱中使用异氟烷（诱导浓度 5%，维持浓度 2%–3%）对小鼠进行麻醉，随后将每只小鼠从诱导舱转移至带有鼻罩的手术台。
  3. 使用氯己定和酒精消毒棉片对剃毛区域进行消毒。通过夹趾试验确认小鼠已充分麻醉。
  4. 在小鼠脊柱后外侧做一较大切口（5–7 mm），并将皮肤向后翻开。
  5. 此时应能透过筋膜看到脾脏。在筋膜上做一个约 2 mm 的小切口，切口应尽可能小，同时确保肾脏能够完全暴露。
  6. 通过视觉识别脾脏并以其作为标记来确定该切口的位置，因为肾脏本身不可见。
    注意：小鼠肾脏位于脾脏东北象限的一团脂肪组织后方。
  7. 将手（术者）置于小鼠身体对侧、切口的相反侧下方，向上推动以暴露肾脏。调整脂肪组织位置，充分暴露肾脏。
  8. 用同一只手的指头固定暴露的肾脏。如有需要，可使用无菌 1× PBS 润滑暴露的肾脏。
    注意：术者必须使用与接触小鼠体侧不同的手指来抓持肾脏，以维持无菌操作。有关无菌操作的正确维护，请咨询机构兽医。
  9. 与此同时，助手准备装有胎鼠胸腺组织的钝头注射器。用尽可能少的培养基轻轻吸取 2–3 块中等大小的胸腺组织（1 mm × 2 mm）至针尖处，然后将注射器交予术者进行操作。
    注意：胸腺组织块的数量取决于组织大小，通常 2 块足以获得人源化小鼠。
  10. 术者将针头从肾脏被膜的尾端插入，直至到达远端（约 2 mm），使针头可见但不穿透肾脏被膜的头端。助手此时推动注射器活塞完成注射。
  11. 将肾脏及任何暴露的脂肪组织复位至腹腔内。使用一根可吸收缝线（4 号）缝合深部切口，并用兽用粘合胶封闭浅表切口。
  12. 术后通过皮下注射给予镇痛药物缓释型布托啡诺（1 mg/mL）25 µL（剂量为 1 mg/kg）。
  13. 确认小鼠在术后 5 分钟内开始恢复意识。
  14. 在不同笼具之间操作时，更换手套，并使用玻璃珠灭菌器对器械进行灭菌。
  15. 术后 1–3 小时内，通过静脉（IV）注射向小鼠注入 100 µL 人源 CD34+ 细胞（约 100,000 个细胞）。
  16. 手术结束后对小鼠进行一次总体健康检查（通常为第一笼操作后 2 小时），之后在 24 小时和 48 小时再次检查。
  17. 若小鼠行为或生命体征出现异常，需进一步密切监测；一旦通过上述检查节点，可转为较宽松的监测频率（每周 2–3 次）。
  18. 术后一周，通过静脉注射（IV）给予小鼠 100 µL AAV8 编码的人源细胞因子（IL-3、IL-7 和 GM-CSF；2 × 109 基因组拷贝/mL）。
  19. 术后两周，进行质粒 DNA Combo II 的肌肉注射（IM）。
    1. 使用电穿孔仪进行质粒 DNA Combo II（SCF、FLT3、CKIT 和 THPO）的肌肉注射。每只小鼠混合 25 µL SCF（2 mg/mL）、25 µL THPO（2 mg/mL）、25 µL FLT3（2 mg/mL）和 25 µL CKIT（10 mg/mL）。
    2. 每只后肢注射一次，共两次，每次 50 µL，每次注射后立即在注射部位进行电穿孔。

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结果

在成功手术及适当的术后注射后，CD34+ 可通过流式细胞术确认分化情况。手术后约8周，对小鼠进行采血以准备进行FACS检测，此后每2周重复一次，直至人源免疫细胞达到此前所述的特定阈值10简而言之，使用涂有锂和肝素的采血管收集100 mL血液。采用ACK裂解缓冲液裂解红细胞后，细胞用FACS缓冲液（磷酸盐缓冲液、2% FBS和0.1%叠氮化钠）洗涤并离心。将细胞沉淀重悬于100 mL FACS缓冲液中，随后与一组抗体（抗小鼠CD45、抗人CD45、抗CD3、抗CD4、抗CD8和抗CD20）孵育。为区分活细胞与死细胞，使用DAPI对细胞进行染色，并根据FSC-A和SSC-A参数设门圈选淋巴细胞。首先设门筛选活细胞，再从中选择单细胞。在该单细胞活淋巴细胞群体中，我们首先区分人源与小鼠源CD45+ 细胞。CD20+ 和 CD3+ 细胞从人 CD45 中鉴定得出+ 细胞，最后是 CD4+ 和 CD8+ 细胞从 CD3 中被鉴定出来+

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讨论

本文描述了通过将人胎儿胸腺移植至肾包膜下，并随后注射CD34+细胞，以重建人免疫系统，从而制备人源化小鼠的方法。

尽管该实验方案旨在构建最佳模型，但某些步骤对实验成功至关重要。例如，在CD34+细胞分离过程中，操作者必须能够在显微镜下准确识别CD34+细胞。尽管这看似多余，但由于这些细胞的形态特征，自动计数仪并不总能正确识别它们，仪器本身还可能将碎片误判为阳性细胞。因此，手动识别这些细胞至关重要。此外，在肾包膜移植手术中，必须确认胸腺组织确实已进入肾包膜。这一过程可通过视觉观察或触诊来判断：术者应能感觉到胸腺组织片已进入肾脏包膜内。

值得注意的是，该过程存在一些需要注意的事项，这些事项可能决定模型的成败。首先，必须对胎儿组织的质量进行个体化评估，以确定分离出的细胞是否可能对小鼠产生毒性。例如，孕龄超过20周的组织通常质地更坚实，在制备过程中切割更为精确，且降解程度通常较低。这些特征是一般意义上组织质量更优的指标。该技术的第二个注意事项涉及CD34+

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披露

作者声明本稿件不存在利益冲突。

致谢

感谢Wistar流式细胞术中心、分子筛选中心、载体核心实验室和动物设施的支持。本工作得益于米尔亚姆和谢尔顿·阿德尔森医学研究基金会（Dr. Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACK 裂解缓冲液Life Technologies Corporation
BD 微量采血管BD血液采集管
白消安SigmaB2635-25g照射药物；对光敏感
CD34 磁珠Miltenyi Biotec130-046-702抗体磁珠试剂盒；储存于 4 °C
CKITAldevroncustom细胞因子；储存于 -20 °C
胶原酶/分散酶Roche Diagnostics11097113001储存于 4 °C
FcR 封闭试剂Miltenyi Biotec130-046-702抗体磁珠试剂盒；储存于 4 °C
胎儿组织（肝脏和胸腺）Advanced Bioscience Resources当日或次日送达
菲可（Ficoll）GE Healthcare17-1440-03室温储存
FLT3Aldevron125964细胞因子；储存于 -20 °C
镊子VariousVarious
Hamilton 注射器针头VariousVarious22 G；三点式；2" 长度
止血钳VariousVarious
MS 柱Miltenyi Biotec130-042-201磁性分离柱
PBSGibco14190-136室温储存
普利霉素Invivogenamt-pm1抗生素；储存于 4 °C
RPMI 培养基Corning10-040-CM储存于 4 °C
SCFAldevron125962细胞因子；储存于 -20 °C
手术剪VariousVarious
THPOAldevron125963细胞因子；储存于 -20 °C
组织处理用培养皿Corning430167
VetBond 粘合剂3M1469SB粘合剂
Visorb 可吸收缝线Stoelting Co5046可吸收缝线，4 号，19 mm 切割针

参考文献

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