小鼠成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞

摘要

本文介绍了一种优化的黑色素细胞直接重编程系统，以及一种高效、高浓度的病毒包装系统，可确保直接重编程过程顺利进行。

摘要

黑素细胞功能的丧失会导致白癜风，严重影响患者的身体和心理健康。目前，白癜风尚无有效的长期治疗方法。因此，开发一种便捷且有效的白癜风治疗手段势在必行。通过再生医学技术将皮肤细胞直接重编程为黑素细胞，似乎是一种具有前景的新型治疗策略。该方法旨在将患者自身的皮肤细胞直接重编程为功能性黑素细胞，以弥补白癜风患者黑素细胞的缺失。然而，该方法需首先在小鼠模型中进行验证。尽管直接重编程技术已被广泛应用，但目前尚无明确的将细胞直接重编程为黑素细胞的标准操作流程。此外，可用的转录因子数量众多，筛选难度较大。

本文介绍了一种浓缩型慢病毒包装系统方案，用于制备可将皮肤细胞重编程为黑色素细胞的转录因子，包括 Sox10、Mitf、Pax3、Sox2、Sox9 和 Snai2。通过该浓缩慢病毒载体，将上述所有转录因子导入小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），实现 MEFs 向诱导性黑色素细胞（iMels）的直接重编程。 体外此外，研究人员对这些转录因子进行了筛选，并优化了成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞的体系。诱导产生的黑色素细胞（iMels）在基因或蛋白水平上均显著上调了黑色素相关特征标志物的表达。这些结果表明，将成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞可能成为治疗白癜风的一种有效新策略，同时也验证了黑色素细胞发育的机制，为后续进一步实现成纤维细胞向黑色素细胞的直接重编程提供了理论基础。 体内.

引言

白癜风是一种严重影响患者身心健康皮肤疾病。由于代谢异常、氧化应激、炎性介质生成、细胞脱离以及自身免疫反应等多种原因，功能性黑素细胞丢失，黑素分泌停止，从而导致白癜风的发生^1,2。该疾病发病率广泛，尤其在面部影响显著。目前主要治疗方法包括系统性使用糖皮质激素和免疫调节剂。光疗可用于全身性或局部性病变，此外还有手术治疗，如钻孔皮肤移植和自体黑素细胞移植^3,4,5。然而，采用药物治疗和光疗的患者容易复发，且这些疗法的长期疗效较差。手术治疗具有创伤性，且疗效仅中等^2,6。因此，亟需开发一种新的、有效的白癜风治疗策略。

诱导多能干细胞（iPSCs）的重编程过程通过转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的介导，使这些细胞从终末分化状态逆转至多能状态。⁷然而，由于存在致瘤风险以及生产周期较长，该技术在临床应用中受到了质疑⁸直接重编程是一种将一种终末分化细胞转化为....

方案

本研究经江苏大学实验动物管理与使用委员会批准（UJS-IACUC-AP--20190305010）。实验严格遵循国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）制定的标准进行。本研究未涉及人类实验，因此无需获得人类研究伦理委员会的批准。有关试剂的详细信息，请参见材料表。

1. 转录因子的高浓度慢病毒包装系统的构建

1. 病毒浓缩物的制备图1A，B)
   1. 接种 1.5 × 10⁶ 将HEK-293T细胞接种至60 mm培养皿中，并用正常培养基培养（见 表1) 在37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中₂.
      注意：如果需要分批包装病毒，可使用100 mm细胞培养皿（详见 表2).
   2. 24 小时后，确保 HEK-293T 细胞在转导当天达到 80–90% 汇合度，并将培养基更换为 3.5 mL DMEM（每 1 cm² 面积加入 150 µL DMEM）²。将细胞置于含5% CO₂的湿润化培养箱中，在37 °C下孵育₂ 2小时。
      注意：更换的培养基必须不含血清，以便细胞能够 "饥饿....

结果

本文包含一种浓缩型慢病毒包装系统的实验方案，用于产生转录因子的慢病毒，以实现成纤维细胞向黑色素细胞的直接重编程，以及从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）筛选转录因子并直接重编程为黑色素细胞的实验方案。

通过观察感染未浓缩慢病毒（1倍）和浓缩慢病毒（100倍）48小时后HEK-293T细胞中GFP的荧光强度（图1A）或流式细胞术分析结果（图1B），评估高浓度慢病毒制备的成功情况。浓缩病毒的滴度达到10⁸ TU/mL或更高，相对较高（图1C）。

通过转录因子慢病毒感染并结合优化的重编程培养基处理，可将成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞。从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）生成诱导性黑色素细胞（iMels）的实验流程如图2A所示。在直接重编程过程中，细胞形态逐.......

讨论

病毒的质量对于本方案中直接重编程为黑色素细胞的成功至关重要。本方案中包装和浓缩病毒的方法简单且易于重复，不依赖任何其他辅助浓缩试剂。大多数实验室均可成功实施本方案。为确保浓缩病毒的质量，需特别注意以下几点：一是HEK-293T细胞的状态。尽管HEK-293T细胞为永生化细胞，但用于制备浓缩病毒的细胞必须是传代次数在10代以内的健康细胞（随着传代次数增加，病毒滴度会下降）。

另一个关键点是转染试剂（本实验中为脂质体转染试剂lipofectamine）的使用比例。由于加入转染试剂后细胞可能受到损伤，必须反复验证试剂与质粒的比例，以确保细胞处于最佳状态以及病毒的质量。在本系统中，使用2:1的转染试剂与质粒比例最适合HEK-293T细胞进行病毒包装。此外，整个操作过程中的所有步骤均需轻柔处理。由于病毒颗粒在包被后可能被吸附，从而影响病毒滴度，因此在病毒包装过程中不建议对培养皿进行任何基质包被。由于HEK-293T细胞可能发生脱落，更换上清液时必须格外小心，尤其是在收集24小时后的病毒上清液后添加新鲜培养基时。其他需要考虑的因素还包括细胞密度、转染时间的长短以及培养基中的血清含量。这些因素均.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-062	储存于 -20 °C
0.45 μm 滤膜	Millipore	SLHVR33RB
5 mL 聚苯乙烯圆底管	Falcon	352052
95%/100% 乙醇	LANBAO	210106	室温储存
腺嘌呤	Sigma	A2786	储存液浓度 40 mg/mL 工作浓度 24 µg/mL
Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgG2a	Invitrogen	A21137	使用时稀释比例为 1:500
抗生素（青霉素/链霉素）	Gibco	15140-122	储存于 -20 °C
抗 TRP1/TYRP1 抗体	Millipore	MABC592	宿主/同种型：小鼠 IgG2a 种属反应性：小鼠/人 使用时稀释比例为 1:200
抗 TRP2/DCT 抗体	Abcam	ab74073	宿主/同种型：兔 IgG 种属反应性：小鼠/人 使用时稀释比例为 1:200
CHIR99021	Stemgent	04-0004	储存液浓度 10 mM 工作浓度 3 μM
霍乱毒素	Sigma	C8052	储存液浓度 0.3 mg/mL 工作浓度 20 pM
Cy3 山羊抗兔 IgG（H+L）	Jackson Immunoresearch	111-165-144	使用时稀释比例为 1:500
DMEM（高糖）	HyClone	SH30243.01	储存于 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	室温储存
FBS	Gibco	10270-106	储存于 -20 °C 使用前需热灭活
明胶	Sigma	G9391	室温储存
GFP-PURO 质粒（Mitf、Sox10、Pax3、Sox2、Sox9 和 Snai2）	汉恒生物科技有限公司	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	储存于 -20 °C
苏木精	Abcam	ab220365	室温储存
人源 EDN3	American-Peptide	88-5-10A	储存液浓度 100 μM 工作浓度 0.1 μM
氢化可的松	Sigma	H0888	储存液浓度 100 µg/mL 工作浓度 0.5 µg/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	室温储存
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	转染试剂，储存于 4 °C
Masson-Fontana 染色试剂盒	Solarbio	G2032	储存于 4 °C
中性树胶	Solarbio	G8590	储存于 4 °C
多聚甲醛	Sigma	P6148	室温储存
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	室温储存
佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（TPA）	Sigma	P8139	储存液浓度 1 mM 工作浓度 200 nM
聚凝胺（Polybrene）	Sigma	H9268	阳离子聚合物转染试剂；储存液浓度 8 μg/µL 工作浓度 4 ng/µL
嘌呤霉素	Gibco	A11138-03	储存于 -20 °C
重组人 bFGF	Invitrogen	13256-029	储存液浓度 4 μg/mL 工作浓度 10 ng/mL
重组人胰岛素	Sigma	I3536	储存液浓度 10 mg/mL 工作浓度 5 µg/mL
重组人 SCF	R&D	255-SC-010	储存液浓度 200 μg/mL 工作浓度 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	储存于 4 °C
二甲苯	Sigma	1330-20-7	室温储存