本文描述了基于时间分辨荧光共振能量转移（Förster resonance energy transfer）的细胞实验方案，可用于在384孔板体系中对细胞裂解液内源性磷酸化信号转导与转录激活蛋白（STAT）1/3/4/5/6进行简便、特异、灵敏且稳定的定量检测。
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摘要
摘要
Janus激酶（JAK）/信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路在介导细胞对细胞因子和生长因子的反应中发挥关键作用。STAT蛋白主要通过JAK介导的酪氨酸磷酸化而被激活。STAT信号通路的异常激活与多种人类疾病相关，尤其是癌症和免疫相关性疾病。因此，在天然细胞信号环境中监测STAT蛋白磷酸化的能力，对于学术研究和药物发现均具有重要意义。目前用于定量磷酸化STAT蛋白的传统检测方法包括蛋白质印迹法（western blotting）和酶联免疫吸附测定（ELISA）。这些非均相方法操作繁琐、通量低，且蛋白质印迹法常常缺乏可靠性（特异性）。虽然已有均相（免洗涤）检测方法，但成本仍然较高。
本文提供了在384孔板中利用新型THUNDER时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）平台，对贴壁细胞或悬浮细胞裂解液中内源性磷酸化STAT1（Y701）、STAT3（Y705）、STAT4（Y693）、STAT5（Y694/Y699）和STAT6（Y641）水平进行高灵敏度、高稳健性且成本效益优良的检测的详细实验方案。该细胞检测流程简单、快速，专为高通量筛选（HTS）设计。实验方案具有灵活性，仅需少量样本（15 µL），仅需一步试剂添加，且可适用于低通量和高通量应用。每种磷酸化STAT蛋白夹心免疫检测均在优化条件下使用已知激动剂和抑制剂进行验证，能够产生预期的药理学结果和Z'因子值。由于TR-FRET检测为比率型检测且无需洗涤步骤，其重复性显著优于传统方法。综上，这一系列检测方法为细胞处理后特异性磷酸化STAT蛋白的更全面分析，以及JAK/STAT信号通路特异性和选择性调节剂的筛选与表征，提供了新的高性价比工具。
引言
JAK/STAT 信号通路在介导细胞对多种细胞因子、干扰素、生长因子及相关分子的反应中发挥关键作用1,2。这些配体与特定细胞表面受体结合后，可激活JAKs，进而通过磷酸化特定酪氨酸残基激活STAT蛋白。STAT蛋白的磷酸化促使其形成二聚体并转位至细胞核内，在核内调控靶基因的转录。STAT家族包含七个成员：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和 STAT6。这些成员在调控细胞生理过程中发挥复杂而重要的作用，包括增殖、分化、凋亡、血管生成以及免疫系统调节。STAT信号通路的异常激活与多种人类疾病相关，尤其是癌症和免疫相关性疾病3,4。因此，在天然细胞信号环境中评估STAT蛋白磷酸化水平的能力，对于基础研究和药物发现均具有重要意义。
迄今为止，用于检测细胞内磷酸化蛋白（包括STAT蛋白）水平的传统方法均为基于抗体的技术，主要包括蛋白质印迹（western blotting）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和磷酸化流式细胞术。这些异质性方法耗时耗力、通量低、易出错，且结果往往不可靠。例如，特异性问题）在蛋白质印迹实验中的情况5相比之下，均相检测所需....
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方案
1. 细胞培养
- 将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养，使用添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（HeLa和A431细胞）或添加15% FBS的RPMI培养基（U266B1细胞）。培养细胞至融合度达到70-80%，然后用胰蛋白酶消化，传代或用于后续检测。
注意：培养基中含有酚红。在进行检测前，所有细胞系均未进行无血清饥饿处理。
2. 使用贴壁细胞双板检测方案进行刺激剂或抑制剂滴定
注意：本实验通过测试化合物的系列稀释浓度生成浓度-反应曲线，以确定刺激剂或抑制剂的效价。
- 细胞接种
- 将细胞以预优化的密度（STAT3 和 STAT6 实验：每孔 40,000 个 HeLa 细胞；STAT5 实验：每孔 75,000 个 A431 细胞）加入适量培养基中，每孔接种 50 µL 至 96 孔组织培养处理板中。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。
注意：最佳细胞密度和培养孵育时间需自行确定。
- 将细胞以预优化的密度（STAT3 和 STAT6 实验：每孔 40,000 个 HeLa 细胞；STAT5 实验：每孔 75,000 个 A431 细胞）加入适量培养基中，每孔接种 50 µL 至 96 孔组织培养处理板中。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。
- 测试化合物的稀释
- 在聚丙烯 96 孔板中，用无血清培养基对测试化合物进行连续稀释（半对数间隔稀释），制备成中间浓度为 2 倍的系列稀释液，覆盖 12 个孔。
注意：建议至少进行....
- 在聚丙烯 96 孔板中，用无血清培养基对测试化合物进行连续稀释（半对数间隔稀释），制备成中间浓度为 2 倍的系列稀释液，覆盖 12 个孔。
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结果
每项THUNDER TR-FRET检测均通过使用JAK/STAT通路特异性激活剂或抑制剂处理贴壁细胞（HeLa或A431）或悬浮细胞（U266B1），并在适用情况下检测特定磷酸化及总STAT蛋白水平，进行药理学验证。检测采用384孔板格式，使用双板转移方案及预优化的检测条件进行。图3、图4、图5、图6和图7总结了所有STAT检测获得的代表性浓度-反应曲线。总体而言，各磷酸化STAT检测的激动剂和抑制剂浓度-反应曲线均表现出强烈的TR-FRET信号、宽动态范围、低孔间变异系数（通常≤5%）以及可接受的信号-背景比（S/B）。本文报告的EC50和IC50值均处于预期范围之内。
使用JAK激活剂IFNα2b（磷酸化STAT1、磷酸化STAT3和磷酸化.......
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讨论
与传统的磷酸化蛋白分析方法（如蛋白质印迹和基于ELISA的方法）相比，THUNDER TR-FRET细胞检测的工作流程更简单、快速，所需样本量少（15 µL），专为384孔板的高通量筛选（HTS）设计，且高度适用于自动化操作。该检测方案具有良好的灵活性，可轻松适用于中高通量应用。检测可采用双板转移法或单384孔板法进行。在双板转移法中，细胞在一块细胞培养板中接种、处理并裂解，随后将裂解液转移至另一块白色检测板（半面积96孔或384孔板）进行分析。而在单384孔板法中，整个操作流程均在同一孔内完成，无需液体转移步骤。通过按比例减少反应体积，该检测还可轻松适配1536孔板格式。无论采用何种检测方案，仅需配制三种试剂溶液，无需洗涤步骤，且均可按照“仅添加”"addition-only"的流程进行操作，所需人工操作时间极短。
进行任何基于细胞的检测时，一个关键步骤是优化细胞培养和处理条件16。在开展检测前，必须对细胞数量和处理条件进行仔细优化，因为这些关键参数通常因细胞系和磷酸化蛋白的不同而有所差异。优化这些参数有助于最大化检.......
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披露
竞争利益：Jaime Padros、Mireille Caron 和 Geneviève Chatel 是 BioAuxilium Research 的员工，该公司生产本研究中使用的 THUNDER TR-FRET 检测试剂盒。此外，Jaime Padros 和 Mireille Caron 是 BioAuxilium Research 的股东。这并不影响作者遵守 JoVE 关于共享数据和材料的所有政策。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔微孔板，透明，平底，聚苯乙烯，组织培养处理，无菌 | Corning | 3595 | 在使用双板检测方案时用于细胞培养。也可使用其他细胞培养用96孔板 |
| 384孔微孔板，白色，低体积 | PerkinElmer | 6007290 | 在使用双板或单板检测方案时用于TR-FRET检测。也可使用其他低体积白色384孔板 |
| A431细胞系 | ATCC | CRL-1555 | |
| 粘性微孔板封板膜 | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco’s改良Eagle培养基（DMEM） | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET兼容含酚红的培养基 |
| EnVision Xcite多功能微孔板检测仪 | PerkinElmer | 2104-0020A | 该检测可在配备TR-FRET功能的各种微孔板检测仪上进行 |
| 盐酸厄洛替尼 | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon组织培养处理细胞培养瓶 | Fisher | 13-680-65 | |
| 胎牛血清（FBS） | Wisent | 098-150 | |
| HeLa细胞系 | ATCC | CCL-2 | |
| JAK抑制剂1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| 轨道微孔板振荡器 | 多种选择可用 | 不适用 | |
| 重组人EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| 重组人IFNα2b | ProSpec | CYT-460 | |
| 重组人IL-4 | R&D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI） | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET兼容含酚红的培养基 |
| THUNDER 磷酸化STAT1 (Y701) + 总STAT1 TR-FRET细胞信号检测试剂盒 | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER 磷酸化STAT3 (Y705) + 总STAT3 TR-FRET细胞信号检测试剂盒 | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER 磷酸化STAT4 (Y693) TR-FRET细胞信号检测试剂盒 | BioAuxilium Research | KIT-STAT4P-500 | |
| THUNDER 磷酸化STAT5 (Y694/Y699) + 总STAT5 TR-FRET细胞信号检测试剂盒 | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER 磷酸化STAT6 (Y641) + 总STAT6 TR-FRET细胞信号检测试剂盒 | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| 0.05%胰蛋白酶/EDTA | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1细胞系 | ATCC | TIB-196 | |
| 超纯水 | NA | NA | 使用Milli-Q级水（18 MΩ.cm）稀释裂解缓冲液和检测缓冲液 |
参考文献
- Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its brea....
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