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使用微电极阵列记录脊髓伤害性感觉回路中的网络活动

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DOI：

10.3791/62920

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2022年2月9日

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1School of Biomedical Sciences and Pharmacy, University of Newcastle, 2School of Electrical Engineering, University of Newcastle

本文内容

摘要

本文概述了联合使用微电极阵列技术和4-氨基吡啶诱导的化学刺激方法，用于研究脊髓背角网络水平的伤害性感受活动。

摘要

脊髓背角（DH）中特定类型神经元的功能及其连接性正在被迅速阐明，这为理解脊髓疼痛信息处理背后的神经环路提供了日益详尽的视角。然而，这些连接对背角更广泛神经网络活动的影响仍知之甚少，因为大多数研究集中于单个神经元和小型微环路的活动。相比之下，微电极阵列（MEAs）能够同时监测多个细胞的电活动，从而以高空间和时间分辨率记录神经活动。本文描述了在小鼠脊髓切片中使用微电极阵列，通过4-氨基吡啶（4-AP）化学激活背角环路以研究其活动的方法。所诱发的节律性活动局限于浅层背角，具有时间稳定性，可被河豚毒素阻断，并可在不同切片方向下进行研究。该实验体系为研究来自正常动物、慢性疼痛动物模型以及伤害感受功能发生遗传改变的小鼠组织中背角环路活动提供了平台。此外，在4-AP刺激的脊髓切片中进行MEA记录，可作为快速筛选工具，用于评估新型镇痛化合物干扰脊髓背角活动的能力。

引言

脊髓背角中特定类型抑制性和兴奋性中间神经元的作用正在被快速揭示1,2,3,4中间神经元共同构成了背角（DH）中超过95%的神经元，参与包括伤害性感受在内的感觉信息处理。此外，这些中间神经元环路在决定外周信号是否沿神经轴上行传递至大脑并产生痛觉感知方面具有重要作用。5,6,7迄今为止，大多数研究通过结合单细胞或整体生物水平的分析方法，探讨了DH神经元的作用 体外 细胞内电生理学、神经解剖学标记和 体内 行为学分析1,3,8,9,10,11,

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方案

研究采用3至12个月大的雄性和雌性C57BL/6小鼠进行。所有实验操作均依照纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会批准的方案（编号A-2013-312和A-2020-002）进行。

1. 体外 电生理学

  1. 脊髓切片制备与记录用溶液的配制
    1. 人工脑脊液
      ​注意：人工脑脊液（aCSF）用于界面式孵育室，切片在记录开始前以及实验过程中均保存于其中，同时作为灌流液和药物稀释液。详细成分见表1。
化学物质aCSF (mM)aCSF (g/100 mL)蔗糖替代aCSF (mM)蔗糖替代aCSF (g/100 mL)高钾aCSF (mM)

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结果

脊髓背角神经网络活动模型
应用4-AP可稳定诱导脊髓背角（DH）产生同步节律性活动。此类活动表现为增多的单元放电活动（EAPs）和局部场电位（LFPs）。后者是一种低频波形信号，此前已在多电极阵列（MEA）记录中有所描述30。给药后EAP和/或LFP活动的变化反映了神经元活动的改变。EAPs和LFPs的示例见图3B和图4。本文重点关注EAP/LFP数据的以下参数或特征：放电频率、总放电次数、活跃电极数量、通过多个电极检测到的同时事件数量所表征的同步性、相连相邻电极的数量，以及相邻电极间连接的强度。代表性结果见表3以及图3、图4、图5、图6、

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讨论

尽管脊髓背角（DH）在伤害性信号的传递、信息处理以及形成疼痛相关的行为和情绪反应中具有重要作用，但该区域内的神经环路仍远未被充分阐明。研究这一问题的关键挑战在于构成这些环路的神经元群体具有高度异质性6,31,32。近年来，以光遗传学和化学遗传学为代表的转基因技术取得了进展，正逐步揭示这些重要的神经连接，并定义处理感觉信息的微环路1,2,3,4,8,9,10,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（NHMRC）（资助号 631000、1043933、1144638 和 1184974，授予 B.A.G. 和 R.J.C.）以及亨特医学研究所（资助号授予 B.A.G. 和 R.J.C.）提供资金支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-氨基吡啶Sigma-Aldrich275875-5G
100% 乙醇赛默飞世尔科技AJA214-2.5LPL
CaCl2 1MBanksia Scientific0430/1L
Carbonox（碳酰气——95% O₂ 和 5% CO₂）2，5% CO₂2)Coregas219122
弯头长柄弹簧剪精细科学工具15015-11
定制气液界面培养室
胎牛血清赛默飞世尔科技10091130
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-30
葡萄糖赛默飞世尔科技AJA783-500G
马血清赛默飞世尔科技16050130
倒置显微镜ZeissAxiovert10
KCl赛默飞世尔科技AJA383-500G
氯胺酮CevaKETALAB04
大型手术剪Fine Science Tools14007-14
Loctite 454 瞬干胶螺栓与工业用品L4543G
MATLABMathWorksR2018b
多电极阵列，三维多通道系统60-3DMEA100/12/40iR-Ti，60-3DMEA200/12/50iR-Ti60个氮化钛（TiN）电极，含1个内部参比电极，排列成8×8方阵。电极直径为12 µ毫米直径，40 µm (100/12/40) 或 50 µ米（200/12/50）高且等距排列的100个 µm (100/12/40) 或 200 µ米（200/12/50）间隔
MEA前置放大器多通道系统MEA2100-HS60
MEA接口板多通道系统MCS-IFB 3.0 多重启动
MEA 网络多通道系统ALA HSG-MEA-5BD
MEA灌流系统多通道系统PPS2
平面MEA多通道系统60MEA200/30iR-Ti，60MEA500/30iR-Ti60个氮化钛（TiN）电极，含1个内部参比电极，排列成8×8方形网格（200/30）或6×10矩形网格（500/30）。电极直径为30 µ微米，直径且等距间隔200 µ米（200/30）或500 µm（500/30）间隔。
MgCl₂2赛默飞世尔科技AJA296-500G
显微镜相机MoticMoticam X Wi-Fi
多通道分析仪软件多通道系统V 2.17.4
多通道实验者软件多通道系统V 2.17.4
NaCl赛默飞世尔科技AJA465-500G
NaHCO₃3赛默飞世尔科技AJA475-500G
NaH2PO4赛默飞世尔科技ACR207805000
咬骨钳Fine Science Tools16021-14
小型弹簧剪精细科学工具91500-09
小型手术剪Fine Science Tools14060-09
蔗糖赛默飞世尔科技AJA530-500G
超级胶水氰基丙烯酸酯粘合剂
河豚毒素AbcamAB120055
减振台纽波特VH3048W-OPT
振动切片机LeicaVT1200 S

参考文献

  1. Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190(2019).
  2. Smith, K. M., et al.

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