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方法文章

使用微电极阵列记录脊髓伤害性感觉回路中的网络活动

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DOI：

10.3791/62920

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2022年2月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences and Pharmacy, University of Newcastle, 2School of Electrical Engineering, University of Newcastle

本文内容

摘要

本文概述了联合使用微电极阵列技术和4-氨基吡啶诱导的化学刺激方法，用于研究脊髓背角网络水平的伤害性感受活动。

摘要

脊髓背角（DH）中特定类型神经元的功能及其连接性正在被迅速阐明，这为理解脊髓疼痛信息处理背后的神经环路提供了日益详尽的视角。然而，这些连接对背角更广泛神经网络活动的影响仍知之甚少，因为大多数研究集中于单个神经元和小型微环路的活动。相比之下，微电极阵列（MEAs）能够同时监测多个细胞的电活动，从而以高空间和时间分辨率记录神经活动。本文描述了在小鼠脊髓切片中使用微电极阵列，通过4-氨基吡啶（4-AP）化学激活背角环路以研究其活动的方法。所诱发的节律性活动局限于浅层背角，具有时间稳定性，可被河豚毒素阻断，并可在不同切片方向下进行研究。该实验体系为研究来自正常动物、慢性疼痛动物模型以及伤害感受功能发生遗传改变的小鼠组织中背角环路活动提供了平台。此外，在4-AP刺激的脊髓切片中进行MEA记录，可作为快速筛选工具，用于评估新型镇痛化合物干扰脊髓背角活动的能力。

引言

脊髓背角中特定类型抑制性和兴奋性中间神经元的作用正在被快速揭示1,2,3,4中间神经元共同构成了背角（DH）中超过95%的神经元，参与包括伤害性感受在内的感觉信息处理。此外，这些中间神经元环路在决定外周信号是否沿神经轴上行传递至大脑并产生痛觉感知方面具有重要作用。5,6,7迄今为止，大多数研究通过结合单细胞或整体生物水平的分析方法，探讨了DH神经元的作用 体外 细胞内电生理学、神经解剖学标记和 体内 行为学分析1,3,8,9,10,11,12,13,14这些方法极大地推进了人们对特定神经元群体在疼痛处理中作用的理解。然而，在理解特定细胞类型和小型大环路如何在微环路水平上影响大量神经元，进而调控背角的输出、行为反应及疼痛体验方面，仍存在研究空白。

一种可用于研究宏观回路或多层次细胞功能的技术是微电极阵列（microelectrode array, MEA）15,16。几十年来，MEA 已被用于研究神经系统功能17,18。在脑组织中，该技术促进了神经元发育、突触可塑性、药理学筛选以及毒性检测等方面的研究17,18。根据 MEA 的类型，其既可用于体外（in vitro）也可用于体内（in vivo）应用。此外，MEA 技术发展迅速，目前已可提供多种不同电极数量和排列方式的阵列19。MEA 的一个关键优势在于，可通过多个电极以高空间和时间精度同时记录大量神经元的电活动15,16。这使得研究人员能够在控制条件以及局部施加化合物的情况下，更全面地观察神经元在回路和网络中的相互作用。

一个挑战是 体外 DH 制备的一个问题是持续的活动水平通常较低。在此，通过使用电压门控 K 通道，在脊髓 DH 电路中解决了这一挑战。+ 通道阻滞剂4-氨基吡啶（4-AP），用于化学激活背角环路。该药物既往已被用于在急性脊髓切片中诱导背角产生节律性同步电活动，并在急性条件下应用 体内 条件20,21,22,23,24这些实验采用单细胞膜片钳和细胞外记录或钙成像技术来表征4-AP诱导的活动20,21,22,23,24,25综上所述，本研究证实了兴奋性与抑制性突触传递以及电突触在4-AP诱导的节律性活动中的必要性。因此，4-AP反应被视为一种揭示具有生物学意义的固有多突触背角环路的方法，而非单纯的药物诱导假象。此外，4-AP诱导的活动对镇痛药和抗癫痫药物的反应特征与神经病理性疼痛状态相似，已被用于提出新的以脊髓为基础的镇痛药物靶点，如连接蛋白（connexins）。20,21,22.

本文描述了一种结合微电极阵列（MEA）和使用4-AP化学激活脊髓背角（DH）的方法，用于在宏观回路或网络水平上研究伤害性感受环路。该方法为在正常状态及神经病理性“疼痛样”条件下研究伤害性感受环路提供了稳定且可重复的平台。此外，该制备方法还可广泛应用于已知镇痛药物在环路水平作用的检测，以及在脊髓过度兴奋状态下对新型镇痛药物的筛选。

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方案

实验采用3至12月龄的雄性和雌性c57Bl/6小鼠进行。所有实验操作均依照纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会的规定执行（方案编号：A-2013-312 和 A-2020-002）。

1. 体外电生理学

  1. 脊髓切片制备与记录用溶液的配制
    1. 人工脑脊液
      ​注：人工脑脊液（aCSF）用于界面式孵育 chamber，切片在记录开始前以及实验过程中均保存于此，并用作灌流液和药物稀释液。详细成分见表1。
化学物质aCSF (mM)aCSF (g/100 mL)蔗糖替代aCSF (mM)蔗糖替代aCSF (g/100 mL)高钾aCSF (mM)高钾aCSF (g/100 mL)
氯化钠 (NaCl)1180.690--1180.690
碳酸氢钠 (NaHCO3)250.210250.210250.210
葡萄糖100.180100.180100.180
氯化钾 (KCl)2.50.0192.50.0194.50.034
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)10.01210.01210.012
氯化镁 (MgCl2)10.0110.0110.01
氯化钙 (CaCl2)2.50.0282.50.0282.50.028
蔗糖--2508.558--

表1：人工脑脊液成分。 缩写：aCSF = artificial cerebrospinal fluid。

  1. 通过将上述试剂（除 CaCl2 外）按所需量加入 2 L 蒸馏水中，配制含以下成分的 aCSF（单位：mM）：118 NaCl、25 NaHCO3、10 葡萄糖、2.5 KCl、1 NaH2PO4、1 MgCl2 和 2.5 CaCl2。
  2. 将上述溶液用含 95% O2 和 5% CO2 的混合气体（carbogen）通气 5 分钟，然后加入 CaCl2。
    注意：此步骤可防止 CaCl2 沉淀析出，即溶液不应变浑浊。实验过程中如需施加药物，应将药物储备液用 aCSF 稀释至所需终浓度。
  1. 蔗糖替代的人工脑脊液
    注意：在解剖和脊髓切片过程中使用蔗糖替代的人工脑脊液（aCSF）。如其名称所示，以蔗糖替代 NaCl，可在保持渗透压的同时减少这些操作过程中的神经元兴奋性。详细成分见表1。
    1. 通过将上述所有试剂（除 CaCl2 外）按所需量加入 300 mL 蒸馏水中，配制含有以下成分（单位为 mM）的人工脑脊液：250 蔗糖、25 NaHCO3、10 葡萄糖、2.5 KCl、1 NaH2PO4、1 MgCl2 和 2.5 CaCl2。
    2. 用碳氧混合气体（carbogen）鼓泡 5 分钟，然后加入 CaCl2。
    3. 将溶液置于 -80 °C 冰箱中冷冻约 40 分钟，直至形成浆状物。避免完全冻结，并在浆状状态下使用。
  1. 微电极阵列准备
    注意：MEA 的接触表面需要预处理以使其具有亲水性。
    1. 实验前，向 MEA 孔中加入胎牛血清（FBS）或马血清（HS），孵育 30 分钟。
    2. 吸除 FBS 或 HS，并用蒸馏水彻底冲洗 MEA，约冲洗五次，直至蒸馏水不再起泡。最后用 aCSF 填充孔内，备用。
  2. 急性脊髓切片制备
    注意：小鼠脊髓切片的制备方法如 Smith 等人先前所述2。理想情况下，去除腰骶膨大区域的操作应在 8–10 分钟内完成（如下步骤 1.3.2–1.3.11）。
    1. 以 100 mg/kg 剂量的氯胺酮（腹腔注射）深度麻醉小鼠，随后使用大型手术剪进行断头。
    2. 在髋部水平的皮肤上做一个小切口，剥离腹部皮肤。将切口两侧的皮肤向前牵拉，直至完全去除皮肤，范围从胸廓顶端至骨盆顶端（包括腹侧和背侧）。
    3. 将尸体置于冰上，采用腹侧入路暴露脊柱：去除所有内脏，并在胸骨外侧剪断肋骨。
    4. 去除腹侧肋骨、两侧肩胛骨（在约 T2 水平剪除）以及下肢和骨盆（在约骶骨顶部剪除）。
    5. 将脊柱和肋骨组织转移至盛有冰冻蔗糖 aCSF 的解剖浴槽中。用针固定组织的四个角（腹面朝上），针穿过下背部肌肉及附着的上部肋骨进行固定。
    6. 使用咬骨钳去除覆盖在椎体腹侧表面的所有肌肉和结缔组织，识别位于腰骶膨大上方的椎体区域，该区域大致对应 T12 至 L2 椎体水平。
    7. 切除位于腰骶膨大区域尾侧的一个椎体，以暴露位于椎管内的脊髓。
    8. 使用弯头弹簧剪，在将椎体向前牵拉的同时，双侧剪开椎弓根，分离椎体的腹侧和背侧部分，从而暴露脊髓。
    9. 当椎体被移除并暴露出腰骶膨大后，小心地用弹簧剪清除残留的固定脊髓的神经根，直至脊髓自由漂浮。
    10. 在腰骶膨大区域的头端和尾端较远处进行切断，分离出目标脊髓段，使其“自由漂浮”。
      注意：切片的最佳方向将决定脊髓后续用于切片时的安装方式（图 1）。
    11. 对于横切切片，通过附着的神经根提起腰骶段，将其放置在一个预先切割好的聚苯乙烯（Styrofoam）块（1 cm × 1 cm × 1 cm）上，该块中心有一浅槽。使用氰基丙烯酸酯粘合剂（见材料表）将组织块和脊髓固定在切片平台上，并将其放入盛有冰冻蔗糖 aCSF（悬浮液）的切片浴槽中。
      注意：浅槽有助于固定和定向脊髓，使背侧朝上，脊髓的胸段位于组织块底部。
    12. 对于矢状切片，在切片平台上涂一条细的氰基丙烯酸酯粘合剂，通过附着的神经根提起腰骶膨大，将脊髓沿胶线放置，确保一侧外侧面粘附在胶中，另一侧朝上。随后将其放入盛有冰冻蔗糖 aCSF（悬浮液）的切片浴槽中。
    13. 对于水平切片，在切片平台上涂一条细的氰基丙烯酸酯粘合剂。通过附着的神经根提起腰骶膨大，将腰骶膨大沿胶线放置，确保腹侧表面粘附在胶中，背侧表面朝上。利用附着的神经根调整脊髓位置。将其放入盛有冰冻蔗糖 aCSF（悬浮液）的切片浴槽中。

脊髓切片示意图：横切、矢状、水平切面显示背角位置。
图1：脊髓切片方向、固定与切割方法。（A）横切切片需要使用带有支撑凹槽的泡沫塑料切割块。将脊髓置于凹槽内，背侧朝远离切割块的方向，紧贴支撑面。用氰基丙烯酸酯胶将脊髓和切割块一起粘附于切片台上。（B）制备矢状切片时，先在切片台上涂一条薄层氰基丙烯酸酯胶，然后将脊髓侧面向下置于胶上。（C）制备水平切片时，先在切片台上涂一条薄层氰基丙烯酸酯胶，然后将脊髓腹侧朝下置于胶上。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用振动切片机获取300 µm厚的切片（L1-L5，无论方向如何均保持相同厚度），设置参数如下：速度0.06 mm/s，振幅2.50 mm，并校准至高度振幅偏差在±0.02范围内。
  2. 将切片转移至含有充氧人工脑脊液（aCSF）的气液界面孵育 chamber 中。
  3. 记录前，在室温（20–24 °C）下孵育切片1小时，使其达到平衡状态。
  1. 微电极阵列记录
    注意：以下步骤详细说明了如何从脊髓切片的微电极阵列（MEA）实验中记录数据。可根据实验需求选择多种MEA设计。本实验所用MEA的设计细节见表2和图2。平面型和三维（3D）MEA的详细设计信息分别由Egert 等26和Thiebaud 等27发表。两种类型的MEA均由60个氮化钛电极组成，具有氮化硅绝缘层以及氮化钛导线和接触焊盘。
    1. 实验装置
      1. 打开计算机和接口板，启动记录软件。
      2. 加载预先组装的记录模板（图3A）。在记录器标签页中为当天的数据文件命名。
      3. 在整个实验过程中，持续用碳合气（5% CO2, 95% O2）向aCSF通气。
      4. 开启由蠕动泵控制的灌流系统。将进液管插入aCSF中，出液端放入废液杯中。用aCSF预灌流管路。
      5. 通过将储备液用50 mL aCSF稀释至所需终浓度（例如，4-AP为200 µM），配制4-AP及其他药物溶液。
      6. 将药物溶液放入药物槽中，并用碳合气持续通气。
    2. 4-AP活性
      1. 孵育完成后，使用装有aCSF的大口径巴斯德移液管将单个切片从孵育器中转移出来。
      2. 将切片放入MEA槽中，并加入额外的aCSF。
      3. 使用细短毛画笔将切片定位在60电极记录阵列上方。避免画笔接触电极或将组织在电极表面拖动，尤其是在使用3D阵列时。
        注意：根据MEA布局，此步骤可在显微镜辅助下或不借助显微镜完成，以实现精确定位。
      4. 切片定位后，在其上方放置一个带重物的网状固定器，以固定组织并促进其与MEA电极的良好接触。
        注意：放置网状固定器后，可能需要重新调整切片位置。
      5. 将MEA放入记录头阶段（图2A,B）。
      6. 使用倒置显微镜（2倍放大）检查切片在电极上的位置，确认尽可能多的电极位于浅层背角（SDH）下方。确保至少有2–6个电极不与切片接触，因为这些电极在分析过程中对噪声扣除和伪迹识别至关重要（图2E）。
      7. 打开相机并连接至设备，拍摄切片相对于MEA的参考图像，供后续分析使用。
      8. 在记录软件中点击开始DAQ，并确认所有电极均接收到清晰信号。
        注意：若信号噪声较大，可断开头阶段连接，用70%乙醇清洁MEA接触焊盘和金质弹簧触点（使用实验室擦拭纸确保清洁后焊盘和触点完全干燥）。若信号仍存在噪声，可在记录软件中关闭故障电极，或记录下这些电极以便后续分析时排除。
      9. 将灌流系统的进液管和出液管连接至MEA槽（此前已充满aCSF），并开启灌流系统。检查流速，理想流速为每分钟4–6倍浴液体积，并确保流出量充足以防止灌流液溢出。
      10. 让组织平衡5分钟，然后记录5分钟原始未滤波的基线数据。
      11. 将灌流进液管从aCSF切换至4-AP溶液，等待12分钟，使4-AP诱导的节律性活动达到稳态（2分钟使药物进入浴槽，10分钟使活动达到峰值并趋于平稳）。
      12. 记录5分钟4-AP诱导的活动。准备好进行后续记录，以测试其他药物或评估4-AP活性的稳定性。
微电极阵列布局
微电极阵列型号60MEA 200/30iR-Ti60-3DMEA 100/12/40iR-Ti60-3DMEA 200/12/50iR-Ti60MEA 500/30iR-Ti
平面或三维（3D）平面3D3D平面
电极网格8 x 88 x 88 x 86 x 10
电极间距200 µm100 µm200 µm500 µm
电极直径30 µm12 µm12 µm30 µm
电极高度（3D）N/A40 µm50 µmN/A
实验类型横切片横切片矢状面 + 水平面矢状面 + 水平面

表2：微电极阵列布局。

MEA 设置与示意图；用于组织信号分析的灌流系统与电极阵列。
图2组织在微电极阵列上的定位 (A图像显示打开的MEA前置放大器，其中已放置好MEA。B相同于 A 使用MEA记录电极头并连接组织灌注系统。C）图像显示了制造商提供的MEA。图中标出了与头级装置的金弹簧接触的焊盘，以及用于盛放组织灌流液和组织切片的MEA组织浴槽。中心红色方框标示的区域是电极阵列的位置。D示意图展示了本研究中使用的两种MEA电极构型，更多细节见下文 表 2参考电极用蓝色梯形表示。左侧MEA电极布局显示为60电极方形排列，该配置在本文所述的工作模型60MEA200/30iR-Ti中最为常用 30 μm 直径电极间距 200 μm 分开，或 200 μm 间隔的 100 μm 带电极的间隔式三维微电极阵列（60MEA200/12/50iR-Ti 和 60MEA100/12/40iR-Ti） 12 μm 直径以及 50 μm 或 40 μm 高。左侧MEA电极布局显示为6 x 10电极矩阵阵列——60MEA500/30iR-Ti。E60MEA100/12/40iR-Ti 方阵列微电极阵列上放置横切脊髓切片用于记录的高倍显微图像。切片覆盖于第3至第8行电极之上。顶部电极行未接触任何组织，用作参考电极。脊髓背角（SDH）区域呈半透明带状结构。在此示例中，SDH覆盖微电极阵列的第4、5、6行以及第2、3、4、5和7列电极。比例尺 = 200 µm缩写：MEA = 微电极阵列；SDH = 浅层背角 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 更换切片
    1. 每次记录结束后，用 aCSF 冲洗管路。
    2. 将 MEA 从记录头stage上取下。
    3. 从 MEA 记录槽中取出网状固定器及脑片组织，用 aCSF 充分冲洗，然后按照上述步骤更换新的脑片继续实验。

2. 数据处理与分析

注意：以下步骤详细说明了如何在脊髓切片的多电极阵列（MEA）实验中使用分析软件。60个电极中的一个作为内部参考电极（在图2 C,D中以梯形标记），其余59个电极中有4至25个位于成年小鼠脊髓切片的脊髓背角（SDH）下方。后续分析将从该区域的原始信号中检测细胞外动作电位（EAP）和局部场电位（LFP）波形（示例见图3B）。

  1. 原始数据处理
    1. 打开分析软件并载入预先制作好的分析布局（图3B).
    2. 打开目标文件，取消选择参考电极（8 × 8 MEA 配置中的电极 15 或 6 × 10 MEA 配置中的电极 E1）以及任何被认为噪声过大的电极。
    3. 设置分析的时间窗口（0:00 → 5:00 分钟）。
    4. 移动到 跨通道滤波器 标签。选择 复杂参照 并选择 参比电极 根据实验过程中拍摄的图像和记录的笔记（例如，未被组织覆盖的电极）进行应用和检查。操作时请按 探索 在继续之前。
    5. 移动到 EAP 滤膜 标签并施加 2nd 使用200 Hz截止频率的高通巴特沃斯滤波器去除LFP活动。
    6. 移动到 LFP 滤波器 标签并施加 2nd 使用四阶带通巴特沃斯滤波器（频率范围为0.5-4 Hz）去除EAP活动。
    7. 移动到 EAP 检测器 标签并选择 自动阈值. 蜱虫数量上升 和 下降沿 盒子并设置 死区时间 至 0.5 ms。
    8. 设置 阳性 和 负阈值 根据数据。通过返回来检查数据 原始数据分析仪 屏幕，移动时间标记，然后返回到 EAP 检测器 标签并按压 探索重复上述步骤，直至确认设定的检测阈值能够捕获EAPs，同时避免捕获噪声或非生理活动。使用参考电极识别噪声或非生理活动。
      注意：必须确保在不会产生生理活动的参考电极中检测到的胞外动作电位（EAP）数量尽可能少。然而，基线的微小偏移可能被错误地识别为EAP。与此同时，仍需尽可能最大化在活性电极中检测到的真实事件数量。
    9. 移动到 LFP 检测器 标签，选择 手动阈值，蜱虫 上升 和 下降沿 盒子，并设置 死时间 至 3 ms。
    10. 重复步骤 2.1.8，选择一个具有 LFP 活动的电极。满意后，选择 应用于所有 因为手动设定阈值时，阈值仅应用于单个电极。
    11. 在检查局部场电位（LFP）数据时 检测器 标签，记录单个局部场电位（LFP）波形中阈值穿越的最大次数以及该LFP波形中阈值穿越之间的最大时间间隔，以用于后续分析。
    12. 按压 开始分析.
    13. 分析完成后，转至 EAP 分析仪 标签并导出数据。在另一侧同样操作。 LFP分析仪 表。
    14. 对同一组织切片的所有其他文件重复此过程。
    15. 数据导出后，将文件转换为 xlsx 格式，以便所用的编程脚本能够读取。文件命名需遵循以下约定，以确保提供的脚本可正确读取：实验名称（例如，sample data）- 切片编号（例如，S1）- 记录编号（例如，R1）- 活动类型（例如，spikes 或 SPs，分别对应 EAPs 或 LFPs）。
      注意：此处描述的EAP分析将单个通道的放电视为单一总体，尽管这种活动通常源于记录电极附近多个邻近神经元的共同作用。若需确定参与某一通道EAPs的神经元数量，可采用其他文献中所述的多单位峰电位分类技术，根据动作电位波形特征区分不同的峰电位群体。28.

MEA 系统中的神经信号处理、电生理数据与尖峰分析示意图。
图 3：数据记录与分析工具布局，以及显示细胞外动作电位和局部场电位波形的微电极阵列记录示例。 （A）示意图展示了用于采集 MEA 数据的预配置记录模板。连接 MEA2100 与记录（前置放大器/放大器）工具可对数据进行命名并保存。右侧四条原始数据迹线（5 分钟时段）由一个 MEA 通道采集，分别显示基础状态下的活动、加入 4-AP 后 12 分钟的活动、4-AP 诱导的活动稳定后再过 15 分钟的活动，以及浴施 TTX（1 µM）后的活动。注意，加入 4-AP（第二条迹线）后背景噪声及 EAP/LFP 活动明显增强。重要的是，在 4-AP 诱导的活动建立后，其活动在至少 15 分钟内保持相对稳定（第三条迹线）。加入 TTX（1 µM）后所有电活动被完全抑制（最下一条迹线）。（B）左侧示意图展示了用于数据分析的分析软件配置。使用“原始数据浏览器”工具导入由记录软件采集的数据。随后数据通过跨通道滤波器工具，减去选定参考电极的信号以去除背景噪声。数据再分别经过 EAP 滤波器和 LFP 滤波器工具，以优化每种波形的信噪比。在此之后，EAP 路径的数据进入 EAP 检测器工具并设定阈值，检测到的 EAP 随后被送入 EAP 分析工具，其中每个事件的潜伏期被记录并导出为 txt 文件。LFP 数据通过相应的 LFP 工具包经历相同的分析流程。右侧迹线显示来自单个 MEA 通道的多种细胞外波形数据。“计数点阵图”上方标出了 EAP 和 LFP 信号的位置。下方迹线为上方记录中由红色条标示的时段，以扩展的时间尺度展示波形，包括多种 LFP 信号（注意其形态多样性）以及单个细胞外 EAP（红色圆圈）。注意，EAP 和 LFP 波形及其极性会因产生这些信号的神经元数量、其与记录电极的距离以及相对于邻近电极的位置而变化。缩写：MEA = microelectrode array（微电极阵列）；EAP = extracellular action potential（细胞外动作电位）；LFP = local field potential（局部场电位）；4-AP = 4-aminopyridine（4-氨基吡啶）；TTX = tetrodotoxin（河豚毒素）。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 同步性分析
    注：电极间“同步事件”数量（即同步性）的测定采用 Satuvuori 提出的 A-SPIKE 同步化方法中的重合判据。 等29此处使用的脚本仅为了提高效率而比较相互相邻的电极（即水平、垂直和对角线方向的邻近电极）；然而，如有需要，该脚本可被重写以比较所有电极。
    1. 使用自定义编程脚本对数据进行分析，该脚本从 .xlsx 文件中提取每个电极的潜伏期时间戳。
      注意：此步骤可手动完成。
    2. 在步骤 2.1.11 中，记录单个 LFP 波形的最大阈值跨越次数和最大阈值跨越时间间隔。在运行脚本前，修改脚本以输入每个脑片的这些 LFP 定义参数。
      注意：分析软件中先前进行的阈值处理能够将EAP清晰地识别为单个事件。然而，LFP由数量可变的峰构成，其峰的数量取决于波形的形状以及该单一事件所引发的阈值跨越次数。
    3. 在分析前修改脚本以输入感兴趣的电极。
    4. 为确定同步性（在脚本中定义为可调节的时间窗口内发生的同步活动），需对提取的潜伏期进行分离和分析，以检测同时发生的事件。
      注意：该脚本允许设置符合事件之间的最长时间间隔。EAP 的设定为 20 ms，LFP 的设定为 200 ms。
    5. 运行脚本以提取延迟时间戳。
      注意：.xlsx 输出文件包含潜伏期数据的解读结果，即单个电极和整个脑片的 EAP 和 LFP 计数、频率以及同步事件计数。这些数据用于评估频率、EAP/LFP 计数、活跃电极数量、同步事件数量、连接电极数量以及这些连接的平均强度。

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结果

脊髓背角神经网络活动模型
应用4-AP可稳定诱导脊髓背角（DH）产生同步节律性活动。此类活动表现为兴奋性动作电位（EAPs）和局部场电位（LFPs）的增加。后者是一种低频波形信号，此前已在多电极阵列（MEA）记录中有所描述30。给药后EAP和/或LFP活动的变化反映了神经元活动的改变。EAPs和LFPs的示例见图3B和图4。本文重点关注EAP/LFP数据的以下参数或特征：频率、总事件数、活跃电极数、通过多个电极检测到的同时事件数量所表征的同步性、相连相邻电极的数量，以及相邻电极间连接的强度。代表性结果见表3以及图3、图4、图5、图6、

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讨论

尽管脊髓背角（DH）在伤害性信号的传递、信息处理以及形成疼痛相关的行为和情绪反应中具有重要作用，但该区域内的神经环路仍远未被充分阐明。研究这一问题的关键挑战在于构成这些环路的神经元群体具有高度异质性6,31,32。近年来，以光遗传学和化学遗传学为代表的转基因技术取得了进展，正逐步揭示这些重要的神经连接，并定义处理感觉信息的微环路1,2,3,4,8,9,10,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（NHMRC）（资助号 631000、1043933、1144638 和 1184974，授予 B.A.G. 和 R.J.C.）以及亨特医学研究所（资助号授予 B.A.G. 和 R.J.C.）提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-氨基吡啶Sigma-Aldrich275875-5G
100% 乙醇赛默飞世尔科技AJA214-2.5LPL
CaCl2 1MBanksia Scientific0430/1L
Carbonox（碳酰气——95% O₂ 和 5% CO₂）2，5% CO₂2)Coregas219122
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MEA前置放大器多通道系统MEA2100-HS60
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参考文献

  1. Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190(2019).
  2. Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
  3. Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
  4. Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).
  5. Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
  6. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
  7. Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
  8. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  9. Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603(2018).
  10. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  11. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  12. Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
  13. Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
  14. Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
  15. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).
  16. Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
  17. Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
  18. Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
  19. Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).
  20. Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).
  21. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
  22. Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).
  23. Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
  24. Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
  25. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
  26. Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
  27. Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
  28. Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
  29. Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
  30. Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
  31. Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
  32. Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
  33. Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
  34. Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
  35. Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).
  36. Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
  37. Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
  38. Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  39. Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).
  40. Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
  41. Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).

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