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作为感染后葡萄膜炎模型的启动型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）

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DOI：

10.3791/62925

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2021年12月17日

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1Department of Ophthalmology, University of Washington, 2Academic Unit of Ophthalmology, Translational Health Sciences, University of Bristol

本文内容

摘要

本方案概述了在小鼠中诱导 预激活型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）的步骤。该方法详细说明了在小鼠模型系统中产生可靠且显著的眼部炎症的操作流程。通过使用本方案，我们从单只动物中获得了葡萄膜炎眼及未发炎的对侧眼，可用于后续的免疫学、转录组学和蛋白质组学分析。

摘要

“葡萄膜炎”这一术语描述了一组具有异质性的疾病，其共同特征是眼内炎症。广义上，葡萄膜炎根据病因可分为感染性和自身免疫性两类。感染性葡萄膜炎需使用适当的抗微生物药物进行治疗，而自身免疫性葡萄膜炎则需使用皮质类固醇或其他免疫抑制剂治疗。感染后葡萄膜炎是一种慢性葡萄膜炎，需要在初始感染后使用皮质类固醇来控制免疫继发反应。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染相关的葡萄膜炎是感染后葡萄膜炎中已被广泛认知的一种类型，但其发病机制尚未完全阐明。为了研究分枝杆菌抗原和天然配体在Mtb感染后引发慢性眼部炎症中的作用，研究人员建立了“致敏性分枝杆菌性葡萄膜炎”（Primed Mycobacterial Uveitis, PMU）小鼠模型。本文详细阐述了建立PMU模型的方法，并介绍了利用彩色眼底成像和光学相干断层扫描（OCT）对炎症临床进程进行监测的技术流程。PMU模型通过先给予小鼠热灭活的分枝杆菌提取物免疫，7天后对单侧眼玻璃体腔注射相同提取物来诱导。随后通过活体成像技术对眼部炎症进行纵向监测，并采集样本开展多种检测分析，包括组织学检查、流式细胞术、细胞因子分析、定量PCR（qPCR）或mRNA测序。PMU小鼠模型是研究眼部对Mtb感染的反应、慢性葡萄膜炎发病机制以及新型抗炎疗法临床前有效性评估的一个有价值的新型工具。

引言

“葡萄膜炎”一词描述的是一组具有异质性的疾病，其共同特征是眼内炎症1。葡萄膜炎的动物模型对于理解疾病机制以及新疗法的临床前测试具有重要意义。目前已建立多种葡萄膜炎动物模型2。其中研究最为广泛的是实验性自身免疫性葡萄膜炎（或称葡萄膜视网膜炎；EAU）和内毒素诱导性葡萄膜炎（EIU）。EAU通常通过免疫接种眼内抗原而诱发，也可在缺乏AIRE基因导致中枢免疫耐受被破坏时自发产生3,4。此后，该模型的其他变体也相继被开发出来5,6,7，包括使用不同致葡萄膜炎肽段的模型，这些已有广泛综述8,9,10。EAU是研究T细胞依赖性自身免疫性葡萄膜炎（如人类的Vogt-Koyanagi-Harada病和鸟枪样脉络膜视网膜炎）的主要模型。EIU则通过系统性或局部注射细菌脂多糖（LPS）而建立10,11。EIU被用作研究由天然免疫信号通路激活所引发的急性葡萄膜炎的模型12。这两种模型对当前眼免疫学的理解起到了关键作用，但均无法有效模拟感染后慢性葡萄膜炎。近年来在小鼠中建立的致敏性分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）模型，为研究和评估此类葡萄膜炎的临床与细胞特征提供了新的途径13。

全球结核分枝杆菌感染的发病率较高，世界卫生组织2019年报告的新发病例超过1000万例，死亡人数超过140万14。活动性结核病（TB）的肺外表现包括葡萄膜炎，是感染性葡萄膜炎中公认的病因之一15,16。结核相关性葡萄膜炎的临床表现多样，可能反映了多种不同的发病机制，包括直接的眼部感染以及尚不完全明确的免疫介导性炎症17,18,19。针对这些感染后遗症提出的发病机制包括：由视网膜色素上皮（RPE）中低菌量感染持续存在所引发的慢性炎症反应；由已成功清除的眼部感染残留的病原体相关分子模式（PAMPs）所诱发的慢性炎症反应；以及由于系统性结核感染导致的分子模拟或抗原扩散过程，引起适应性免疫反应对眼部抗原的异常激活20,21,22,23。

为了更深入地了解慢性感染后葡萄膜炎的发病机制，并研究分枝杆菌抗原在疾病启动中的作用，研究人员建立了适用于小鼠的PMU模型。13,24因此，为了诱发炎症反应，小鼠首先接受一次皮下注射来自热灭活的抗原 结核分枝杆菌 H37Ra 菌株以模拟全身性感染，7 天后对左眼或右眼进行玻璃体内注射相同抗原，以模拟局部眼部感染。通过纵向监测评估随之发生的葡萄膜炎的强度和持续时间 体内 光学相干断层扫描（OCT）与眼底成像25. PMU 的特征是急性期以髓系细胞为主的全葡萄膜炎，随后发展为慢性期以T细胞为主的后部葡萄膜炎，伴有玻璃体炎、血管周围视网膜炎症以及局灶性外界膜损伤26眼后段出现肉芽肿性炎症表明，PMU模型可用于研究在具有既往结核分枝杆菌感染免疫学证据的患者中观察到的某些类型的前部（肉芽肿性和非肉芽肿性）及中间型葡萄膜炎。27此外，PMU模型中使用的热灭活结核分枝杆菌（Mtb）组分被认为可触发免疫反应，这可能与对抗结核治疗（ATT）有反应的结核性眼病患者复发性葡萄膜炎的发生机制相关。28由于PMU在疾病起始和炎症进程方面与EAU和EIU存在差异，因此代表了一种不依赖于眼内抗原免疫的新型葡萄膜炎动物模型，有助于阐明慢性葡萄膜炎患者的疾病机制。本方案概述了诱导PMU、监测炎症的临床病程，以及采集眼部样本进行流式细胞术死后分析的方法。

方案

所有操作均经华盛顿大学动物护理与使用委员会（动物实验方案编号 #4481-02）批准，或符合英国英国内政部许可证（PPL 30/3281）及布里斯托大学伦理审查小组的要求。两所机构开展的实验均遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明。PMU 在 6 至 10 周龄的 C57BL/6J 小鼠中诱导产生；所有小鼠在诱导葡萄膜炎时体重均不低于 18 g，并经确认为阴性 Crb1 基因的 rd8 突变29小鼠以标准饲料喂养，并给予含药物的水（对乙酰氨基酚 200-300 mg/kg/天） 随意摄取 在特定病原体阴性条件下饲养。动物安乐死采用标准的二氧化碳吸入法进行30.

1. 皮下注射用抗原的制备

  1. 本节所有操作均须在化学通风橱内进行，以避免吸入或皮肤接触结核分枝杆菌 H37Ra 干粉。根据本机构对完全弗氏佐剂的管理政策（通常为生物安全等级1级）进行操作。包括佩戴耐化学腐蚀手套、安全护目镜和防护工作服（实验服）。
  2. 采用良好的无菌技术，防止试剂污染，以免影响实验动物。
  3. 在5 mL 微量离心管中，将5 mg 冷冻干燥的、热灭活的 M. tuberculosis H37Ra 干粉与2.5 mL 冷的 PBS 混合，配制结核分枝杆菌悬液。涡旋振荡30秒后置于冰上。
  4. 为在 PBS 中形成均匀的 H37Ra 细悬液，将悬液置于冰上超声处理5分钟。
    1. 松开转换器单元的主体，用70%（v/v）酒精棉片清洁探头。
    2. 开启超声仪，旋转功率调节旋钮将功率设为4，将探头尖端浸入含有分枝杆菌干粉的 PBS 中。确保探头尖端至少浸入样品深度的一半，且探头尖端不接触微量离心管管壁。
  5. 在冰上超声处理混合物30秒，暂停30秒，重复操作，总时长5分钟，以充分分散粉末形成均匀悬液，同时避免液体过热。
  6. 向混合物中加入2.5 mL 不完全弗氏佐剂，并在冰上重复超声处理，直至乳剂形成类似牙膏的稠度。
  7. 使用控制旋钮将功率调至0，关闭仪器以结束超声处理。将探头从乳剂中取出，并用酒精棉片擦拭探头。
  8. 将抗原乳剂储存于4 °C。制备批次乳剂有助于确保不同实验间的一致性。乳剂可在4 °C 下保存最长3个月。

2. 皮下注射

  1. 在玻璃体内注射前一周进行皮下注射（记为第 -7 天）。
  2. 用 1 mL 注射器（不带针头）吸取分枝杆菌乳剂。由于乳剂具有黏性和不透明性，注射器中可能产生难以察觉的气泡。
    1. 为防止注射器中出现气泡，在吸入 0.2–0.3 mL 乳剂后，将注射器倒置（针端朝上），并轻轻反复敲击操作台边缘，使气泡上升至表面。
  3. 排出注射器中的空气，并继续加满乳剂。在填充过程中反复倒置并轻敲注射器，直至完全充满。
  4. 在注射器上安装 25 G 针头，并推动乳剂使其充满针头。使用前将注射器置于冰上保存。
  5. 为安全实施皮下注射，可对小鼠进行麻醉，或采用人道固定方法，以便于接触动物的后肢区域31。
  6. 若需麻醉以进行皮下注射，将动物置于异氟烷诱导舱中（诱导浓度为 3%–4%，维持浓度为 1%–3%）。麻醉成功后，应确保小鼠呼吸频率缓慢，且无呼吸困难迹象。
  7. 皮下注射部位可选择髋部背侧，或腹股沟淋巴结区域附近的腿部腹侧。
    1. 小心插入针头，避免将乳剂注入肌肉内。向皮下间隙注射 0.05 mL 结核分枝杆菌（Mtb）乳剂。不要立即拔出针头，以确保黏稠乳剂完全注入。
    2. 在左右两侧分别重复注射，每只动物总注射量为 0.1 mL。
  8. 若进行了麻醉，将小鼠置于温热的加热垫上直至完全恢复。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。
  9. 小鼠完全恢复后将其放回笼中，并在笼卡上标注皮下注射日期。
  10. 给予口服对乙酰氨基酚镇痛（200 mg/kg/天），但避免使用非甾体抗炎药（NSAIDs），因为抗炎药物可能影响葡萄膜炎的诱导。

3. 玻璃体内注射用抗原储备液的制备

  1. 本节所有操作均须在适当的无菌条件下进行，以防止眼内注射用结核分枝杆菌悬液被污染。
  2. 制备眼内注射悬液。
    1. 为诱导轻度至中度全葡萄膜炎，将5 mg分枝杆菌提取物加入1 mL 1×PBS中，配制成浓度为5 mg/mL的眼内注射悬液。
    2. 为诱导中度至重度全葡萄膜炎，将10 mg分枝杆菌提取物加入1 mL 1×PBS中，配制成浓度为10 mg/mL的眼内注射悬液。
  3. 涡旋振荡30秒一次，然后置于冰上。
  4. 为在PBS中形成H37Ra的细小悬液，按步骤1.4所述，在冰上超声处理10分钟。将此原液分装为每份100 µL，于-20 °C保存。
  5. 使用前于室温下解冻，并在高速下涡旋振荡1分钟。运输至动物实验设施期间，始终保持分装样品处于冰上。

4. 第0天玻璃体内注射操作步骤

  1. 动物准备
    1. 佩戴合身的检查手套，将小鼠置于电子天平上，称取其体重（单位：克）。
    2. 按每克体重0.02 mL的剂量，腹腔注射含有100 mg/mL氯胺酮和20 mg/mL赛拉嗪并用无菌水稀释的混合溶液，以麻醉动物。替代方法包括使用约1.5%异氟烷进行吸入麻醉诱导。
    3. 等待约2分钟，待小鼠进入睡眠状态后，将其放入保温箱中并盖上盖子。通过耳部、脚趾和尾部夹捏等疼痛反射测试，评估麻醉深度32。
    4. 小鼠入睡后，向角膜滴加1滴0.5%（v/v）丁卡因进行局部麻醉。注意避免丁卡因接触小鼠鼻部或口部。10秒后，用棉签吸除多余液体。
      注意：已观察到，当使用局部麻醉时，虹膜扩张和前房（AC）可视化效果更佳，这可能是由于全身麻醉联合局部麻醉更好地抑制了角膜反射。但如需要，此步骤可省略。
    5. 滴加1滴2.5%（v/v）去氧肾上腺素以扩大瞳孔。操作时需小心，避免多余液滴进入鼻腔或口腔。2-3分钟后，吸除多余液体。
    6. 为降低眼内炎风险，向眼部表面及周围毛发滴加1滴5%聚维酮碘。保持作用2-3分钟。
      注意：本节所有操作均应在适当的无菌条件下进行，以预防眼内炎。
    7. 清除聚维酮碘后，使用羟丙甲纤维素（0.3%）或卡波姆眼用凝胶（0.2% w/w）覆盖眼球，防止麻醉期间角膜干燥。此措施也有助于预防白内障形成。
  2. 设置微量注射系统
    1. 使用连接至微注射泵控制器和注射器的微量泵进行玻璃体内注射（图1A-C）。或者，如4.4小节所述，可使用连接至哈密尔顿注射器的33 G针头进行注射。
    2. 将34 G针头连接至注射支架上以组装注射装置。松开注射支架前端的银色螺帽，将针头插入支架体内约一半深度，然后用手拧紧银色螺帽。
    3. 按照步骤4.2.4-4.2.5所述，将管路连接至注射支架。
    4. 为将管路插入注射支架，松开支架后端的塑料螺钉，将管路穿过内部垫圈，然后拧紧螺钉。
    5. 保持管路末端留有微小间隙，以防止注射过程中管路受损。参见图1C。
    6. 解冻100 µL分装的分枝杆菌储备悬浮液。
    7. 加入3 µL的1%荧光素钠（AK-Fluor）溶液，并充分涡旋混匀。
    8. 用10 µL注射器吸取抗原与荧光素混合液，确保不混入任何气泡。
    9. 取下装样针头，将管路穿过银色螺帽垫圈，直至管路尖端到达注射器筒体上的零刻度线位置。
    10. 当管路尖端准确对齐至所需位置后，用手拧紧螺帽。
    11. 推动注射器内液体，使溶液流经注射管路，以完全填充系统。然后重复步骤4.2.8-4.2.11，重新装填注射器以备注射。
    12. 将装填好的注射器安装至微量泵上时，按下微量泵末端的夹钳释放按钮，打开注射器夹钳。
    13. 将推杆帽插入微量泵后端的推杆帽固定槽中。
    14. 然后将注射器卡环滑入卡环止位处，同时将注射器筒体插入注射器夹钳中。
    15. 松开夹钳按钮，并拧紧推杆固定螺钉。参见图1D。
    16. 将注射支架及针头穿过立体定位注射装置上的O型夹。该平台为定制装置；也可手动持握并定位注射器。
    17. 在微注射泵控制器上设定输注体积和输注速率，分别为每循环500 nL，速率40 nL/s。
      注意：可使用更快的注射速率，但在针头重新定位前可能出现更多反流。
    18. 在进行玻璃体内注射前，测试系统以确保其正常工作。
      注意：当注射系统正常运行时，踩下脚踏开关或按下控制面板将触发注射循环，可见推杆帽固定槽发生明显移动，且针尖处出现少量绿色液体滴出。若无液体排出，可启动额外循环，或冲洗并重新装填注射器。
    19. 注射眼部前，用95%乙醇棉片轻轻擦拭针头。
  3. 玻璃体内注射操作
    1. 将小鼠置于立体定位装置上以进行注射操作。
    2. 通过在平台表面覆盖2-3层纸巾，保持小鼠所处台面温暖。
    3. 将小鼠俯卧于平台上，使用左右耳杆轻轻固定其头部。参见图1E。
    4. 调整小鼠位置并在显微镜下定向，使右眼鼻上方区域清晰可见。
    5. 使用30 G针头拨开睫毛，暴露巩膜。观察角膜缘及放射状血管。
    6. 使用无菌30 G针头在角膜缘后方1-2 mm处的巩膜上制作引导孔。
    7. 将连接至注射支架的34 G针头经引导孔以一定角度插入眼内，避免接触晶状体，同时确保针尖进入玻璃体腔。
    8. 通过微注射泵控制器，小心地将1 µL结核分枝杆菌（Mtb）提取物注入玻璃体腔。若持续出现反流，可将注射体积增至1.5 µL，以确保足量递送。
      注意：对于假手术对照组，向动物眼部注射1 µL PBS。
    9. 通过观察眼部是否出现绿色反光，确认注射物位于玻璃体内。参见图1F。
    10. 10秒后，将针头从眼部撤出。记录是否出现反流。
    11. 将小鼠从平台取下，在双眼涂抹0.3%羟丙甲纤维素或0.2% w/w卡波姆眼膏以保护角膜，并转移至恢复用保温箱。
    12. 在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得离开看护。在完全恢复前，不得与其他动物合笼。
    13. 当小鼠完全清醒后，将其放回笼中，并提供含乙酰氨基酚（200-300 mg/kg/天）的饮用水。在笼卡上标注玻璃体内注射日期。
    14. 玻璃体内注射通常耐受性良好。可能提示疼痛并需终止实验的临床体征包括眶周脱发（提示自残行为）、角膜溃疡、体重减轻和弓背姿势。
  4. 玻璃体内注射的替代方法
    ​注意：本操作使用手术显微镜和连接于微量注射器的33 G针头。
    1. 将眼球突出，并用一对镊子固定其位置。
    2. 然后涂抹0.2% w/w卡波姆眼用凝胶或0.3%羟丙甲纤维素眼用凝胶，并在眼球上覆盖圆形盖玻片（直径7 mm）。
    3. 将33 G皮下注射针头安装至5 µL哈密尔顿注射器上，以约45°注射角度，在角膜缘周围约2 mm处插入。
    4. 引导针头斜面进入玻璃体腔，停止位置位于晶状体与视盘之间（从术者视角看，即位于视盘上方/覆盖视盘区域，距穿刺点约1.5 mm），缓慢注入2 µL Mtb（PBS中浓度为2.5 µg/µL）。
    5. 短暂保持针头原位（以减少注射液反流），然后将其撤出。
    6. 注射后，松开镊子使眼球复位。 此时可在眼部滴加1% w/w氯霉素眼膏，以进一步预防注射后眼内炎。 
    7. 注射后，按步骤4.3.11-4.3.13所述转移至恢复用保温箱。

5. 采用OCT成像检测和量化葡萄膜炎

  1. 动物准备
    1. 按照步骤 4.1.2–4.1.4 所述方法对小鼠进行麻醉
    2. 滴加 1 滴 2.5% 去氧肾上腺素以散大瞳孔。操作时需小心，避免多余液滴进入鼻腔或口腔。2–3 分钟后，用棉签吸除多余液体。
    3. 在眼睛表面涂抹 0.3% 羟丙甲纤维素或 0.2% w/w 卡波姆凝胶，以防止麻醉期间角膜干燥。这也有助于预防白内障形成。
    4. 用一层手术纱布包裹小鼠以维持体温，并将其放置于动物载物台上。使用咬合杆固定头部位置。
  2. 获取前房和后房的 OCT 图像。
    注意：若需同时获取前房和后房图像，应优先采集后房（PC）图像，以避免白内障形成后导致图像质量下降。频繁使用润滑剂并涂抹 0.3% 羟丙甲纤维素或 0.2% w/w 卡波姆眼用凝胶可预防白内障形成。对于长时间成像（>10 分钟），通过加热垫维持小鼠体温也有助于保持状态稳定。
    1. 开启 OCT 成像系统后，安装正确的成像镜头，并根据需要调整参考臂位置。
    2. 打开成像软件，创建唯一的小鼠编号，并按照 OCT 设备制造商的协议开始成像。
    3. 使用自由运行模式配合快速扫描协议，调整眼睛位置，使视神经位于后房图像的中心，或使角膜顶点位于前房图像的中心。
      注意：表 1 列出了两种 commercially available 小动物成像系统的成像参数。产品规格请参见 材料表。
    4. 进行后房成像时，将 OCT 镜头移近眼球表面，但需小心避免镜头表面与眼睛直接接触。
    5. 当眼睛位置正确后，停止快速扫描，选择体积扫描协议，并使用瞄准选项启动扫描。
    6. 对于后段图像，调整至水平 B 扫描对齐图像中视神经居中，且视网膜与垂直对齐轴对齐。
    7. 对于前段图像，调整位置，使角膜顶点在水平 B 扫描对齐图像和垂直对齐 B 扫描对齐图像中均居中。若两个图像中均出现反射伪影，则表明对齐正确。随后轻微移动水平图像以消除反射伪影。参见图 2。
    8. 点击快照以捕获体积扫描图像，然后点击保存。
    9. 接下来获取平均中心线扫描图像。打开扫描协议，依次点击瞄准和快照。在同一面板上右键单击，然后点击平均。
    10. 对每只眼睛使用两个镜头重复步骤 5.2.1–5.2.9。
    11. 所有图像采集完成后，将小鼠从载物台上取出，并按照步骤 4.3.11–4.3.13 所列方法在恢复期间提供角膜保护。

6. 通过光学相干断层扫描（OCT）评估炎症程度

  1. 在不知晓处理条件的情况下，借助评分人员对OCT图像进行评分。
    注：对于小鼠模型中的PMU，建议使用表2中提供的评分系统。
  2. 如果获取了前房（AC）和后房（PC）的图像，则将这两部分的评分合并，以获得每只眼睛的最终评分。
    ​注：前房炎症的消退早于后房炎症。

7. 通过死后组织学分析对炎症进行评分

  1. 实验结束时，通过摘除术收集单个眼球，用4%甲醛固定过夜，随后进行石蜡包埋、切片及H&E染色33。
    注意：建议沿瞳孔-视神经轴获取多个4–8 µm厚的切片。
    注意：由一位不知情的评分者使用表3中提供的评分系统对每只眼球的三个切片进行评分，并将三个切片的平均分报告为最终的组织学炎症评分。

结果

本方案展示了利用预致敏分枝杆菌性葡萄膜炎模型（PMU）在小鼠中诱导葡萄膜炎的方法。确保皮下注射的一致性以及玻璃体内注射的准确性是建立预致敏分枝杆菌性葡萄膜炎模型（PMU）的关键步骤。图1展示了使用立体定位仪进行小鼠玻璃体内注射的操作过程。耳杆有助于在显微镜下轻柔地将小鼠头部固定在相同位置（图1E），并在玻璃体内注射过程中保持头部稳定，从而降低注射造成创伤的风险。成功注射后，注射液中的荧光素可在眼内产生绿色反光，可在显微镜下或如图1F所示从侧面观察到。

按照所述方法操作时，该方案可在玻璃体内注射后10小时即通过光学相干断层扫描（OCT）和眼底成像检测到明显的急性葡萄膜炎。 图2 展示了进行OCT成像时眼睛的正确对位方法。 表 1A 列出了OCT方案中使用的参数。采用系统化的方法获取图像，可提供高质量且能进行纵向比较的图像。前房图像以角膜顶点为中心，通过眼前段SLO图像进行定位。图 2A）虹膜与水平面和垂直面平行对齐（图2B, C）。通过垂直对齐方式采集体积扫描和线扫描，以便同时观察下方和上方区域。使用 en face SLO 图像将后节图像以视神经为中心进行定位。图 2D），并利用RPE的明亮条带来使视网膜与水平和垂直平面保持平行（图 2E，F).

图3 显示了使用OCT成像观察PMU眼内炎症的典型表现。玻璃体内注射后24小时，前房水和玻璃体中可见炎性细胞（图3B）。当存在中度或重度炎症时，前房（AC）的下方房角处可见前房积脓（hypopyon）。可根据表2中列出的标准对OCT图像上的眼内炎症程度进行评分。代表性的图像示例见图4，展示了每种评分所对应的典型炎症特征。前房（AC）和后房（PC）的评分可相加得到综合OCT评分。综合评分 >0 但 ≤2.5 表示轻度炎症；评分 >2.5 但 ≤4.5 为中度炎症；评分 >4.5 则提示重度炎症。眼内炎症通常在玻璃体内注射后48小时达到高峰，此时前房和后房的OCT评分介于1至3之间（综合评分介于2至6之间）。前房和后房评分为0.5或4的情况较为少见。若频繁出现超出典型范围的评分，可能需要进行故障排查，以确定导致异常评分的影响因素（参见讨论部分）。前房的炎症评分通常在玻璃体内注射后一周内恢复至0。相比之下，后房评分不会恢复至0；相反，在注射后1至2个月内，玻璃体炎和视网膜血管周围淋巴细胞浸润等形式的低水平慢性炎症将持续存在。

PMU中的炎症评分也可通过组织学方法确定。图5展示了可用于组织学评分的代表性H&E染色切片。通过计数前房和玻璃体中的炎性细胞数量，并依据表3所列评分标准来判断PMU的严重程度。在轻度或中度炎症中，睫状体的炎性细胞浸润通常仅出现在组织切片的一侧（单侧受累）。当炎症严重时，表现为晶状体两侧睫状体均出现炎性细胞浸润（称为双侧受累）。在玻璃体内注射后的较晚时间点，还可观察到慢性炎症的表现，包括血管周围及视网膜内白细胞浸润以及外层视网膜皱褶。组织学检查还有助于识别因注射技术不佳而受影响的眼组织。玻璃体内注射过程中若损伤晶状体，可在创伤部位附近的晶状体囊外观察到无定形嗜酸性（粉红色）晶状体蛋白，从而识别出晶状体损伤。若玻璃体内注射的mTB反流至结膜下间隙，将引起眼外炎症，通过仔细检查切片中的眼周结构可识别该现象。由于未能将mTB提取物保留在眼内，这些眼通常表现出较低的OCT炎症评分。

明场眼底成像也可用于识别葡萄膜炎（PMU）的临床相关特征，包括前房积脓（hypopyon）的形成、玻璃体炎（vitritis）以及视网膜或血管周围炎性细胞浸润。图6展示了两个在眼底图像上可见视网膜及血管周围炎症的示例。这两个眼球还显示了PMU模型中常见的炎症程度范围。表1B列出了眼底/视网膜OCT成像系统所使用的参数。请注意严重炎症对图像质量的影响（图6，第2天，上排的OCT和眼底图像）以及第21天时疾病的发展程度。角膜水肿在急性炎症期间也可能降低图像质量；然而，单纯由炎症引起的严重角膜水肿并不常见。更常见的情况是，由于成像和麻醉过程中眼球表面保护不完全，导致上皮损伤，从而降低图像质量。

PMU 模型可用于在任何小鼠品系或基因型中诱导葡萄膜炎。在白化小鼠的眼睛中，光学相干断层扫描（OCT）仍可用于评估炎症程度，但由于缺乏眼底色素，通过明场成像观察炎症较为困难13,34。可在眼部组织、局部淋巴结或脾脏上进行死后研究。一些示例包括检测免疫细胞存在的实验，如流式细胞术和免疫组织化学，以及炎症性细胞因子的测定。在使用 PMU 诱导炎症后的所有测试时间点（第1天至第56天），每只眼睛中均存在足够数量的 CD45+ 炎症细胞，可通过多参数流式分析检测眼内多种主要的白细胞群体12,35。可从发炎的眼睛中采集房水（2–5 µL）和玻璃体液（5–10 µL），用于蛋白质浓度测定、蛋白质组学研究或细胞因子浓度测定36。

Micro4 微量注射泵装置、注射系统、动物实验、药物递送过程。
图 1：小鼠玻璃体内注射装置示意图。 小鼠玻璃体内注射操作使用以下组件：(A) 连接到 (B) 微量泵和 (C) 注射器的微量注射泵控制器。注射器装载后安装于 (D) 微量泵上。通过 (E) 耳杆固定小鼠头部，以确保玻璃体内注射过程中头部的稳定性和操作的一致性。(F) 注射液中的荧光素在成功注射后可在眼内产生绿色反光。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示用于分析的视网膜和角膜横截面的光学相干断层扫描（OCT）图像。
图2：OCT成像时眼睛的正确对位。（A）利用眼前节扫描激光检眼镜（SLO）图像，将眼睛对准以获取前房图像。绿色线表示面板（B）中所示水平线扫描的位置。注意应避开中央角膜，以减少反射伪影。（C）穿过旁中央前房的垂直B扫描。该扫描在相对于水平扫描90°的位置获取。注意在水平扫描（B面板）中，晶状体两侧的虹膜部分处于同一水平；而在垂直扫描（C面板）中，它们上下排列。（D）利用SLO图像，将后段成像对准视神经。（E）水平B扫描对位，（F）垂直B扫描对位。请点击此处查看该图的放大版本。

OCT视网膜成像进展；示意图；前房/后房分析；视觉研究。
图3：PMU诱导可引发全葡萄膜炎，可通过纵向OCT成像进行监测。 上排显示前房（AC）图像，下排显示后房（PC）OCT图像，以突出疾病进程中出现的病理变化。(A) 葡萄膜炎诱导前的AC（上）和PC（下）基线OCT图像，评分均为0。(B) 玻璃体内注射后第1天，显示角膜水肿（黑箭头）、前房积脓（*）、前房内多个游离漂浮的炎性细胞（白箭头）以及后房的玻璃体炎（白三角箭头）。(C) 玻璃体内注射后第7天，前房晶状体前囊上见少量细胞（白箭头），玻璃体炎减轻（白三角箭头）。(D) 玻璃体内注射后第28天，前房炎症已消退，玻璃体炎轻微。缩写：C-角膜，L-晶状体，I-虹膜，Aq-房水，V-玻璃体，RGC-视网膜神经节细胞，PR-光感受器，Ch-脉络膜。 请点击此处查看该图的放大版本。

光学相干断层扫描分级；示意图；严重程度0-4级；从正常到极重度评估。
图4OCT 评分示例 为每张AC图像和PC图像根据所示的分类系统分配一个0到4分的OCT评分 表2。AC 和 PC 得分合并后得出该眼的最终 OCT 评分。A,D) 得分为零的示例。 (B,E) 评分为 0.5 的示例。 (C，F) 评分为1的示例。 (G,J) 评分为 2 的示例。H,K) 评分为3的示例。I,L得分为4的示例如图中各面板所示 I 和 L. 请点击此处以查看此图的放大版本。

眼部组织学示意图；前房、睫状体细胞密度、玻璃体细胞炎症评分。
图5：组织学评分示例。组织学评分依据H&E切片中可见的五个特征进行判定：前房蛋白密度、前房细胞数量、睫状体免疫细胞浸润、玻璃体细胞密度、视网膜血管炎症以及视网膜结构改变。每项特征评分为0-2分。各项评分的具体描述见表3。本图展示了每项特征评分0-2的代表性示例。左列为0分示例，中列为1分示例，右列为2分示例。若在同一组织切片中，晶状体任一侧睫状体出现细胞性炎症，则该特征评分为2分。最终组织学评分为五项标准评分的总和（最高分为10分）。右下图中的箭头指示与浅层视网膜血管相关的血管周围白细胞。黑色比例尺表示500 µm。睫状体比例尺表示100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

通过眼底成像和OCT成像比较重度与中度炎症；炎症进展追踪。
图6：PMU的纵向眼底成像显示了不同范围的疾病严重程度。（A）重度炎症眼在第2天的彩色眼底成像中（上排）显示视网膜内多个白色浸润灶及血管扭曲，OCT图像（下排）显示明显的玻璃体炎和视网膜水肿。随着时间推移，可见视网膜病灶数量进展，而玻璃体炎有所改善。绿色线条表示OCT图像的位置。（B）轻度炎症眼在眼底中表现为较少且更局限的线性病灶，玻璃体腔内可见少量浸润细胞。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看本图的高清版本。

A
小鼠前房快速扫描体积扫描线性扫描
长度 × 宽度4.0 mm × 4.0 mm3.6 mm × 3.6 mm3.6 mm
角度09090
A扫描/B扫描80010001000
# B扫描504001
每B扫描帧数1320
小鼠后房快速扫描体积扫描线性扫描
长度 × 宽度1.6 mm × 1.6 mm1.6 mm × 1.6 mm1.6 mm
角度000
A扫描/B扫描80010001000
# B扫描502001
每B扫描帧数1320
B
小鼠后房体积扫描线性扫描
长度 × 宽度0.9 mm × 0.9 mm1.8 mm
角度0任意（通常为0或90）
A扫描/B扫描10241024
# B扫描5121
每B扫描帧数130

表1：扫描参数。（A）OCT扫描参数。（B）眼底/视网膜OCT扫描参数

OCT 评分说明
评分前房后房
NA无法观察到角膜前部以外结构无法观察到眼后段
0无炎症无炎症
0.5房水中可见 1–5 个细胞玻璃体区域中细胞稀少，占据面积小于 10%
或存在角膜水肿无脉络膜下或视网膜内浸润灶，无视网膜结构破坏
1房水中可见 6–20 个细胞细胞弥漫分布（无致密团块），占据玻璃体区域的 10% 至 50%
或晶状体前囊表面形成单层细胞无脉络膜下或视网膜内浸润灶，无视网膜结构破坏
2房水中可见 20–100 个细胞细胞弥漫分布（无致密团块），占据玻璃体区域 > 50%
或细胞数少于 20 个且存在前房积脓（hypopyon）无脉络膜下或视网膜内浸润灶，无视网膜结构破坏
3房水中可见 20–100 个细胞玻璃体细胞弥漫分布，程度相当于 2 级和 1 级
且存在前房积脓（hypopyon）或瞳孔膜且至少存在一个致密的玻璃体混浊灶，占据玻璃体区域的 10%–20%；或玻璃体细胞程度相当于 2 级，并伴有少量（≤ 2 个）脉络膜下或视网膜内混浊灶
4房水中细胞数量任意致密玻璃体混浊灶占据玻璃体区域 > 20%
且存在大量前房积脓和瞳孔膜；或因严重炎症导致前部结构丧失或弥漫性玻璃体细胞伴较大的脉络膜下或视网膜内混浊灶

表2：PMU OCT评分标准：OCT图像根据表中列出的标准进行评分。将AC和PC评分相加，得到该眼的最终评分。对于未能获得清晰眼部图像的情况，图像被赋予NA评分，并从研究中排除。

组织学评分描述
特征012
前房（AC）蛋白AC中少量嗜酸性染色的无细胞颗粒前房内任何位置均可见轻度但非融合性细胞外嗜酸性染色整个前房角出现融合或接近融合的细胞外嗜酸性染色
前房细胞（AC Cell）无细胞1–100 个细胞，但无细胞密集聚集体>100 个细胞，或细胞的致密聚集体
睫状体炎症睫状体或周围玻璃体无白细胞浸润睫状体和/或周围玻璃体中单侧出现白细胞浸润。睫状体和/或周围玻璃体双侧存在白细胞浸润。
视网膜血管炎症无血管周围白细胞浸润的视网膜血管每张切片一个血管，伴血管周围白细胞>每切片一个血管，伴有血管周围白细胞
视网膜皱褶或损伤无视网膜损伤每切片1–3个视网膜皱褶>每切片3条视网膜皱褶，或任何其他视网膜层破坏或视网膜内出血

表3：PMU组织学评分标准：根据表中所列标准对眼球的H&E切片进行评分。同一眼球选取三个切片进行评分并取平均值，作为该眼球的最终组织学评分。

讨论

葡萄膜炎的动物模型在理解眼内炎症和稳态机制方面发挥了重要作用，同时也为葡萄膜炎患者的药物和手术疗法提供了临床前评估平台37。兔和大鼠的PMU模型均已通过概念验证研究，展现出在临床前治疗研究中的应用价值38,39,40。由于小鼠存在多种转基因品系可供选择，建立小鼠PMU模型系统现可支持更深入的机制性研究，以鉴定参与该疾病病理过程的特定细胞类型、信号通路和基因。

葡萄膜炎的动物模型在炎症发生率和严重程度方面可能表现出个体间的差异41。在C57BL/6小鼠品系中，采用本文所述方案可稳定诱导PMU。已有文献报道，EAU和EIU模型在不同品系中葡萄膜炎的病程和严重程度存在品系特异性差异42,43。尽管尚未通过实验系统评估品系特异性对PMU严重程度和病程的影响，但该模型已在野生型C57BL/6J小鼠以及白化小鼠（B6(Cg)-Tyrc-2J/J）中应用，并均能产生相似的炎症反应。在建立PMU模型时，控制以下所列因素有助于新研究人员减少变异，获得最一致且可重复的葡萄膜炎模型。

确保皮下注射的一致性：
为了实现一致的皮下注射，需确保乳剂中无任何气泡。建议在将乳剂装入注射器前，对预先配制好的乳剂进行短时离心（400 ×g，30 秒），以去除乳剂中截留的空气。此外，在装填注射器时，应定期将注射器倒置（针尖朝上）并轻弹，以排除所有气泡。注射时，切勿将注射器插入过深，以免造成肌肉内注射；反之，若注射过浅（进入真皮层），可能导致乳剂从皮肤渗出。注射完毕后，在拔出注射器前应短暂停留片刻，以确保黏稠的乳剂完全注入，并防止乳剂从皮肤反流。

皮下注射后第7天，确认后肢两侧是否存在可触及的结节。若无法识别结节，可能是注入了空气而非乳剂。此种情况下，急性炎症反应可能较弱，且慢性炎症可能无法形成。

预防感染性眼内炎的发生：
若不加以预防，细菌性或真菌性眼内炎将引入混杂变量44。为预防细菌性眼内炎，在制备玻璃体内悬浮液、操作及清洗所有将与眼部接触的可重复使用器械时，必须始终遵循良好的无菌操作规范。使用无菌一次性物品、高压灭菌，或用95%酒精冲洗或擦拭清洁均至关重要。适当使用聚维酮碘作用于眼表、眼睑及眶周毛发区域，也有助于预防眼内炎45。感染眼通常易于识别，因为在注射后过程中，严重炎症将导致眼部结构模糊不清，而这种情况在PMU中并不典型。眼内出血的存在也可能提示眼内炎或注射所致的创伤。在此类情况下，应将这些动物排除在研究之外。

确保玻璃体内注射的一致性：
玻璃体内注射是诱导PMU中可靠且可重复的炎症反应的关键步骤。每次注射时提供一致剂量的结核分枝杆菌（Mtb）悬液、避免造成创伤以及防止悬液反流，都是执行注射时需要考虑的因素。为确保悬液均匀，解冻后及装入注射器前应充分涡旋混匀原液。由于所用Mtb提取物不能形成溶液，悬液随时间可能发生沉降。为保证每次注射中Mtb提取物浓度一致，建议在装入注射器后15分钟内完成注射，或在此期间排出并重新装填注射器。使用去氧肾上腺素滴眼液进行瞳孔散大，可扩大眼后段视野，并降低注射过程中对眼球造成创伤的风险。该滴眼液可引起自然的眼睑退缩和轻微眼球突出，从而无需使用镊子夹持眼球即可清晰观察角膜缘后1-2 mm区域。使用镊子固定眼球可能造成潜在创伤，并短暂升高眼内压，增加Mtb悬液反流的风险。试图向眼内注入过多体积也会导致创伤。注射体积限制为2 µL，以防止眼内压显著且持续升高以及对眼球造成损伤。此外，年轻动物的眼球通常小于成年小鼠。一般6-8周龄（20-25 g）的小鼠眼球大小较为均一，有助于在注射Mtb后获得更一致的炎症反应。在体型较小的小鼠中，注射后Mtb悬液反流的发生率更高，进而导致急性炎症反应低于预期。使用稀释的荧光素溶液可为初学者提供直观的视觉反馈，以评估其注射技术的成功与否。注射时的散瞳状态允许直接观察玻璃体腔内的注射物质，并及时发现是否存在晶状体损伤的迹象。 若发生晶状体损伤，可能导致晶状体透明度改变，形成白内障，可在光学相干断层扫描（OCT）中观察到。若出现眼部创伤，由于可能引发晶状体源性葡萄膜炎，这些眼球需从研究中排除。46 我们建议在拔出注射针头前停留10秒，以利于Mtb悬液在眼内扩散并减少反流。

通过改变玻璃体内注射的结核分枝杆菌（Mtb）浓度，可调整PMU模型中急性炎症的强度。我们实验室此前已测试了从2.5 µg/µL到15 µg/µL的不同剂量。然而，高于10 µg/µL的剂量被发现会导致严重的眼部损伤，包括自发性晶状体破裂、严重的角膜水肿和瘢痕形成，以及前房积血。这种严重程度在感染后葡萄膜炎的人类患者中并不典型，因此不推荐使用这些浓度。5 µg/µL的剂量可稳定诱导轻度至中度的急性炎症以及轻度的慢性葡萄膜炎；而10 µg/µL的剂量则可稳定诱导中度至重度的急性疾病以及更明显的慢性病变。因此，通过调整玻璃体内的浓度，可根据实验需求提供不同严重程度的疾病模型。应选择适当的对照，以确保实验结果反映的是对mTB的免疫反应，而非皮下或玻璃体内注射操作本身所致的创伤。在假注射对照组中，可用PBS替代mTB提取物。在与未暴露动物进行比较时，应考虑使用真正的幼稚样本，因为同体对侧眼并不总是完全等同的。

由于小鼠眼球体积较小，与直接观察或显微镜明场摄影相比，光学相干断层扫描（OCT）可更敏感地检测前房内的炎症。先前在大鼠中进行的PMU研究25表明，组织学检测到的细胞数量多于OCT，但两种方法之间具有良好的相关性。OCT的额外优势在于可对同一只动物进行纵向监测炎症变化。其他主要的小鼠葡萄膜炎模型，如EAU和EIU，也已采用OCT进行定量分析12,47,48。在小鼠PMU模型中，前房细胞仅能在OCT上可见，除非存在大量前房积脓，否则临床检查无法观察到。玻璃体炎症（vitritis）可通过彩色眼底成像观察，但只有OCT成像才能实现定量变化的检测。该模型的其他特征，如视网膜血管炎症和视网膜损伤，均可通过OCT或显微镜明场眼底摄影轻松识别。

使用OCT时，需考虑局部成像如何受到炎症程度区域差异的影响。既往研究已发现人类前房内细胞分布不均，下方区域细胞较多49。在小鼠中，也普遍存在类似的倾向。因此，通过前房进行垂直或放射状扫描有助于确保图像能够反映炎症的全貌。此外，在相同位置进行成像还可提高同一眼部长期观察图像的一致性。为了在眼部的同一部位获取图像，应使用稳定的解剖标志并采取系统性的方法。对于前房图像，应将图像中心置于角膜顶点紧邻处，并使图像呈垂直方向，以便检测下方房角是否存在前房积脓（hypopyon）。对于后段图像，应将图像中心对准视神经。建议至少采用3条线扫描进行评分，以确保涵盖区域差异。当炎症局限于周边部位时，获取容积扫描图像可能更有帮助。容积扫描的采集也有助于捕捉区域变异，但会增加数据存储需求。

可用于表征PMU小鼠模型中炎症的其他体内检测方法包括生物发光成像13,35。可在动物处死后进行多参数流式细胞术分析，以鉴定并定量眼房水及玻璃体腔中浸润的免疫细胞亚群12,26。在PMU模型中，急性炎症以固有免疫反应为特征，主要表现为中性粒细胞浸润，随后发展为持续一个月以上的慢性适应性T细胞主导反应35。可在处死后组织上开展的其他免疫功能检测还包括眼内液体的细胞因子分析。此外，还可采用mRNA测序和免疫荧光成像等下游检测方法，用于评估葡萄膜炎中视网膜免疫细胞群体的基因和蛋白质表达模式50,51。

通过采用适合不同物种的改良方法，PMU模型可在其他啮齿类动物系统中复制。此前已在大鼠和兔中应用过PMU模型38,39,40。在大鼠中，玻璃体内注射后会引发急性全葡萄膜炎，该炎症在14天内可自行消退，组织学检查未见慢性炎症迹象24。在兔中，葡萄膜炎的诱导需在玻璃体内注射前进行两轮皮下注射，同样可产生显著的全葡萄膜炎。使用小鼠模型的一个优势在于，存在大量现成的转基因和基因敲除品系，有助于阐明葡萄膜炎的基本机制52。所有啮齿类动物模型均可用于临床前治疗试验，前提是药物以全身给药或滴眼剂形式施用。然而，由于体型较大，大鼠和兔的眼睛更适合作为临床前研究中用于评估可植入装置或局部注射治疗方案的理想模型。

总之，本方案为致力于研究慢性眼内炎症机制的研究人员提供了一种新工具，该工具不依赖于事先使用眼内抗原进行免疫致敏。

披露

作者无任何财务利益冲突需要披露。

致谢

本研究获得了美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院（KP）K08EY0123998、（KP）R01EY030431、（KP）R21 EY02939、威斯康星大学眼科研究中心资助（NEI P30EY01730）、Mark Daily医学博士研究基金和Christopher与Alida Latham研究基金的捐赠、防盲研究组织（Research to Prevent Blindness）的无限制部门资助，以及防盲研究组织颁发的职业发展奖（KP）的支持。在布里斯托尔开展的工作还获得了英国 Sight Research UK 和 Underwood Trust 的额外资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AK-FLUOR美国伊利诺伊州阿科恩制药公司5 mL 小瓶装 10% 荧光素钠（100 mg/mL）
AnaSed美国伊利诺伊州阿科尔恩动物健康公司NDC 59399-110-20赛拉嗪 20 mg/mL
5% 碘伏无菌眼科清洁液美国德克萨斯州阿尔康8007-1
B-D Precision Glide 针头 -25 GBecton, Dickinson and Company，新泽西州，美国305122
B-D Precision Glide 针头 -30-GBecton, Dickinson and Company，新泽西州，美国305106
Bond MAX，Bond RxLeica Biosystems，伊利诺伊州，美国全自动免疫组化染色系统
氯霉素软膏英国罗姆福德，马丁代尔制药公司1% w/w 氯霉素
EG1150HLeica Biosystems，伊利诺伊州，美国组织包埋
Envisu R2300Bioptigen/LeicaOCT 机器
弗氏不完全佐剂BD Difco，新泽西州，美国263910
GenTeal 润滑眼膏美国德克萨斯州阿尔康---
GenTeal 润滑眼用凝胶美国德克萨斯州阿尔康---
H37Ra 冻干分枝杆菌提取物BD Difco，新泽西州，美国231141
Hamilton RN 针头 (33/12/2)S内华达州里诺市汉密尔顿7803-05(33/12/2)33 G
汉密尔顿注射器内华达州里诺市，汉密尔顿CAL7633-015 µL
胰岛素注射针头Exel International，美国260291 mL
异氟烷
Ketaset硕腾，美国377341盐酸氯胺酮 100 mg/mL
显微注射器泵和Micro4Controller美国佛罗里达州世界精密仪器公司UMP3
Micron IVPhoenix Research Laboratories，普莱森顿，加利福尼亚州替代成像/OCT 设备
Nanofil 10 µL型注射器美国佛罗里达州世界精密仪器公司NANOFIL
Nanofil 眼内注射套件美国佛罗里达州世界精密仪器公司IO-KIT
奥林巴斯 SZX10奥林巴斯解剖显微镜
PBSGibco14190
盐酸去氧肾上腺素滴眼液 美国药典 2.5% 无菌 15 mLAkorn Pharmaceuticals，美国伊利诺伊州17478020115
RM2255Leica Biosystems，伊利诺伊州，美国组织切片
结核病注射器Becton, Dickinson and Company，新泽西州，美国3096021 mL
0.5%丁卡因美国德克萨斯州阿尔康1041544
Tissue Tek VIP 系列Sakura Finetek USA, Inc.，加利福尼亚州组织学组织处理
1% 托吡卡胺英国罗姆福德，卓文制药公司最小量
泰诺Johnson &强生消费者公司，宾夕法尼亚州，美国NDC 50580-614-01对乙酰氨基酚
维适泰诺华制药，英国坎伯利0.2% w/w 卡波姆眼用凝胶

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