用完全纯化的组分重构Msp1提取活性

摘要

在这里，我们提出了一个详细的方案，用于在定义的蛋白脂质体中用完全纯化的组分重建Msp1提取活性。

摘要

作为氧化磷酸化和凋亡调节的中心，线粒体在人体健康中起着至关重要的作用。适当的线粒体功能取决于强大的质量控制系统来维持蛋白质稳态（蛋白质稳态）。线粒体蛋白质平衡的下降与癌症，衰老，神经变性和许多其他疾病有关。Msp1是一种锚定在外线粒体膜中的AAA + ATP酶，通过去除错位的尾锚定蛋白来维持蛋白质平衡。使用重组成蛋白脂质体的纯化组分，我们已经证明Msp1是必要且足以从脂质双层中提取模型尾锚定蛋白的。我们简化的重组系统克服了阻碍膜蛋白提取详细研究的几个技术障碍。在这里，我们提供了脂质体生成，膜蛋白重建和Msp1提取测定的详细方法。

引言

适当的细胞功能取决于称为蛋白质稳态的过程，该过程确保功能蛋白处于正确的浓度和细胞位置¹。蛋白质稳态的失败导致细胞器功能受损，并与许多神经退行性疾病^2，3，4有关。膜蛋白对蛋白质稳态网络提出了独特的挑战，因为它们必须靶向正确的膜，同时避免疏水性跨膜结构域（TMDs）聚集^5。因此，专门的机器已经发展到可以保护疏水性TMD免受细胞质基质的影响，并促进靶向和插入适当的细胞膜^{6，7，8，9，10，11，12，13，14，15。}

方案

1. 脂质体制备

1. 以适当的比例混合脂质的氯仿储备，以模拟外线粒体膜。
   1. 准备25毫克脂质混合物。我们使用先前建立的模仿线粒体膜的脂质混合物，由48:28:10:10:4摩尔比的鸡蛋磷脂酰胆碱（PC），鸡蛋磷脂酰乙醇胺（PE），牛肝磷脂酰肌醇（PI），合成1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（DOPS）和合成1'，3'-双[1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸]-甘油（TOCL）58，59组成。示例计算如表1所示。
   2. 开封前将所有脂质储备置于室温，因为这会限制冷凝。由于大多数实验室没有精确的方法来测量脂质的浓度，因此氯仿原液吸收的任何水都会改变脂质储备的浓度，从而改变测定中使用的脂质比例。
   3. 当脂质储备装在玻璃安瓿中时，使用1 mL注射器将所需量的脂质转移到玻璃小瓶中。向小瓶中加入2mg二硫代甲状腺素（DTT）以防止脂质氧化。快速工作，因为氯仿的蒸发会改变脂质的浓度。
   4. 将任何剩余的脂质转移到单独的玻璃瓶中，并与PFTE隔膜合合。向小瓶中加入2mg DTT，用石蜡膜包裹并储存在-20°C以防止脂质氧化。尝试在转移到小瓶后的3个月内使用脂质。为了防止标记径流对氯仿库存的潜在污染，请将贴纸从原始安瓿转移到玻璃小瓶上，而不是用标记标记标记。

结果

为了正确解释结果，必须同时观察无污渍凝胶和蛋白质印迹。无污渍凝胶可确保所有样品的上样量相等。当观察无污渍凝胶时，陪同人员（GST-钙调蛋白和GST-SGTA）将在输入（I）和洗脱（E）通道中可见。仔细检查这些波段的强度在所有 INPUT 样本中是否均匀。同样，确保洗脱样品的强度均匀。洗脱液的浓度是INPUT的5倍，这种强度差异在凝胶中是可见的。

使用无污渍凝胶确认正确上样后，检查蛋白质印迹以确定提取活性。通过比较洗脱（E）馏分中底物的量相对于INPUT（I）级分来测量提取活性。流通 （FT） 中的信号显示出一些可变性，但通常与 INPUT 分数相似。WASH （W） 部分不应有信号。通常，阳性对照的提取效率约为10%，阴性对照的提取效率为1-2%（图2）。回想一下，洗脱分数的强度是输入分数的5倍，因此在判断提取效率时需要考虑这一点。如果没有优化重构条件，+ ATP和-ATP样品的提取水平通常相当（图3）。.......

讨论

正确的线粒体功能取决于强大的蛋白质质量控制系统。由于TA蛋白靶向途径的保真度的固有限制，错位的TA蛋白是线粒体的持续应激源。线粒体蛋白质平衡网络的一个关键组成部分是Msp1，它是一种膜锚定的AAA + ATP酶，可从OMM中去除错位的TA蛋白。在这里，我们描述了如何制备蛋白脂质体，共同重建Msp1和模型TA蛋白，并进行提取测定。我们之前使用该测定来证明Msp1直接识别错位的TA蛋白，并且能够在没有任何辅助蛋白或辅因子的情况下从脂质双层中提取这些蛋白^57。

该测定的缺点是重构过程中存在一些可变性。为了控制制备到制备的变异性，我们始终在同一凝胶/蛋白质印迹上包括阳性和阴性对照，以确保我们的测定按预期工作。我们避免在不同日期进行的重建之间进行比较，或对不同的蛋白质印迹进行比较。我们所做的唯一比较是平行重构并在相同的凝胶/蛋白质印迹上运行的样品。我们在数据解释上也相当保守。虽然可以使用ImageJ量化提取效率，但我们通常将实验描述为具有完全活性，中间活性或无活性。

变异性的一个来源是重组.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Biobeads	Bio-Rad	1523920
牛肝磷脂酰肌醇	Avanti	840042C	PI
鸡蛋磷脂酰胆碱	Avanti	840051C	PC
鸡蛋磷脂酰乙醇胺	Avanti	840021C	PE
ECL Select 蛋白质印迹检测试剂	GE	RPN2235
过滤器支持	Avanti	610014
玻璃瓶	VWR	60910L-1
谷胱甘肽离心柱	Thermo Fisher	PI16103
山羊抗兔	Thermo Fisher	NC1050917
微型挤出机	Avanti	610020
聚碳酸酯膜	Avanti	610006	200 nM
Fisher	88518	PVDF 膜	;M
兔抗 FLAG	Sigma-Aldrich	F7245
合成 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸	Avanti	840035C	DOPS
合成 1'，3'-双[1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸]-甘油	Avanti	710335C	TOCL
注射器，1 mL	Norm-Ject	53548-001
注射器，1 mL，气密	Avanti	610017