使用完全纯化的组分重建 Msp1 提取活性

摘要

本文介绍了一种详细的实验方案，利用完全纯化的组分在明确组成的蛋白脂质体中重建 Msp1 提取活性。

摘要

线粒体是氧化磷酸化和凋亡调控的中心，在人类健康中发挥着至关重要的作用。正常的线粒体功能依赖于强大的质量控制系统以维持蛋白质稳态（蛋白稳态）。线粒体蛋白稳态的下降与癌症、衰老、神经退行性疾病以及许多其他疾病相关。Msp1是一种锚定于线粒体外膜的AAA+ ATP酶，通过清除错位的尾锚定蛋白来维持蛋白稳态。我们利用纯化的组分在蛋白脂质体中重建系统，证明了Msp1足以且必需从脂双层中提取一种模型尾锚定蛋白。我们简化的重建系统克服了以往阻碍膜蛋白提取机制深入研究的多项技术障碍。本文中，我们提供了脂质体生成、膜蛋白重建以及Msp1提取实验的详细方法。

引言

细胞的正常功能依赖于一种称为蛋白质稳态（proteostasis）的过程，该过程可确保功能性蛋白质处于正确的浓度和细胞定位¹。蛋白质稳态的失调会导致细胞器功能受损，并与多种神经退行性疾病相关^2,3,4。膜蛋白对蛋白质稳态网络构成了独特的挑战，因为它们必须被靶向至正确的膜结构，同时避免其疏水性跨膜结构域（TMDs）发生聚集⁵。因此，进化出了专门的分子机制，用以屏蔽疏水性TMD免受细胞质环境的影响，并促进其靶向和插入到正确的细胞膜中^{6,7,8,9,10,11,12,13,....}

方案

1. 脂质体的制备

1. 按适当比例混合脂质的氯仿贮存液，以模拟线粒体外膜。
   1. 准备25 mg脂质混合物。我们使用一种先前建立的模拟线粒体膜的脂质混合物，其摩尔比为48:28:10:10:4，包含鸡卵磷脂酰胆碱（PC）、鸡卵磷脂酰乙醇胺（PE）、牛肝磷脂酰肌醇（PI）、合成的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸（DOPS）和合成的1',3'-双[1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂]-甘油（TOCL）。^58,59. 样本计算如下所示 表1.
   2. 将所有脂质储备液恢复至室温后再打开，以减少冷凝水的产生。由于大多数实验室缺乏精确测定脂质浓度的方法，氯仿储备液吸收的任何水分都会改变脂质储备液的浓度，从而影响检测中所用脂质的比例。
   3. 由于脂质储存于玻璃安瓿瓶中，使用1 mL注射器将所需量的脂质转移至玻璃小瓶。向小瓶中加入2 mg二硫苏糖醇（DTT）以防止脂质氧化。操作应迅速，因为氯仿挥发会改变脂质浓度。
   4. 将剩余的脂质转移至一个单独的玻璃小瓶中，并配以聚四氟乙烯（PFTE）垫片密封。向小瓶中加入2 mg DTT，用封口膜包裹后于-20 °C保存，以防止脂质氧化。建议在脂质转移至小瓶后的3个月内使用完毕。为避免记号笔墨水污染氯仿储存液，应将原始安瓿上的标签贴纸转移至玻璃小瓶，而....

结果

为了正确解读结果，必须同时观察免染胶和蛋白质印迹膜。免染胶可确保所有样品上样量相等。观察免染胶时，分子伴侣（GST-钙调蛋白和GST-SGTA）将在上样输入（I）和洗脱（E）泳道中可见。请仔细检查这些条带在所有上样输入样品中的强度是否一致。同样，确保各洗脱样品之间的条带强度也保持一致。洗脱样品的浓度是上样输入样品的5倍，这种强度差异在凝胶中应清晰可见。

在使用免染胶确认上样量准确后，观察 Western 印迹以确定提取活性。通过比较洗脱组分（ELUTE，E）与上样输入组分（INPUT，I）中底物的量来测定提取活性。流穿组分（Flow Through，FT）信号存在一定变异，但通常与上样输入组分（INPUT）相近。洗涤组分（WASH，W）中应无信号。通常情况下，阳性对照的提取效率约为 10%，阴性对照的提取效率为 1–2%图2）。请注意，ELUTE组分的浓度是INPUT组分的5倍，因此在评估提取效率时需考虑这一因素。如果复性条件未优化，则+ATP与-ATP样品中的提取水平通常相近。.......

讨论

线粒体的正常功能依赖于强大的蛋白质质量控制系统。由于TA蛋白靶向途径本身在保真性上存在固有限制，错误定位的TA蛋白会持续对线粒体造成应激压力。线粒体蛋白质稳态网络中的一个关键组分是Msp1，它是一种锚定于膜上的AAA+ ATP酶，能够将错误定位的TA蛋白从线粒体外膜（OMM）上移除。本文中，我们描述了如何制备蛋白脂质体，共重建Msp1与一种模型TA蛋白，并进行提取实验。我们此前曾利用该实验方法证明，Msp1可直接识别错误定位的TA蛋白，并能够在无需任何辅助蛋白或辅因子的情况下，将这些蛋白从脂双层中提取出来⁵⁷。

该检测方法的一个缺点是重建过程存在一定的变异性。为了控制不同制备批次之间的差异，我们总是在同一凝胶或蛋白质印迹实验中包含阳性和阴性对照，以确保检测系统按预期工作。我们避免对不同日期进行的重建实验之间或不同蛋白质印迹结果之间进行比较。我们仅对在同一时间平行重建并运行于同一凝胶或蛋白质印迹上的样品进行比较。此外，我们在数据解读上也持较为保守的态度。尽管可以使用ImageJ对提取效率进行定量分析，但我们通常将实验结果描述为具有完全活.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物珠	Bio-Rad	1523920
牛肝磷脂酰肌醇	Avanti	840042C	PI
鸡卵磷脂酰胆碱	Avanti	840051C	PC
鸡卵磷脂酰乙醇胺	Avanti	840021C	PE
ECL Select 蛋白印迹检测试剂	GE	RPN2235
滤膜支撑板	Avanti	610014
玻璃小瓶	VWR	60910L-1
谷胱甘肽旋转柱	Thermo Fisher	PI16103
山羊抗兔	Thermo Fisher	NC1050917
微型挤出器	Avanti	610020
聚碳酸酯膜	Avanti	610006	200 nM
PVDF 膜	Thermo Fisher	88518	45 µM
兔抗 FLAG 抗体	Sigma-Aldrich	F7245
合成 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸	Avanti	840035C	DOPS
合成 1',3'-双[1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂]-甘油	Avanti	710335C	TOCL
注射器，1 mL	Norm-Ject	53548-001
注射器，1 mL，气密型	Avanti	610017