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方法文章

原位 斑马鱼幼虫和幼鱼在中肾发育过程中的杂交

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DOI：

10.3791/62930

⸱

2021年8月13日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

本文内容

摘要

斑马鱼是研究肾脏发育的重要模型。此处，一种 原位 杂交方案已优化，用于检测斑马鱼幼虫和幼体在中肾发育期间的基因表达。

摘要

斑马鱼在一生中会形成两种肾脏结构。前肾（胚胎肾）在胚胎发育期间形成，并于受精后2天开始发挥功能。前肾仅由两个肾单位组成，在幼体阶段作为唯一的肾脏器官，直至因体质量增加而需要更强的肾功能。为应对更高的生理需求，中肾（成体肾）在变态发育期间开始形成。新的初级肾单位与前肾融合，并形成连通的管腔；随后次级肾单位再与初级肾单位融合（依此类推），从而在中肾中构建出分支状的肾单位网络。由于胚胎操作简便，目前绝大多数研究集中于前肾。因此，有必要开发新技术以研究更年长、体型更大的幼体及幼鱼，从而更深入地理解中肾的发育过程。本文介绍了一种 原位 用于基因表达分析的杂交实验方案已优化，以促进探针渗透、探针和抗体的洗涤，以及色素漂白，从而更清晰地观察中肾。 Tg(lhx1a-EGFP) 转基因品系用于标记祖细胞及新生肾单位的远端小管。该实验方案填补了中肾研究领域的空白，是理解新肾组织如何形成并整合到现有肾单位中的关键模型，同时为再生治疗提供了重要见解。

引言

斑马鱼胚胎因其体型小、通体透明、工具丰富，且在受精后五天内无需进食即可存活，是研究组织发育的重要模型1,2。它极大地促进了人们对肾脏发育以及斑马鱼与哺乳动物之间保守性的理解3,4,5。肾脏在维持体液稳态、过滤血液和排泄废物方面发挥着关键作用6。肾单位是肾脏的功能单位，由一个血液滤过结构与一条长管相连组成。斑马鱼在其一生中会形成两种肾脏结构。前肾（即暂时性的胚胎肾脏）在早期发育阶段首先形成，包含沿头尾轴分布的两个肾单位，并在受精后约2天（dpf）开始发挥功能。前肾的优势在于其结构简单，仅有两个肾单位，且大部分呈线性排列，易于观察（尽管近曲小管在3 dpf时开始出现盘绕）3。这不仅促进了从前中胚层研究其早期发育过程，也有助于研究肾单位的分段模式及小管修复机制7,8。

斑马鱼在受精后5天（dpf）后其应用价值变得有限，此时卵黄已消耗殆尽，幼鱼需依赖水环境中摄食维持生长9。大约在2周龄时，幼鱼经历变态发育转变为稚鱼，期间形成新的组织，原有组织则退化和/或发生重组9。与此同时，中肾（即成体永久性肾脏）开始形成10,11,12。首个成体肾单位在第六体节附近形成，并与前肾的远端早期小管融合。额外的肾单位最初在此位置后方陆续添加，随后也向前方延伸。在第一波发育中形成的初级肾单位与前肾小管融合，并共享一个共同的管腔以排出代谢废物。次级肾单位在后续发育波次中形成，并与初级肾单位融合。这种重复性发育过程最终形成具有分支结构的中肾，形态上与哺乳动物肾脏具有一定相似性。推测前肾最终失去其小管特征，转变为两条主要的集合管，所有肾单位均通过此结构排泄废物13。

在首个成体肾单位形成之前，单个前体细胞开始出现在约4毫米（总长度）的幼鱼（约10天龄）中。这些细胞在Tg(lhx1a-EGFP)转基因品系中标记可见，附着于前肾，并似乎向未来肾发生的部位迁移。这些单个细胞聚集成簇，进而分化形成新的肾单位12。目前尚不清楚这些细胞在中肾发生开始之前所处的位置及其表达的基因。

了解中肾的发育过程能够提供哺乳动物肾脏发育的深入见解，这是前肾所无法实现的。这些见解包括由单个祖细胞形成生肾细胞团、新肾单位与已有肾单位的功能性整合，以及分支形态发生。然而，对胚胎后发育过程的研究存在局限性。由于幼体体型较大且具有色素沉着，其透明度较低；个体间的发育时间线不同步，且高度依赖于环境因素，例如喂养条件和种群密度。9,14尽管存在基因敲低试剂，但其在幼虫中的效果较胚胎差15在此方案中，一种 原位 一种用于检测斑马鱼中肾发育过程中基因表达的杂交方法。优化了多个步骤，以增强中肾的可视化效果以及探针和抗体的渗透与洗涤效果。该 Tg(lhx1a-EGFP) 转基因品系与EGFP探针联用，可标记单个前体细胞、生肾团簇以及新生肾单位的远端小管。该方法将有助于深入理解中肾的发育过程，并为再生治疗提供理论依据。

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方案

斑马鱼幼虫和幼鱼的使用已获得IUP IACUC的批准（方案编号 #02-1920，#08-1920）。溶液成分的详细信息见于材料表中。

1. 幼虫培养

注意：将幼虫和幼体培养至目标阶段可能需要21天或更长时间。

  1. 在下午晚些时候（最后一次喂食后），将1条雄鱼和1条雌鱼放入交配缸中，以建立成年斑马鱼的交配配对。
    ​注意：并非所有斑马鱼配对都会成功交配。初次实验建议设置20对鱼以确定交配率，并据此调整后续实验方案。
  2. 次日，在鱼完成交配后（约下午1点），用E3培养基在培养皿中收集胚胎。
    1. 确保每个培养皿中的胚胎不超过30个。
    2. 清除培养皿中的杂质（如粪便），并加入20 mL E3培养基。
    3. 在28.5 °C条件下孵育1天。
  3. 将成年斑马鱼放回水生系统中。
  4. 在受精后1天（1 dpf），更换为新鲜的E3培养基。
    1. 在28.5 °C继续孵育4天，直至5 dpf。
  5. 在2.8 L的鱼缸中放置一个400 µm的筛网，并加入2 cm深的系统用水。
    1. 将来自一个培养皿的5 dpf幼鱼（最多共30条幼鱼）转移至筛网中。
    2. 将鱼缸放入水生系统中，但暂不开启水流。
  6. 每天两次，每次投喂4 mL粉末饲料，持续至14 dpf。
  7. 在6 dpf时，开启水流，调节至每秒1滴。
    注意：每日检查水流情况，并根据需要进行调整。
  8. 在8 dpf时，将水流增加至缓慢而稳定的持续流动状态。
  9. 在14 dpf时，除粉末饲料外， дополнительно投喂活体丰年虾。

2. 第1-2天——固定幼虫

  1. 在预定时间点取出一缸幼虫。
  2. 向培养皿中加入 20 mL 系统用水。
  3. 使用细网筛轻轻捞起幼虫，并将其转移至水面。
    1. 剪去移液管尖端，使其开口更宽，然后将幼虫转移至培养皿中。较大的管口可一次性转移多个小型幼虫或少数较大的幼虫。
  4. 加入 2 mL 三卡因（2%，pH 7 储存液）以固定幼虫。
    1. 待幼虫停止活动后，吸除大部分液体，并加入 10 mL 三卡因。继续孵育 15 分钟，确保幼虫被完全安乐死。
    2. 可选步骤：对于体长超过 8 mm 的幼鱼，在解剖显微镜下用剃刀片切除头尾（在安乐死后进行），以提高固定液的渗透效果。切除前需记录每条个体的总长度，并将每条幼鱼单独置于不同的培养皿中。测量方法参见步骤 3。
  5. 用 20 mL 固定液（4% 多聚甲醛，1% DMSO）替换三卡因溶液。盖上培养皿盖子，在通风橱内缓慢摇动。
    注意：必须使用摇床平台。使用圆形振荡方式的振荡器会导致动物体轴弯曲。仅使用新鲜配制（非预先冷冻保存）的固定液。
    警告：固定液含有多聚甲醛，可能具有致癌性。称量粉末时应使用通风橱（或佩戴口罩）和手套。
  6. 30 分钟后，更换为新鲜固定液。
    1. 将用过的固定液收集至专用废液容器中，以便妥善处理。
    2. 将幼虫转移至含有 25 mL 新鲜固定液的 50 mL 离心管中。
    3. 确保管盖拧紧，在 4 °C 下缓慢摇动固定 2 天。可根据实验安排适当延长孵育时间。

3. 第3天：测量幼虫

  1. 在通风橱中，用 20 mL PBST 替换固定液。
  2. 将幼虫转移至培养皿中。
  3. 将一把平直尺放在解剖显微镜上，并将培养皿置于直尺上方。
  4. 使用睫毛操作工具将每条幼虫移至直尺上，测量其总长度（从吻部至尾鳍末端）（图 1）。
  5. 将多条长度相近的幼虫（例如 5.0 mm 和 5.1 mm）合并至一个 5.5 mL 玻璃小瓶中，每瓶最多放入 10 条幼虫。

4. 第3 - 4天：脱水

  1. 用 4 mL 100% 甲醇替换 PBST，在室温下振荡孵育 5 分钟。
  2. 弃去甲醇，加入新鲜甲醇，振荡 5 分钟。重复此步骤一次。
  3. 将小瓶置于 -20 °C 保存 2 天。为方便起见，也可延长孵育时间。

5. 第5天：重水化

  1. 将小瓶恢复至室温。
  2. 用 4 mL 75% 甲醇/25% PBST 替换甲醇，室温下摇动 5 分钟。
  3. 用 4 mL 50% 甲醇/50% PBST 替换步骤 5.2 中的溶液，摇动 5 分钟。
  4. 用 4 mL 25% 甲醇/75% PBST 替换步骤 5.3 中的溶液，摇动 5 分钟。
  5. 用 4 mL PBST 替换步骤 5.4 中的溶液，摇动 10 分钟。
  6. 用 4 mL 新鲜 PBST 替换 PBST，摇动 10 分钟，再重复一次。

6. 第5天：蛋白酶K消化

  1. 用 2 mL 蛋白酶 K 溶液（20 µg/mL，PBST 中 DMSO 终浓度为 1%）替换 PBST，室温摇动孵育 30 分钟。
    注意：体长超过 6 mm 的幼虫需要更长的孵育时间 和/或 更高的蛋白酶 K 浓度。具体时间和浓度需通过实验确定。建议每超出 6 mm 0.5 mm，孵育时间增加 10 分钟。
  2. 用 4 mL PBST 替换蛋白酶 K 溶液，摇动 10 分钟。
  3. 用 4 mL 新鲜 PBST 替换原有 PBST，摇动 10 分钟。重复一次。
  4. 用 4 mL 新鲜固定液替换 PBST，摇动孵育 1 小时。为方便起见，也可在 4 °C 下延长孵育时间。

7. 第5天：漂白

  1. 用 4 mL PBST 替换固定液，在室温下摇动 10 分钟。
  2. 用 4 mL 新鲜 PBST 替换原有 PBST，摇动 10 分钟。重复一次。
  3. 将幼虫转移至 6 孔板中（每孔最多 10 条幼虫）。
  4. 用 3 mL 新鲜漂白液替换 PBST。
  5. 在室温下摇动，并每隔 5 分钟在解剖显微镜下观察色素情况。观察中肾区域（位于 swim bladder 和肠道背侧）色素消失的情况。
    注意：对于长度不超过 6 mm 的幼虫，漂白中肾周围色素最多需要 20 分钟。漂白时间不宜过长，以免影响幼虫结构完整性。
  6. 将幼虫重新转移回玻璃小瓶中。
  7. 用 4 mL PBST 替换漂白液，摇动 10 分钟。
  8. 用 4 mL 新鲜 PBST 替换原有 PBST，摇动 10 分钟。重复一次。
  9. 用 4 mL 新鲜固定液替换 PBST，摇动 1 小时。如需方便操作，也可在 4 °C 下孵育更长时间。

8. 第5天：预杂交

注意：在70 °C下进行的步骤中，需迅速操作，以尽量减少离心管冷却。

  1. 用 4 mL PBST 替换固定液，室温下摇动 10 分钟。
  2. 用 4 mL 新鲜 PBST 替换原有 PBST，摇动 10 分钟。重复一次。
  3. 用 4 mL 杂交阴性溶液（Hyb- 溶液）替换 PBST，室温下摇动 10 分钟。
    注意：Hyb-、Hyb+ 和探针溶液含有甲酰胺，可能刺激皮肤。操作这些溶液时应佩戴手套。
  4. 用 4 mL 新鲜 Hyb- 溶液替换原有 Hyb- 溶液，摇动 10 分钟。再重复一次。
    1. 将使用过的 Hyb-、Hyb+ 和探针溶液收集至单独的废液容器中，以便妥善处理。
  5. 用 4 mL Hyb+ 溶液替换 Hyb- 溶液。
  6. 将样品管在 70 °C 下孵育过夜。
  7. 将 EGFP-荧光素探针用 500 µL Hyb+ 溶液按 1:100 稀释，于 70 °C 孵育过夜。
    ​注意：请遵循制造商提供的探针合成说明。

9. 第6天：探针杂交

  1. 将小管中的 Hyb+ 溶液更换为预热的探针，并在 70 °C 下孵育过夜。
    注意：体长超过 6 mm 的幼虫需要孵育 2 天。
  2. 将洗涤缓冲液、2x SSCT 和 0.2x SSCT 溶液预热至 70 °C，用于过夜孵育。

10. 第7天：探针洗涤

  1. 将探针替换为 4 mL 预热的洗涤缓冲液，在 70 °C 下孵育 30 分钟。
    1. 将使用过的探针收集到单独的废液容器中，以便妥善处理。
  2. 用 4 mL 新鲜洗涤缓冲液替换原有洗涤缓冲液，在 70 °C 下孵育 30 分钟。
  3. 用 4 mL 预热的 2x SSCT 溶液替换洗涤缓冲液，在 70 °C 下孵育 15 分钟。
  4. 将 50 mL 预热的 0.2x SSCT 加入一个 50 mL 离心管中。
    1. 将细胞筛网（100 µm）插入管口顶部，确保将其完全推到底部直至无法再下压。
    2. 将幼虫从玻璃小瓶转移至细胞筛网中，确保幼虫完全浸没在缓冲液中，在 70 °C 下孵育 2 小时。
  5. 准备一个新的离心管，其中含有 50 mL 预热的 0.2x SSCT。
    1. 将步骤 10.4.2 中的细胞筛网转移至新的 0.2x SSCT 管中，在 70 °C 下孵育 2 小时。
    2. 重复步骤 10.5 一次。

11. 第7天：封闭

  1. 将幼虫转移至新的玻璃小瓶中，并冷却至室温。
  2. 用 4 mL 的 67% 0.2x SSCT / 33% MABT 替换 0.2x SSCT，室温下振荡 10 分钟。
  3. 用 4 mL 的 33% 0.2x SSCT / 66% MABT 替换步骤 11.2 中的溶液，振荡 10 分钟。
  4. 用 4 mL MABT 替换步骤 11.3 中的溶液，振荡 10 分钟。
  5. 用 4 mL 新鲜 MABT 替换 MABT，振荡 10 分钟，再重复一次。
  6. 用 4 mL 封闭液替换 MABT，4 °C 下孵育过夜。为方便起见，也可孵育更长时间。

12. 第8 - 9天：抗体孵育

  1. 在500 µL封闭液中以1:5,000比例稀释抗荧光素抗体。
  2. 用抗体溶液替换封闭液，在4 °C孵育2天。为方便起见，可延长孵育时间。
    1. 每天轻摇小瓶两次，以搅动幼虫。
      ​注意：体长超过6 mm的幼虫需要额外孵育1–2天。

13. 第10 - 11天：抗体洗涤

  1. 用 4 mL PBST 替换抗体溶液，室温下摇动 10 分钟。
  2. 用 4 mL 新鲜 PBST 替换原有 PBST，摇动 10 分钟。重复一次。
  3. 将幼虫转移至 50 mL 离心管中。
  4. 加入 40 mL PBST2，将离心管平放，4 °C 下摇动过夜。
  5. 用 40 mL 新鲜 PBST2 替换原有 PBST2，4 °C 下摇动过夜。可根据需要延长孵育时间。
    ​注意：体长超过 6 mm 的幼虫需要额外 1–2 天的洗涤时间。

14. 第12天：染色

  1. 将幼虫转移至6孔板中。
  2. 用3 mL染色缓冲液替换PBST2，室温下摇动5分钟。
  3. 用3 mL新鲜染色缓冲液替换原有缓冲液，摇动5分钟。重复一次。
  4. 用3 mL染色液替换染色缓冲液，用铝箔包裹，并在接下来的几小时内监测染色情况。
    1. 对于信号较弱的探针，可在4 °C下过夜孵育，并在中途更换一次新鲜染色液。
  5. 当达到理想的染色强度后，用3 mL终止液替换染色液，摇动30分钟。
  6. 用3 mL新鲜终止液替换原有终止液，摇动30分钟。重复一次。
  7. 将幼虫转移至新的玻璃小瓶中，用4 mL新鲜固定液替换终止液，在室温下孵育1小时。也可为方便起见，在4 °C下延长孵育时间。
  8. 将幼虫置于固定液中，避光保存于4 °C，可保存长达一年。

第15天：成像

  1. 用 4 mL PBST 替换固定液，在室温下振荡 10 分钟。
  2. 将幼虫转移至 6 孔板中。
  3. 用 4 mL 新鲜 PBST 替换 PBST，振荡 10 分钟。重复一次。
  4. 用 3 mL 50% 甘油（溶于 PBST）替换 PBST，振荡 10 分钟。
  5. 将步骤 15.4 中的溶液替换为 3 mL 100% 甘油，不振荡，静置 10 分钟。
  6. 使用解剖显微镜直接在 6 孔板中对幼虫成像，或将幼虫转移至凹面载玻片中，使用复式显微镜进行成像。使用睫毛操作工具调整幼虫的方向。

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结果

使用 Tg(lhx1a-EGFP) 转基因品系，已证明这一点 原位 杂交实验方案在标记中肾发育过程中的肾祖细胞及多种肾单位结构方面具有显著效果。如预期所示，该转基因品系中也标记了中枢神经系统（未展示）。初始的中肾肾单位约在5.2 mm时期形成，位于前肾的背侧图 2A），且该肾单位的远端小管由EGFP标记10,12此时及后续阶段均可见祖细胞簇（图 2A-B，箭头），并标记了单个前体细胞（图2C该方法为研究肾脏发育提供了另一种工具，有助于深入理解人类肾脏的发育机制。

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讨论

的 原位 此处描述的杂交方法旨在研究中肾的发育，但也可用于研究变态期间其他组织和器官的发育，例如肠道、神经系统、鳞片和色素沉着。14探针可用于内源性基因或转基因品系中的荧光标记物。

为了在天然环境中观察器官和组织，保持幼虫的完整性至关重要。为维持组织完整性，必须尽量缩短蛋白酶K处理时间。对于每一批新的酶，确定最佳处理时间非常重要。或者，可使用丙酮替代蛋白酶K以提高组织完整性16。过度漂白也会降低组织完整性。尽量减少漂白，并使眼睛保留部分色素，有助于在洗涤过程中观察幼虫。在杂交步骤中眼睛脱落是常见现象，这表明组织较为脆弱。在固定液和蛋白酶K溶液中加入DMSO对组织通透性至关重要17。

该方法的一个局限性在于试剂在较大动物体内的渗透性较差。为改善渗透性，可在固定前用剃须刀片切除头部和尾部17。固定后，可使用精细镊子和钨针去除...

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致谢

经费由宾夕法尼亚科学院、宾夕法尼亚州生物学家协会以及印第安纳宾夕法尼亚大学（研究生院与研究部、生物学系及辛西娅·苏沙克本科生生物学卓越基金）提供。转基因品系Tg(lhx1a-EGFP)由尼尔·胡克里德博士（匹兹堡大学）提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗荧光素抗体Roche/Sigma-Aldrich11426338910
漂白液0.8% KOH, 0.9% H2O2 溶于 PBST
封闭剂Roche/Sigma-Aldrich11096176001用于配制封闭溶液，按生产商说明书配制
细胞筛Fisher Scientific 22-363-549100 μm
E3 培养基5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% 亚甲蓝
眼睫毛操作器Fisher ScientificNC1083208用于操作幼虫
固定液4% 多聚甲醛，1% DMSO 溶于 PBS；在 65°C 下振荡加热至粉末完全溶解，冷却后加入 DMSO
荧光素探针合成试剂Roche/Sigma-Aldrich11685619910
玻璃小瓶Fisher Scientific03-338B
Hatchfry 包埋剂Argent
杂交缓冲液（Hyb- 溶液）50% 甲酰胺，5X SSC，0.1% Tween-20
杂交增强液（Hyb+ 溶液）Hyb- 溶液，5 mg/mL 玉米酵母 RNA，50 μg/mL 肝素
MAB（10X）1 M 马来酸，1.5 M NaCl，pH 7.5
MABT1X MAB，0.1% Tween-20
马来酸Sigma-AldrichM0375
多聚甲醛Sigma Aldrich158127
PBS（10X）8% NaCl，0.2% KCl，1.44% Na2HPO4，0.24% KH2PO4
PBST1X PBS，0.1% Tween-20
PBST21X PBS，0.2% Tween-20
粉末饲料将螺旋藻和 Hatchfry 包埋剂各 2 g 溶于 50 mL 鱼类系统用水中，充分混匀
蛋白酶 KSigma-AldrichP5568用于幼虫通透处理
蛋白酶 K 溶液终浓度为 20  μg/mL，含 1% DMSO 的 PBST 溶液
螺旋藻微细粉Argent
SSC（20X）3 M NaCl，0.3 M 无水乙酸钠，pH 7，高压灭菌
SSCT（0.2X）由 20X SSC 稀释而成，含 0.1% Tween-20
SSCT（2X）由 20X SSC 稀释而成，含 0.1% Tween-20
染色缓冲液100 mM Tris（pH 9.5），50 mM MgCl2，100 mM NaCl，0.1% Tween-20
染色液染色缓冲液中含 200 μg/mL 碘硝基四氮唑氯化物和 200 μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸双钠盐
终止液1 mM EDTA（pH 5.5）溶于 PBST
玉米酵母（酵母）RNASigma-AldrichR6625
三卡因（Tricaine）Sigma AldrichE105212%，pH 7
洗涤缓冲液50% 甲酰胺，2X SSC，0.1% Tween-20

参考文献

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基因表达分析肾祖细胞前肾形成杂交实验方案蛋白酶K消化抗体染色解剖显微镜
原位 斑马鱼幼虫和幼鱼在中肾发育过程中的杂交
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