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利用多功能系统对人癌细胞和正常细胞中Yes相关蛋白进行全光学机械生物学研究

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DOI：

10.3791/62934

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2021年12月20日

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1Department of Electrical and Computer Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, 4Department of Radiation Oncology, College of Medicine, University of Florida, 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种详细的逐步实验方案，阐述如何利用一种集成的多功能且用户可编程的系统，实现自动化的多通道成像和力学-生物学分析，以阐明Yes相关蛋白（YAP）的力学敏感性。

摘要

长期对活细胞进行多功能成像与分析需要对多种硬件和软件平台进行高效、功能协调的整合。然而，手动控制来自不同制造商的各种设备费时费力，可能降低所获取数据的准确性、可重复性和质量。因此，开发一种一体化且用户可编程的系统，能够实现自动、多功能、长期的图像采集，并兼容大多数荧光显微镜平台，将为科学界带来显著益处。本文介绍了利用一种新型集成软件系统的完整操作流程，该系统包括：（1）自主开发的软件程序“自动多功能集成程序（AMFIP）”，可实现多通道图像的自动采集；（2）一系列定量图像分析与细胞牵引力计算软件包。

该集成系统被用于揭示机械敏感性Yes相关蛋白（YAP）在空间-时间上的分布与细胞力学特性（包括细胞铺展和牵引力）之间此前未知的关系，研究对象为经CRISPR/Cas9基因编辑的人类正常细胞（B2B）和肺癌细胞（PC9）。利用该系统具备的多通道控制与读出能力，实验结果表明：（1）B2B正常细胞与PC9癌细胞在细胞铺展和迁移过程中，YAP表达、牵引力与细胞动态之间表现出显著不同的关系；（2）PC9癌细胞在细胞核周围对基底施加了明显的力学作用力。综上所述，本文提供了一套详细的分步操作方案，介绍如何使用一种可用户编程的集成系统，实现自动化的多功能成像与分析，以阐明YAP的力学敏感性。这些工具为深入探究细胞生理与病理背景下复杂多样的信号动态提供了可能。

引言

本方法的总体目标是实现对活细胞的全光学多功能成像与分析。一种一体化的成像程序能够自动协调多种功能的光电设备，减少耗时且易出错的人工操作，对于科研人员开展长期活细胞成像研究至关重要1,2,3,4。然而，目前生物医学研究领域中大多数现有的公开程序，要么仅适用于有限的光电设备，要么需要额外的硬件来协调不同设备之间的运行5,6,7,8,9。最近，已开发出一种基于软件的开源程序，名为"自动多功能集成程序（AMFIP）"，可实现多通道和时间序列成像。AMFIP基于Java语言及µManager的应用程序编程接口（API）11,12，作为µManager的一个插件开发，通过执行自定义的Java脚本，实现多种光电软硬件平台之间的软件通信，适用平台包括但不限于尼康（Nikon）设备。AMFIP的建立为可编程、多功能地探究细胞行为提供了可能。本文开发了一套集成化的实验与计算系统，将AMFIP与数字图像分析及细胞牵引力显微镜技术相结合。该系统揭示了在CRISPR/Cas9基因编辑的人类正常B2B细胞系（图1）和肺癌PC9细胞系（图2）中YAP力学生物学特性的差异。该系统为科学界提供了一种全面的解决方案，避免了因需购置额外控制设备而可能面临的设备不可获得或与现有成像系统不兼容的问题。

本文介绍的实验方案旨在：（1）应用AMFIP技术对表达mNEonGreen2标记YAP的CRISPR/Cas9基因编辑细胞系进行自动化的长期成像；（2）结合Fiji ImageJ、MATLAB和Origin软件，基于荧光强度对YAP的核/胞质（N/C）比值进行定量分析图3 和 图4），细胞位移场（图1C 和 图2C）以及细胞牵引力场（图1D 和 图 2D）。结果表明，（1）在具有生理相关机械刚度的基底上，细胞铺展的前10小时内13,14,15,16,17,18，单个B2B细胞的YAP N/C比值相较于单个PC9细胞表现出更显著的时间依赖性变化和波动图5 和 图6）；以及（2）PC9癌细胞在其核周区域产生明显的牵引力（图7）。本方案所描述的集成系统与方法超越了特定类型的细胞和光遗传学分子。研究人员可应用这些方案，定制其特定的活细胞检测实验，以阐明细胞生理学与病理学背景下的多层面信号动态。

方案

1. 生成稳定表达内源性mNeonGreen21-10/11标记YAP蛋白的CRISPR/Cas9编辑人肺癌细胞系（PC9）和人支气管上皮细胞系（Beas2B）

  1. 进行聚合酶链式反应（PCR）以扩增编码11的DNA序列th 荧光蛋白mNeonGreen2的链，使用高保真DNA聚合酶（见 材料表).
  2. 使用CRISPR-Cas9基因编辑系统将扩增的DNA序列敲入PC9和B2B细胞系的YAP基因组位点。
    注意：该DNA序列与mNeonGreen2的第1-10条链互补，可发出荧光。YAP-mNeonGreen2的基因组序列图谱1-10/11 如图所示 补充图 S1该图谱包含标记的基因组序列、供体序列和mNeonGreen2序列。
  3. 使用落射荧光显微镜检测CRISPR/Cas9基因编辑的mNeonGreen2表达（参见 材料表）。由于mNeonGreen2在细胞于其天然基因调控网络背景下表达YAP时会与YAP融合标记，因此需检测CRISPR/Cas9基因编辑细胞中荧光强度的存在情况，并与亲本细胞（对照）进行比较。
    注意：按照本实验方案，需使用（1）488 nm 激光器（47.5 mW/mm²）；（2）配备 525/50 nm 发射滤光片的荧光检测器；（3）流式细胞仪或共聚焦显微镜系统。确保所有光学组件均经过校准，并在实验前预热至少 30 分钟。操作人员应佩戴防激光护目镜，并遵循所在机构的生物安全与激光安全规程。2)用于激发，(2) 40倍物镜（数值孔径（NA）= 0.95）和带通发射滤光片（ET525/50 nm）用于荧光检测，以及(3) ImageJ软件用于测量、定量和比较荧光强度。
  4. 确认 mNeonGreen2 的正确整合11 通过从CRISPR/Cas9编辑的细胞系中提取基因组DNA，使用跨越基因组插入位点的引物进行PCR扩增，并通过测序确认插入片段位于正确的基因组位点19,20.
  5. 敲低 mNeonGreen211 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统，并采用步骤1.3中所述的相同显微镜系统和成像参数检测细胞中荧光强度的降低。
    注意：此步骤用于确认 mNeonGreen2 的正确整合11 通过比较荧光强度进行分析。未进行基因敲低的CRISPR/Cas9基因编辑细胞及亲本细胞作为对照。
  6. 通过荧光激活细胞分选（FACS）收集表达目标标签蛋白的细胞。
    1. 为进行FACS分选，用胰蛋白酶消化细胞并将其重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    2. 通过两轮FACS分选，收集mNeonGreen2荧光信号高于亲本细胞系背景水平的细胞。
      注意：构建此处所述CRISPR/Cas9基因编辑细胞系的时间周期约为1至2个月。所有细胞系均可应要求向其他研究实验室公开提供，以便结果的重复验证。

2. PC9 和 B2B 细胞的培养

  1. 将两种细胞系均置于含5% CO₂的湿润化组织培养孵箱中培养2 在 37 °C.
  2. 培养106 内源标记的PC9和Beas2B细胞，置于75 cm²培养瓶中2 添加10%胎牛血清的12 mL RPMI-1640培养基的培养瓶 100 µg/mL 青霉素-链霉素。当细胞汇合度达到约80%时，对两种细胞系进行传代培养。
  3. 每3个月使用支原体检测试剂盒对两种细胞系进行支原体检测，严格遵循制造商推荐的全部操作步骤。
  4. 将细胞系储存在 -80 °C 冰箱
  5. 使用以下细胞系 <所有实验均使用解冻后的20个样本。

3. 硬件和软件环境的设置

  1. 实验的硬件环境设置
    1. 将共聚焦控制器和倒置显微镜连接到计算机（参见材料表）。
    2. 安装软件平台（材料表）。
    3. 打开共聚焦控制器和倒置显微镜，然后启动Elements。
    4. 在Elements中打开共聚焦、激光器和倒置显微镜的控制面板。接着通过测试电动载物台的移动、显微镜物镜的切换以及激光线的空间扫描，检查这三个面板是否正常工作。
  2. AMFIP软件环境设置
    1. 在计算机上安装IntelliJ、Java开发工具包14.0、µManager 2.0 gamma版本以及Fiji ImageJ。
    2. 在IntelliJ中打开从GitHub下载的AMFIP项目（链接：https://github.com/njheadshotz/AMFIP）。
    3. 点击Settings | Compiler | Annotation Processors，并勾选Enable annotation processing。
    4. 点击Project Structure | Artifacts并创建一个JAR文件，将输出目录设置为µManager目录下的mmplugins。
    5. 点击Project Structure | Libraries，并将µManager目录下的mmplugins和plugins添加进去。
    6. 在Run下拉菜单中点击add Configuration，并创建一个应用程序。
    7. 在Main class中输入ij.ImageJ。
    8. 在VM option中输入-Xmx3000m -Dforce.annotation.index=true。
    9. 将µManager目录设置为Work directory。
    10. 点击Run以启动带有AMFIP插件的µManager。
  3. 将µManager与倒置显微镜连接。
    1. 将倒置显微镜的适配驱动程序21添加到µManager目录中。
    2. 打开µManager，点击Devices | Hardware Configuration Wizard，并创建一个新的配置。
    3. 在Available Devices下添加Ti2驱动程序。
    4. 选择所有外设设备，并保存新的配置文件。
    5. 重新启动µManager，并在Micro-Manager Startup Configuration中选择步骤3.2.4创建的配置文件。

4. 凝胶制备

  1. 在室温（24 °C）下用 3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理玻璃盖玻片 7 分钟。
  2. 使用去离子水（DI 水）冲洗玻璃盖玻片，并在 160 °C 下干燥 20 分钟。
  3. 用 0.5% 戊二醛处理玻璃盖玻片 30 分钟，然后用去离子水冲洗。
  4. 将丙烯酰胺溶液、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（bis）溶液以及悬浮于 10 mM HEPES 缓冲盐水中的荧光微球混合。使用 10%（w/v）过硫酸铵溶液和 N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）作为聚合引发剂。根据先前报道的成熟方案13,14，调整各组分百分比以获得所需机械刚度的聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶。
    注意：本方案中，2 kPa 凝胶：丙烯酰胺 = 12.5%，双丙烯酰胺 = 6.5%；5 kPa 凝胶：丙烯酰胺 = 12.5%，双丙烯酰胺 = 21.5%；40 kPa 凝胶：丙烯酰胺 = 12.5%，双丙烯酰胺 = 31.5%。所列所有百分比均为体积百分比。
  5. 35 分钟后，将玻璃盖玻片从固化的 PAA 水凝胶上剥离，并用 50 mM HEPES 缓冲盐水洗涤水凝胶两次（每次 5 分钟）。
  6. 用肼水合物溶液处理水凝胶表面 6 小时。
  7. 用乙酸冲洗水凝胶 30 分钟，去除乙酸后用 PBS 冲洗 30 分钟。
  8. 用高碘酸钠氧化纤维连接蛋白溶液（50 µg/mL 的 PBS 溶液）30 分钟。
  9. 用氧化后的纤维连接蛋白溶液包被水凝胶表面，静置 35 分钟。
  10. 加入 PBS 浸没水凝胶，并在 4 °C 下保存。用铝箔覆盖所有含有水凝胶的培养皿，避免水凝胶暴露于光照下。

5. 细胞培养

注意：使用无菌技术进行细胞培养。

  1. 将带有 PAA 水凝胶的玻璃盖玻片粘合到 35 mm 玻璃底培养皿上，以避免在细胞接种和成像过程中水凝胶发生物理漂移。
    1. 使用灭菌的洁净镊子，从装有已制备水凝胶的培养皿中取出盖玻片（顶部带有 PAA 水凝胶）。
    2. 用干燥的擦拭纸清除玻璃盖玻片底面的水滴。
    3. 使用灭菌镊子夹持玻璃盖玻片。
    4. 在盖玻片底面的两个对角角落处，滴加少量氰基丙烯酸酯胶水（1–5 µL）。
    5. 使用灭菌擦拭纸去除多余的胶水。
    6. 使用灭菌镊子将盖玻片放回玻璃底培养皿中。轻轻按压盖玻片的角落，确保胶滴与培养皿表面充分接触。
    7. 将培养皿盖重新盖上，以减少 PAA 水凝胶中 PBS 的蒸发。静置 3 分钟，使胶水在培养皿中充分固化和干燥。
    8. 向培养皿中加入 4 mL PBS。
    9. 对用于成像的其他培养皿中的剩余 PAA 水凝胶样品，重复上述步骤 5.1.1–5.1.8。
    10. 使用 75% 乙醇对所有培养皿的外表面进行灭菌，并将其转移至组织培养生物安全柜中。打开紫外灯照射 5 分钟，对样品进行灭菌。
  2. 将细胞接种到水凝胶的上表面。
    1. 关闭紫外灯。将含有 B2B/PC9 细胞的培养瓶从 37 °C 培养箱中取出，放入生物安全柜中。使用连接真空泵的移液器吸除全部培养基，并加入 5 mL PBS 清洗培养瓶。
    2. 加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶，使细胞从培养瓶底部脱落。
    3. 将培养瓶放入培养箱中，静置 5 分钟。
    4. 将培养瓶转移回生物安全柜中，向瓶内加入 8 mL 新鲜培养基，并反复吹打数次，使细胞均匀悬浮。
    5. 将全部 10 mL 细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
    6. 检查离心管底部的细胞沉淀。缓慢将离心管水平倾斜，使用移液器小心吸除所有培养基，避免触碰细胞沉淀。随后加入 8 mL 新鲜培养基，反复吹打数次，直至所有细胞与培养基均匀混合。
    7. 在水凝胶表面滴加 100 µL 细胞悬液（150 个细胞/µL），静置 5 分钟。随后缓慢向培养皿中加入 4 mL 新鲜培养基；注意避免将新鲜培养基直接滴加在水凝胶表面。
    8. 将培养皿放入 37 °C 培养箱中，静置以使细胞贴附于水凝胶表面（B2B：0.5–1 小时；PC9：4–5 小时）。

6. 细胞成像

注意：AMFIP 通过与不同的硬件和软件系统协同工作，实现自动、多通道和长期成像：（1）AMFIP 操控 µManager，自动移动 Ti2-E 显微镜的电动载物台至多个视野（FOVs），并通过单色相机获取明场图像（材料表）；（2）AMFIP 通过自定义的 Java 脚本在 Elements 中激活多个宏文件，以完成共聚焦 z 层成像以及不同激光通道（405 nm 和 488 nm）切换的自动化操作。

  1. 设置长期成像的环境。
    1. 将环境培养室放置于倒置显微镜的电动载物台上。设定CO₂浓度2 流速调至160 mL/min，并调节腔室温度（顶部： 44 °C；浴液： 42 °C；阶段： 40 °C。接着，向室的浴槽中加入40 mL纯化水。
    2. 从培养箱中取出带有细胞的玻璃底培养皿，放入环境培养室中。
    3. 打开共聚焦显微镜控制器和倒置显微镜。将光路切换至右侧，观察细胞贴壁情况 µMana如果已有足够细胞贴附于凝胶上，则将培养皿放回培养箱。如果细胞贴附不足，则B2B细胞继续孵育30分钟，PC9细胞继续孵育60分钟。
    4. 剪下两小段胶带，粘贴在腔体的圆形孔周围。然后，在胶带上涂抹少量粘合胶（仅涂抹在培养皿将要覆盖的区域）。
    5. 从培养箱中取出培养皿。接着，缓慢将培养皿放入腔室中，使培养皿底部与胶水接触。
    6. 按压培养皿盖1分钟，使胶水与培养皿充分接触并固化。随后，轻轻水平推动培养皿，确认其在腔室内固定不动。
    7. 关闭室盖。
  2. 设置明场成像的图像采集参数。
    1. 开放 IntelliJ 并设置一个参数 T1 （例如，120 s）在文件第93行 Elements_script.java确保该数值大于宏的运行时间 元素 用于一个视野（FOV）的共聚焦成像。点击 运行 开始的按钮 AMFIP IntelliJ 项目.
    2. 点击 活体 和 多维采集 主界面中的按钮 µManager接下来，将倒置显微镜的光路切换至右侧以进行明场成像，切换至10倍物镜，并打开发光二极管（LED）光源（明场成像的光源；强度：5%）。
      1. 点击光路、显微镜物镜和LED灯按钮 元素 Ti2 面板或手动按压显微镜上的相应按钮。
    3. 调节XY方向操纵杆和Z轴旋钮，以确定培养皿中凝胶的正确位置和最佳焦平面。使用10倍物镜寻找多个附着于凝胶上的单细胞的合适视野。
    4. 检查 多个位置（XY） 盒子上的 多维采集 窗口。单击 编辑位置列表... 按钮并观察 阶段位置列表 弹出的窗口。接下来，将物镜切换至40倍，将LED光源强度增加至15%，重新调节电动XY载物台以定位视野（FOVs），并通过点击记录坐标 马克 按钮 阶段位置列表 窗口。
    5. 记录67个所需的视野。单击 另存为... 按钮 阶段位置列表 窗口以记录坐标。输入 T1 （在步骤 6.2.1 中定义的参数，例如 120 s）输入到 时间间隔 成像采集的 T1 在 时间点 部分在 多维采集 窗口
  3. 设置2D-YAP和微珠图像的图像采集参数。
    1. 开放 元素，将光路切换至右侧以进行共聚焦成像，并关闭LED光源。接着，点击 移除联锁 按钮并打开 FITC 激光通道 （用于YAP成像）通过检查 FITC 盒子
    2. 将扫描速度调整为每2秒1帧，方法是点击 1/2 按下按钮并旋转Z平面旋钮，快速找到贴壁细胞的Z轴位置。记录Z层扫描的下限和上限位置。
    3. 点击 大体 在顶部功能区中，选择 宏编辑器 在……之下 大体 下拉菜单，并将步骤 6.3.2 中的值输入到宏文件中。
    4. 打开4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）激光通道（用于微珠成像）的复选框 DAPI 盒中查找并记录微珠的聚焦Z位置。前往 宏编辑器 并将记录的值输入到宏文件中。
  4. 使用 AMFIP 设置移动电动载物台的任务。
    1. 前往 µManager 并点击 插件 | 自动化 打开AMFIP的图形用户界面（GUI）。点击 添加点 或 移除点 按钮以获取所选的精确视野数。将记录的视野坐标输入到 坐标面板.
    2. 定义整个实验的总时间 总实验时间 文本框
    3. 点击 附加时间配置 按钮并定义时间间隔 T2 （例如，30 分钟）将电动载物台移动到每个视野区域。
    4. 最大化窗口大小 元素 将AMFIP的图形用户界面拖动至屏幕右侧，以避免其干扰光标的自动操作。
    5. 点击 输入 按钮。第一个宏完成后，单击 获取！ 按钮在 多维采集 窗
  5. 在图像采集后溶解细胞。
    1. 完成长期成像后，通过点击停止 AMFIP 任务 暂停 按钮在 自动化插件 窗和 停止 按钮在 多维采集 窗口
    2. 打开 元素 并通过点击设置Z轴层扫描成像 顶部 和 底部 按钮在 ND采集 窗口（将Z轴范围设置为大于微珠的Z轴范围）。切换光路至右侧，打开LED灯（强度：15%）。
    3. 缓慢而小心地取下培养室和培养皿的盖子。同时，在明场视野下监测视场是否存在漂移。
    4. 使用塑料移液管吸取0.5 mL十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，将移液管小心置于培养皿中培养基液面上方，加入1–2滴SDS溶液。
    5. 当明场视野中的细胞溶解后，将光路切换至左侧，关闭LED光源，点击 移除联锁 按钮
    6. 运行Z轴成像。保存图像序列，并将其命名为 参考文献_N （N 为每个视野的序列号）。
    7. 点击 多个位置（XY） 按钮 多维采集 窗口。接着选择下一个视野（FOV）并点击 前往 按钮，将电动载物台移至第二个视野区域。
    8. 对每个视野（FOV）重复步骤6.5.7。

7. YAP 核质比的测定

  1. 使用 Fiji ImageJ 软件进行图像分析，以测量 YAP 的核质比（N/C ratio）（图 4）。
    1. 打开 Fiji ImageJ，导入通过 µManager 获取的所有视野（FOV）的明场图像堆栈。
    2. 打开 图像 下拉菜单，选择 堆栈 | 工具 | Slice Keeper，然后导出每个视野（FOV）的明场图像堆栈。
    3. 导入 FITC 通道的荧光图像，并将其与同一视野（FOV）的明场图像叠加。操作方法为：选择荧光图像，然后选择 叠加 | 添加图像…（要添加的图像：明场图像；X 和 Y 位置取决于不同相机所获取明场图像的尺寸；不透明度：60–70）。
    4. 打开 分析 下拉菜单，选择 设置测量值…，勾选 面积、积分密度 和 平均灰度值。
    5. 点击 ImageJ 主界面中的 自由手绘选择 按钮。
    6. 绘制目标细胞体和细胞核的轮廓，然后点击 分析 | 测量，或按下键盘上的 M 键。
    7. 观察弹出的 结果 窗口。注意，面积 列下的数值表示所选区域的面积（µm2），IntDen 列下的数值表示所选区域的荧光强度。
    8. 使用以下公式（1）、（2）和（3）计算 YAP 核质比（N/C ratio）：
      核密度方程 \(D_{nuc} = \frac{I_{nuc}}{A_{nuc}}\)，用于科学分析。 (1)
      细胞质扩散分析公式 Dcyto = (Icel - Inuc) / (Acel - Anuc)；示意图 (2)
      核质扩散比方程 R = D_nuc / D_cyto，科学公式。 (3)
      其中 Inuc 和 Icel 分别表示细胞核和细胞体的相对荧光强度，Anuc 和 Acel 分别表示细胞核和细胞体的面积。R 为 YAP 核质比（N/C ratio）。
    9. 保存所绘制的轮廓，以用于后续计算偶极牵引力以及细胞周/核周位移。操作方法为：点击 分析 | 工具 | 保存 XY 坐标…

8. 牵引力场的测量

  1. 通过 Fiji ImageJ 插件应用牵引力显微镜技术22,23.
    1. 开放 Fiji ImageJ.
    2. 导入某一视野（FOV）的微珠图像堆栈。
    3. 选择显示微珠分布最清晰的切片，并通过点击提取该切片 图像 | 图层 | 工具 | 切片保存器.
    4. 导入同一视野（FOV）的参考图像堆栈。
    5. 选择与步骤 8.1.3 中切片相同亮度和对比度的切片，然后将其提取为参考图像。
    6. 选择 图像 | 图像序列 | 工具 | 拼接 将第8.1.3步和第8.1.5步得到的两个切片合并（选择参考图像作为第一个切片）。
    7. 选择 插件 | 模板匹配 | 对齐图像堆栈中的切片 或 插件 | 图像稳定器 对齐这两个切片。
    8. 选择 图像 | 图像序列 | 图像序列转为单帧图像接下来，选择 图像 | 查找表 | 绿色 将第一片的颜色转换为绿色并选择 图像 | 查找表 | 红色 将第二个切片的颜色转换为红色。
    9. 选择 图像 | 颜色 | 合并通道 合并这两幅图像。
    10. 将图像与同一视野的明场图像叠加，并利用该叠加图像观察微珠的位移。
    11. 选择 插件 | 粒子图像测速 | 迭代粒子图像测速（基础）.... 将询问窗口大小设置为 128/256；64/128；32/64（每个询问窗口至少包含四个微珠）。将相关性阈值设为 0.6。
    12. 点击 好的计算完成后，将包含微珠位移原始数据的文本文件保存到用户创建的普通文件夹中。
    13. 选择 插件 | FTTC | FTTC 并在第 8.1.9 步中选择文本文件。
    14. 输入 像素大小 (µm），的 凝胶的杨氏模量 （帕斯卡），以及 绘图宽度和高度 根据实验和珠子的图像。
    15. 点击 好的 将包含牵引力原始数据的文本文件自动保存到与第8.1.12步中文本文件相同的目录中。
  2. 使用绘图软件（材料表) 以相同尺度绘制多个细胞的牵引力场（图1B, C 和 图2B, C).
    1. 将包含牵引力原始数据的文本文件插入电子表格中。
    2. 新建一个工作表，将牵引力的 Y 坐标输入到第一行（按从高到低的顺序排列），将 X 坐标输入到第一列（按从低到高的顺序排列）。
    3. 从原始数据中为每个坐标输入牵引力的值。
    4. 将第8.2.2步中的表格另存为*.csv文件。
    5. 开放 起源.
    6. 点击 文件 | 打开 并在第8.2.4步导入*.csv文件。选择所有单元格，然后单击 图示 | 等高线 | 等高线 - 颜色填充.
    7. 在 绘图：plotvm 窗口中，选择列中的 Y，以自动将 Y 值设为第一行，X 值设为第一列。接着命名标题并点击 好的.
    8. 在弹出的图表窗口中，双击 热图.
    9. 点击 水平 在 色图/等高线 窗口。接下来，将尺度级别更改为合理范围（本分析中为0300），然后单击 好的.
    10. 点击 线条, 取消勾选 仅在主要层级显示，并检查 隐藏全部接下来，单击 好的.
    11. 右键单击图表并选择 导出图表…. 将图像保存到指定路径。
  3. 使用 MATLAB 计算偶极子细胞牵引力。
    1. 将牵引力原始数据文本文件（来自步骤 8.1.12）和细胞边界感兴趣区域（ROI）坐标文件（来自步骤 7.1.9）保存至步骤 8.1.12 中指定的同一文件夹中。将 AMFIP 软件包中的所有 MATLAB 文件复制到该文件夹中。
    2. 开放 MATLAB打开第8.1.12步中定义的文件夹，并打开偶极牵引力计算函数文件 absdipole.m 在步骤 8.3.1 中转移至该文件夹。
    3. 将步骤 8.3.1 中的两个 text/csv 文件读入 MATLAB 工作区，并将矩阵分别赋值给两个变量（例如， 牵引 和 感兴趣区域).
    4. 运行该函数 absdiple（牵引，roi）.
      注意：输出的第一列为偶极牵引力，单位为nN（纳牛）；第二列为偶极牵引力相对于水平轴的角度。

结果

CRISPR/Cas9构建的PC9癌细胞与B2B正常细胞在细胞铺展过程中YAP分布与动态的差异
代表性荧光图像显示了单个B2B和PC9细胞在2、5、40 kPa PAA凝胶及玻璃盖玻片上YAP的分布情况 图1A 和 图2A. B2B细胞中YAP的核定位随基质刚度的增加而增强（图1A），而PC9细胞在不同硬度的基质上，其细胞核与细胞质中的YAP浓度相似（图 2A). 在5 kPa水凝胶基底上单个铺展的B2B和PC9细胞中YAP分布的代表性荧光图像（来自0th 10 小时th h（细胞贴附于基质后）的显示如下 图1B 和 图2B，分别。B2B细胞随时间单调增加其铺展面积，同时YAP的核质比（N/C ratio）下降（图1B），而PC9细胞在整个10小时的铺展过程中，细胞铺展面积、取向以及YAP核质比均保持相对稳定。图2B）。在早期铺展的10小时期间，代表性B2B细胞持续使基底表面发生形变，并在整个细胞区域内施加随时间变化的细胞牵引力（图1C 和 图1D).

相比之下，典型的PC9细胞仅在细胞体的两端产生位移和牵引力，且其牵引力在7.5 h后减弱（图2C 和 图2D）。更多关于B2B细胞和PC9细胞在早期铺展阶段的时间推移图像和牵引力测量结果见于 补充图 S2 和 补充图 S3. 还观察到PC9细胞动态的其他模式（图6）。与这些不同的扩散特性相平行，B2B 和 PC9 细胞表现出不同的 YAP 分布与动态特征（图3。在5 kPa的凝胶上，B2B细胞中的YAP在0处集中于细胞核th h，并在细胞体中分布得更加均匀th h. 然而，PC9细胞在整个10小时的铺展过程中，YAP在细胞核与细胞质中的分布更为均一。为了定量分析B2B细胞和PC9细胞中YAP的活性及其转位情况，采用文中所述算法计算了YAP的核质比（YAP N/C ratio）。 图4.

为了进一步研究YAP动态的差异，比较了多个单个B2B细胞（n = 10）和PC9细胞（n = 5）的YAP核质比（N/C比）、细胞/核面积以及牵引力随时间的变化（图5）。结果显示，B2B细胞的平均YAP核质比从2.54 ± 0.22下降至1.79 ± 0.21（n = 10；p = 0.0022**；图5A），而PC9细胞的平均YAP核质比从1.92 ± 0.26变化为1.57 ± 0.07（n = 5；p = 0.187（无显著性差异（ns））；图5A）。B2B细胞的平均偶极牵引力从256.17 ± 123.69 nN变为287.44 ± 99.79 nN（p = 0.7593（ns）；图5B）。PC9细胞的平均偶极牵引力从141.19 ± 33.62 nN变化为168.52 ± 73.01 nN（p = 0.7137（ns）；图5B）。B2B细胞的平均铺展面积从613.89 ± 102.43 µm2增加至942.51 ± 226.71 µm2（p = 0.0512（ns）；图5C）。

PC9细胞的平均铺展面积从495.78 ± 变化 97.04 µm2 至 563.95 ± 89.92 µm2 （p = 0.5804（ns）； 图5C). B2B细胞的平均细胞核铺展面积从181.55 ± 36.18 µm2 至 239.38 ± 43.12 µm2 （p = 0.1217（ns）； 图 5D) 以及PC9细胞的平均细胞核铺展面积从133.31 ± 30.05 µm2 至 151.93 ± 22.49 µm2 （p = 0.5944（无显著性）； 图5D这些结果表明：（1）B2B细胞表现出持续的基底刚度依赖性YAP核质比；（2）B2B细胞的牵引力高于PC9细胞；（3）与B2B细胞不同，PC9细胞在10小时的铺展过程中，细胞面积的增加和YAP核质比的变化均较为有限。

YAP 分布与动态变化和 B2B 细胞迁移状态的相关性
B2B（n=10）和PC9（n=5）细胞的YAP核质比及偶极牵引力与其细胞铺展面积和细胞核铺展面积的关系进行了比较。PC9细胞的YAP核质比和偶极牵引力与其较小的细胞及细胞核铺展面积范围无明显相关性图6）。相比之下，B2B细胞的YAP N/C比值和偶极牵引力似乎呈现出两种不同的趋势（图6A 和 图6C），表明本实验中可能存在两群共存的B2B细胞。在第一群中，YAP核质比和偶极牵引力随细胞铺展面积的增大而增加，并在约~ 1000 µm2 (图6C 和 图6D，由黄色虚线标示）。在第二组中，随着细胞铺展面积的增大，YAP核质比和偶极牵引力的增长速率较慢，当细胞铺展面积进一步增大时，其值基本保持不变。图6C，D（由绿色虚线表示）。

PC9 癌细胞在核周区域产生牵引力
单个铺展的 PC9 细胞从培养第 6th h 开始，在核周区域引起基质位移（图 7C）。为了可视化细胞牵引力引起的核周位移，我们将细胞从基质上移除前后拍摄的荧光微珠图像进行叠加（红色为移除前，绿色为移除后）（详见实验方案部分）。在叠加图像中，未发生位移的微珠呈现黄色，即红色与绿色的叠加；而因细胞牵引力作用从原始位置发生位移的微珠则显示为分离的绿色和红色。

值得注意的是，在PC9细胞中图7C，D）和 B2B（图7E) 细胞中，除了细胞边界处的珠粒位移外，细胞质和细胞核内也观察到位移现象。为了突出核周区域的位移特征，采用线性弹性理论中的布辛涅斯克方程，预测由细胞边界处假想偶极力产生的二维理论位移（图中黑色虚线所示）。 图7B)24将该理论曲线与沿同一轴线测得的实际基底位移（白色虚线所示）进行比较 图7D），细胞核内的实际位移被发现比理论值大1.5至8倍图7B），表明核周区域存在牵引力。

YAP表达分析、细胞力学示意图，显示在不同基质上的位移和牵引力。
图1：B2B正常细胞在不同刚度基质上及早期铺展过程中YAP表达/分布、基质位移场和牵引力场的变化。（A）B2B细胞接种于2、5和40 kPa的PAA凝胶以及玻璃盖玻片上，在初始细胞-基质黏附后60小时的YAP表达情况。（B）B2B细胞接种于5 kPa PAA凝胶上，在初始细胞-基质黏附后连续成像10小时。YAP表达以绿色荧光强度表示。注意：随着时间推移，细胞核内的YAP强度逐渐降低，但仍高于细胞质中的强度。图(A)和(B)中的颜色条表示YAP表达水平（绿色=高表达；黑色=低表达）。（C）细胞所在位置的基质形变（与明场图像重叠）以各时间点的位移场表示。箭头方向和颜色分别表示位移的方向和大小。随着B2B细胞铺展面积增加，细胞体两端的位移逐渐增大。颜色条表示位移大小（深红色=大幅度；黑色=小幅度）。（D）由位移场计算得到的牵引力场（与明场图像重叠）。牵引力集中在B2B细胞的边界区域。白色和黄色虚线轮廓分别界定细胞和细胞核的边界。颜色条表示牵引力大小（深红色=大幅度；黑色=小幅度）。比例尺 = 20 µm。缩写：YAP = Yes相关蛋白；PAA = 聚丙烯酰胺。请点击此处查看该图的放大版本。

YAP表达分析；免疫荧光图像；延时成像、位移、牵引力图谱
图2YAP表达/分布、基底位移场和牵引力场在不同刚度基底上及PC9癌细胞早期铺展过程中的变化 (A) PC9细胞在初始贴壁后65小时，在2、5和40 kPa的PAA凝胶及玻璃盖玻片上培养的YAP表达情况。BPC9细胞接种于5 kPa的PAA凝胶上，在细胞与基质初始黏附后连续成像10小时。YAP表达水平以绿色荧光强度表示。注意：YAP荧光强度从1.5小时起趋于稳定。颜色标尺表示YAP表达水平（绿色=高表达；黑色=低表达） （A） 和 (B)。 (C) 细胞位置处的基底形变（与明场图像重叠）由各时间点荧光微球的位移场表示。位移方向和大小分别由箭头方向和颜色表示。PC9细胞引起的位移场小于B2B细胞引起的位移场。在整个10小时的铺展过程中，PC9细胞的面积几乎保持不变。颜色标尺表示位移大小（深红色表示高幅值；黑色表示低幅值）。D) 由位移场计算得到的牵引力场（与明场图像重叠）。该代表性PC9细胞产生的牵引力从6开始逐渐减小th 10 小时th h. 白色和黄色虚线分别标示细胞和细胞核的边界。颜色条表示牵引力大小（深红色 = 高强度；黑色 = 低强度）。比例尺 = 20 µm缩写：YAP = Yes相关蛋白；PAA = 聚丙烯酰胺。 请点击此处以查看此图的放大版本。

B2B 细胞核分析，荧光显微镜图像，YAP 强度图，正常细胞与癌细胞对比。
图3B2B 和 PC9 细胞在早期铺展阶段的 YAP 分布 (A沿指定的红色轴测量B2B细胞的YAP强度在0处th 和 10th h. (B) 在 0th h，YAP 强度在细胞核与细胞质之间表现出显著的浓度差异。在 10th h，YAP 强度在整个细胞体中变得更加均匀。 (C沿指定的蓝色轴测量PC9细胞的YAP强度th 以及 10th h. (D) 在 0th h时，细胞核中的YAP强度高于细胞质，但差异不如B2B细胞中的显著。在10th h时，细胞核中的YAP强度仍略高于细胞质，其变化趋势与0 h时相似th h. 比例尺 = 20 µm (A，C缩写：YAP = Yes 相关蛋白。 请点击此处以查看此图的放大版本。

YAP 荧光分析；细胞核强度；细胞边界示意图；显微镜检查；科学方法
图 4：测量 YAP 的核质比（N/C ratio）。(1) 使用 Fiji ImageJ 绘制细胞核轮廓，并测量其二维投影面积 Anuc。(2) 测量细胞核内部的荧光强度 Inuc。(3) 绘制细胞体轮廓，并测量其投影面积 Acel。(4) 测量细胞内部的荧光强度 Icel。(5) 计算 YAP 细胞核密度 Dnuc、YAP 细胞质密度 Dcyto 及其比值 R：Dnuc=Inuc/Anuc；Dcyto=(Icel-Inuc)/(Acel-Anuc)；R=Dnuc/Dcyto。颜色条表示 YAP 表达水平（绿色 = 高表达；黑色 = 低表达）。比例尺 = 20 µm。缩写：YAP = Yes 相关蛋白；N = 细胞核；C = 细胞质。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞行为图：YAP 比值、偶极牵引力、细胞铺展、细胞核面积；B2B 与 PC9 随时间变化。
图 5：PC9 癌细胞与 B2B 正常细胞在铺展过程中表现出不同的 YAP 表达、细胞/细胞核形态及细胞牵引力。（A）单个细胞铺展最初 10 小时内 YAP 核质比（N/C）的变化。B2B 细胞的平均 YAP N/C 比值（红色柱；n = 10）从 2.54 ± 0.22 下降至 1.79 ± 0.21（n = 10；p = 0.0022**），而 PC9 细胞的平均 YAP N/C 比值（蓝色柱；n = 5）从 1.92 ± 0.26 下降至 1.57 ± 0.07（p = 0.187（ns））。（B）平均偶极牵引力随时间的变化。B2B 细胞的平均偶极牵引力从 256.17 ± 123.69 nN 变化至 287.44 ± 99.79 nN（p = 0.7593（ns）），PC9 细胞的平均偶极牵引力从 141.19 ± 33.62 nN 变化至 168.52 ± 73.01 nN（p = 0.7137（ns））。（C）平均细胞面积随时间的变化。B2B 细胞的平均铺展面积从 613.89 ± 102.43 µm2 增加至 942.51 ± 226.71 µm2（p = 0.0512（ns）），PC9 细胞的平均铺展面积从 495.78 ± 97.04 µm2 变化至 563.95 ± 89.92 µm2（p = 0.5804（ns））。（D）平均细胞核面积随时间的变化。B2B 细胞的平均细胞核铺展面积从 181.55 ± 36.18 µm2 增加至 239.38 ± 43.12 µm2（p = 0.1217（ns）），PC9 细胞的平均细胞核铺展面积从 133.31 ± 30.05 µm2 变化至 151.93 ± 22.49 µm2（p = 0.5944（ns））。缩写：YAP = Yes 相关蛋白；N = 细胞核；C = 细胞质；ns = 无显著性差异。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞行为图：YAP 核质比、偶极牵引力与细胞/细胞核面积的关系；B2B、PC9 分析
图6细胞和细胞核铺展面积对YAP核质比及偶极牵引力的影响 B2B细胞（n=10）和PC9细胞（n=5）的YAP核质比及偶极牵引力由第6组数据计算得出th 10 小时th h 后附着于基质。 (A) YAP核质比作为细胞铺展面积的函数。B2B细胞的YAP N/C比值范围为1.16至2.53，而PC9细胞的YAP N/C比值范围为1.27至1.88。B2B细胞的铺展面积范围为 391.94 µm2 到 1986.40 µm2PC9细胞的铺展面积范围为 284.46 µm2 到 830.12 µm2. (B) YAP 核质比与细胞核铺展面积的关系。B2B 细胞的细胞核铺展面积范围从 107.09 µm2 到 514.28 µm2PC9细胞的细胞核铺展面积范围为 58.03 µm2 至 259.65 µm2. B2B细胞的偶极牵引力与细胞铺展面积的关系（C）以及细胞核铺展面积（D）。铺展且不迁移的B2B细胞表现出较高的牵引力（47.50 nN至1051.48 nN），细胞面积和核面积较小；而铺展并迁移的B2B细胞则表现出较低的牵引力（105.80 nN至310.28 nN），细胞面积和核面积范围较大。缩写：YAP = Yes相关蛋白；N = 细胞核；C = 细胞质。 请点击此处以查看此图的放大版本。

利用布辛涅斯克方程结合细胞周围和核周位移进行细胞位移分析
图7正常B2B细胞和癌细胞PC9中的核周移位。 (A) 从基质中微珠位移测量得到的细胞核周和细胞周位移的侧视示意图。B沿PC9细胞轴线（白色虚线）测量细胞下方的基底位移 7D）。由偶极子力在细胞边界产生的理论位移由Boussinesq方程给出（黑色虚线）。C）和（D) PC9细胞在6小时时，有细胞（红色）和无细胞（绿色）的重叠荧光微球图像th h 贴附后（顶视图）。黄色（红色与绿色颜色完全重叠）珠粒表示无位移。分离的绿色和红色珠粒（黄色箭头所指）代表核周区域的位移。黄色箭头指示位于细胞核边缘的收缩状核周斑点。E由B2B细胞在1.5时产生的核周移位th 细胞贴壁后 h。比例尺 = 10 µm (C–E). 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图 S1：YAP-mNeonGreen21-10/11 的基因组序列图谱。 请点击此处下载该文件。

补充图S2：B2B正常细胞在早期铺展过程中YAP表达/分布、基底位移场和牵引力场的变化 （A，D，G，J，M） 将B2B细胞接种于5 kPa的PAA凝胶上，在细胞与基质初始附着后连续成像10小时。YAP表达水平以绿色荧光强度表示。注意：细胞核内的YAP荧光强度随时间逐渐降低，但仍始终高于细胞质中的水平。颜色标尺表示YAP表达水平（绿色＝高表达；黑色＝低表达） （A，D，G，J，M）。（B，E，H，K，N） 细胞位置处的基底形变（与明场图像重叠）由每个时间点的位移场表示。箭头方向和颜色分别表示位移的方向和大小。随着B2B细胞铺展面积的增加，细胞体周边区域的位移逐渐增大。颜色标尺表示位移大小（深红色代表大幅度位移；黑色代表小幅度位移），单位为 （B，E，H，K，N）. （C，F，I，L，O） 牵引力场（与明场图像重叠），通过牵引力显微镜技术由位移场计算得到。牵引力主要集中于B2B细胞的周边区域。颜色条表示牵引力大小（深红色代表高强度，黑色代表低强度），单位为 （C，F，I，L，O）比例尺 = 20 µm缩写：YAP = Yes相关蛋白；PAA = 聚丙烯酰胺。 请点击此处下载此文件。

补充图S3：PC9癌细胞在早期铺展过程中YAP表达/分布、基底位移场和牵引力场的变化 （A，D，G，J） 将PC9细胞接种于5 kPa的PAA凝胶上，在细胞与基质初始附着后连续成像10小时。YAP表达以绿色荧光强度表示。注意：细胞核内的YAP荧光强度随时间逐渐降低，但仍保持与细胞质中相似或略低于细胞质的水平。颜色标尺表示YAP表达水平（绿色=高表达；黑色=低表达） （A，D，G，J）。（B，E，H，K） 细胞位置处的基底形变（与明场图像重叠）由每个时间点的位移场表示。箭头方向和颜色分别表示位移的方向和大小。随着PC9细胞铺展面积的增加，细胞体周边区域的位移逐渐增大。颜色标尺表示位移大小（深红色表示位移幅度大；黑色表示位移幅度小），单位为 （B，E，H，K）. （C，F，I，L） 由位移场计算得到的牵引力场（与明场图像重叠）。牵引力集中在PC9细胞的周边区域。颜色条表示牵引力大小（深红色代表高强度，黑色代表低强度），单位为 （C，F，I，L）比例尺 = 20 µm缩写：YAP = Yes相关蛋白；PAA = 聚丙烯酰胺。 请点击此处下载此文件。

讨论

成像过程（步骤 6.3）至关重要，需确保荧光图像具有足够高的质量，以获得有效的定量结果。荧光蛋白或微珠的 z 层扫描图像应具有足够大的 z 范围，以包含样品所跨越的所有 z 位置的聚焦清晰图像。另一个关键步骤是在溶解细胞后采集荧光微珠的参考图像（步骤 6.5）。由于参考图像必须在步骤 6.3 的相同位置采集，因此培养皿、环境腔室与显微镜之间不得产生任何相对位移。执行溶解操作的研究人员必须小心打开培养皿盖，并确保施加的机械扰动不会导致培养皿在环境腔室中的位置发生改变。

以下提供了一些实验过程中可能出现的错误及其解决方案。在步骤 6.4 中点击Enter后若未激活宏，很可能是因为屏幕左下角区域被非 Element 窗口占据。此时需要清除该区域的窗口内容，以便在Elements中成功激活宏。另一个常见问题是明场图像呈现黑色。此问题通常源于荧光图像与明场图像采集之间的时间间隔不足。荧光成像计时中的微小延迟可能随时间累积，导致显著的时间偏差，进而干扰明场成像。一种解决方案是将所有位置的单次成像周期时长调整为小于（而非等于）连续运动起始之间的时间间隔。该操作可在每个成像周期开始时重置计时，从而消除累积误差。

这种全光学检测技术具有以下优势：（1）支持多种硬件/软件系统，包括但不限于尼康（Nikon）；（2）适用于多种经过验证的水凝胶体系，如明胶、聚乙二醇（PEG）、Matrigel 和 I 型胶原蛋白凝胶；（3）可根据研究人员的不同需求进行可编程的定制。然而，如果商用显微镜未提供底层控制功能，则使用 AMFIP 实现这些功能的定制将变得困难。该技术的另一局限性在于样本在 XY 平面和焦平面（Z 轴）上的空间漂移。尽管这一问题可在图像后期处理过程中得到校正，但改进自动对焦功能以实时纠正样本漂移仍至关重要。此项改进将提高成像过程的通量，并减少实验过程中因漂移导致的潜在误差。

机械转导分子（如 YAP）可作为开发有前景的癌症疗法的新治疗靶点25,26,27越来越多的研究数据表明，YAP 能促进癌细胞的增殖和侵袭。力学刺激可诱导 YAP 从细胞质转位至细胞核，从而激活与细胞迁移、增殖、侵袭和凋亡相关的基因转录，导致细胞行为异常。28,29,30,31本研究旨在探讨YAP核质比与细胞力学在两种典型的人类肺癌及正常细胞系中的潜在相关性。在细胞铺展的10小时期间，PC9细胞的细胞核与细胞质中YAP浓度相近（图3D 和 图 5AB2B细胞中YAP在细胞核内的浓度高于细胞质中的浓度（图3C 和 图 5A）。这种在细胞早期铺展阶段观察到的关系，与大多数已发表研究中比较正常细胞与癌细胞核内YAP浓度的结果不同。尽管并非一定在早期铺展阶段，但多数已有研究显示，YAP在癌细胞核内的浓度高于正常细胞核内的浓度。27,28仅有一项关于乳腺癌的研究报告了例外情况32 显示YAP在细胞质中更为集中，这与我们在肺癌PC9细胞中的当前观察结果一致。据作者所知，本研究首次揭示了在人肺癌细胞系中YAP核/质比（N/C ratio）较低的现象。作者推测，PC9细胞中YAP核/质比保持稳定的原因可能是由于在细胞早期铺展阶段，PC9细胞的细胞/核铺展面积及牵引力变异程度较低所致。目前，针对PC9和B2B细胞中低YAP核/质比背后分子机制的解析工作正在进行中。

在铺展的最初10小时内，这两种细胞系的YAP核质比（N/C ratio）、细胞牵引力与铺展面积之间呈现出明显的关系（图5）。对于B2B细胞而言，较高的YAP核质比与较大的细胞及细胞核铺展面积相关（图6A、B），这与以往报道的其他正常细胞的数据一致33。有趣的是，尽管这种关系的发展趋势在所有记录的B2B细胞中普遍存在，但其程度可分为高、低两种类型。同时进行铺展和迁移的B2B细胞表现出较低的牵引力、较高的细胞和细胞核铺展面积，以及较高的YAP核质比（2.05 ± 0.32）；而铺展后停留在原位的B2B细胞则表现出较高的牵引力、较低的细胞和细胞核铺展面积，以及较低的YAP核质比（1.74 ± 0.21）。这两种不同程度的关系体现在分叉的散点数据组中（图6C、D）。文献报道显示，静止的正常细胞（如胚胎成纤维细胞NIH 3T3）的牵引力高于迁移中的细胞34。本文报道的数据表明，铺展但不迁移的B2B细胞比铺展且迁移的B2B细胞施加了更高的牵引力，这可能提示非迁移细胞需要较高的牵引力以在基底上实现稳定附着。

此外，这些数据表明，静止的正常B2B细胞会产生更高的核周力，而以往其他研究人员的报道仅发现静止细胞边缘产生的细胞牵引力更高34,35,36,37。作者认为，实验中细胞内在迁移倾向的差异可能导致了这些矛盾的结果。在已发表的研究中，采用方形微图案限制单个细胞的铺展并抑制其迁移；然而，这些细胞是否具有迁移倾向尚不清楚。由于迁移中的细胞通常在细胞边缘表现出较高的牵引力38，因此即使迁移受到限制，具有迁移倾向的细胞仍可能维持较高的边缘牵引力。在本研究中，静止细胞未受到任何微图案的限制但仍不发生迁移，表明这些细胞倾向于维持非迁移状态。另一种可能是，微图案所定义的细胞形态可能影响了黏着斑及牵引力的分布39。本研究的结果是在无任何限制性微图案条件下获得的，反映了静止细胞在其原始形态下的力分布情况。

据作者所知，迄今为止仅有一篇文献专门报道了在正常细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）中发现核周力的存在，这种力可能由跨越细胞核的肌动蛋白帽结构引起40。YAP从细胞质向细胞核的转位与核周力的增加相关40。对相关文献的系统检索未发现任何报道癌细胞中存在核周力或肌动蛋白帽的研究。一项针对黑色素瘤癌细胞的间接研究表明，肌动蛋白环（另一种位于细胞核周围但不覆盖细胞核的核周肌动蛋白结构）可降低细胞迁移速率41，间接提示核周力可能存在的可能性。然而，目前尚无直接的实验数据支持这一观点。在本研究中，作者发现PC9和B2B细胞均表现出核周位移和牵引力。核周力的产生机制及其生物学效应仍存在争议。在正常细胞中，已有研究报道肌动蛋白帽在调控细胞核形态和染色质组织42、通过核骨架与细胞骨架连接复合物（LINC复合物）将机械信号从黏着斑传递至细胞核43，以及调控细胞迁移44等方面发挥作用。Lamin A/C与肌动蛋白帽的形成和破坏有关40,41,42,43,44。然而，声称肌动蛋白帽产生核周力的报道并未考虑肌动蛋白环可能发挥的作用40。在癌细胞中，Lamin A的过表达促进肌动蛋白环的形成并抑制癌细胞迁移；而Lamin B的过表达则减少肌动蛋白环的形成并促进细胞迁移。由于核周肌动蛋白结构的存在以及Lamin A的影响，核周力可能参与了这一过程。然而，本研究的结果并未显示任何可测量的核周力或肌动蛋白帽行为的直接证据。因此，本研究在PC9细胞中发现核周力是首次报道在肺癌细胞中存在核周力和核周位移的现象。目前，作者正在利用CRISPR/Cas9技术构建的PC9和B2B细胞进一步探究核周力的分子机制及其功能。

除了本文所展示的全光学机械生物学检测技术之外，这种集成的多功能系统还可用于光学探测活体系统中多种其他关键的生理与病理生物学信号。例如，作者实验室近期已成功构建了多种稳定转导的人类癌细胞系，这些细胞系共同表达了三种光响应性膜蛋白：膜电压指示剂 QuasAr2（激发光：640 nm；发射光：660 nm–740 nm）、膜电压去极化蛋白 CheRiff（激发光：488 nm）以及膜电压超极化蛋白 eNpHR3（激发光：590 nm）。这三种功能蛋白可通过光谱正交的激光谱线实现无串扰的独立激活，从而实现对膜电生理信号的全光学双向通信（读取与控制）。作者利用集成的光电系统和手动膜片钳技术，已验证了对单个人类癌细胞及多细胞肿瘤球体中膜电压（Vm）的全光学控制与读取。这种全光学电生理检测技术为深入探索以往难以触及的癌细胞生物电活动提供了可能，有望从一个全新的维度推动肿瘤生物学的发展。

披露

不存在任何利益冲突需要声明。

致谢

本项目获得佛罗里达大学健康癌症中心癌症试点奖（X. T. 和 D. S.）以及佳得乐奖启动包（X. T.）的经费支持。作者衷心感谢乔纳森·利希特博士（UFHCC）、罗尔夫·伦尼博士（UFHCC）、李芝贤博士（佛罗里达大学生物统计学系）、休·范博士（佛罗里达大学机械与航空航天工程系，MAE）、沃伦·迪克森博士（佛罗里达大学机械与航空航天工程系，MAE）、加图·苏巴什博士（佛罗里达大学机械与航空航天工程系，MAE）和马克·谢普拉克博士（佛罗里达大学机械与航空航天工程系，MAE）在学术讨论和实验技术方面提供的支持。 & ECE，UF）、Malisa Sarntinoranont 博士（MAE，UF）、Scott Banks 博士（MAE，UF）、Matthew Traum 博士（MAE，UF）、David Hahn 博士（亚利桑那大学）、Weihong Wang 博士（甲骨文公司）、Youhua Tan 博士（香港理工大学）以及尼康公司支持团队（Jose Serrano-Velez 博士、Larry Kordon 博士和 Jon Ekman 博士）。作者们衷心感谢 Tang、Siemann 和 Guan 研究实验室全体成员以及机械与航空工程系（MAE）所有工作人员提供的慷慨而有效的支持 & ECE & 物理学 & 放射肿瘤学系，UF

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷Sigma-Aldrich440140
0.05 % 胰蛋白酶康宁25-051-CI
75 cm2 烧瓶康宁430641U
8 台式离心机赛默飞世尔科技75007210
A1R 共聚焦系统尼康HD25
乙酸Sigma-Aldrich695092冰醋酸，ACS试剂 ≥99.7%
BEAS-2B（B2B）细胞Sigma-Aldrich95102433来自肺组织的人类上皮细胞
羧基修饰微球InvitrogenF8797
培养基（RPMI-1640）Gibco11875093
台式计算机戴尔2018搭载 Windows 10 操作系统
环境舱 TIZB东海日立TIZB
胎牛血清（FBS）Gibco26140
人血浆纤维连接蛋白蛋白Gibco33016015
Fiji ImageJ美国国立卫生研究院与中国台湾光学与计算仪器实验室1.53k
玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-14-C
HEPES缓冲盐水Sigma-Aldrich51558
水合肼溶液Sigma-Aldrich53847
IntelliJ IDEAJetBrains2020Java 开发平台
Java开发工具包甲骨文14.0
KimwipeKimtech Science3066-05
MATLABMathWorks2020b
单色 相机FLIRBFS-U3-70S7M-C
MycoAlert 支原体检测试剂盒LonzaLT07-218
N,N′- 甲叉双丙烯酰胺溶液Sigma-AldrichM1533
NIS-Elements 软件平台尼康4.50软件平台
起源OriginLabOriginPro 2017（学习版）数据分析与绘图软件
青霉素-链霉素Gibco15140122
PC9细胞Sigma-Aldrich90071810人腺癌细胞  来自肺组织
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco10010023
Phusion高保真DNA聚合酶New England Biolabs F-553S高保真DNA聚合酶
透明胶带透明胶带胶带
十二烷基硫酸钠溶液Sigma-Aldrich05030
超级胶水大猩猩氰基丙烯酸酯胶水
Ti2-E倒置显微镜尼康MEA54000
带编码器的 TI2-S-SE-E 电动载物台尼康MEC56120
μ经理版本 2.0 gamma开源显微镜软件（https://micro-manager.org/）

参考文献

  1. Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology. Nature Communications. 11 (1), 3881(2020).
  2. Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
  3. Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. Spatiotemporal force and motion in collective cell migration. Scientific Data. 7 (1), 197(2020).
  4. Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer. Extreme Mechanics Letters. 48, 101438(2021).
  5. Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. Molecular tools for imaging and recording neuronal activity. Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).
  6. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  7. Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. A call for bioimaging software usability. Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).
  8. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  9. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  10. Luo, Q., et al. Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation. bioRxiv. , (2021).
  11. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using manager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
  12. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  13. Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system. PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631(2014).
  14. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  15. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
  16. Phelps, E. A., et al. Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery. Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).
  17. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).
  18. Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).
  19. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370(2017).
  20. Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH. Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).
  21. Micro-Manager. , Available from: https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2 (2021).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Martiel, J. L., et al. Measurement of cell traction forces with ImageJ. Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).
  24. Okumurai, I. A. On the generalization of Cerruti's problem in an elastic half-space. Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).
  25. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  26. Hong, W. W., Guan, K. L. The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway. Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).
  27. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the roots of cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  28. Wang, Y., et al. Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer. Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).
  29. Li, H., et al. Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134(2016).
  30. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13, 131(2014).
  31. Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).
  32. Yuan, M., et al. Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast. Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).
  33. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. bioRxiv. , (2020).
  34. Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. Migration regulates cellular mechanical states. Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).
  35. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  36. Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  37. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  38. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  39. Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
  40. Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction. Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).
  41. Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization. Cells. 9 (10), 2161(2020).
  42. Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization. Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).
  43. Khatau, S. B., et al. A perinuclear actin cap regulates nuclear shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).
  44. Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap. Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).

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CRISPR
利用多功能系统对人癌细胞和正常细胞中Yes相关蛋白进行全光学机械生物学研究
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