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选择性清洗野生 Caenorhabditis 线虫以富集肠道微生物组细菌

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DOI：

10.3791/62937

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2021年8月13日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University, 2Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure

本文内容

摘要

野生的Caenorhabditis线虫与多种微生物相关，这些微生物通常位于肠道腔内或感染肠道。本方案详细介绍了一种利用dauer幼虫角质层的抗性来富集定植于肠道中不可培养微生物的方法。

摘要

秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫) 已被证明是研究宿主-微生物相互作用及微生物组的优良模型，尤其适用于肠道相关研究。近年来，对野生环境中的生态采样 秀丽隐杆线虫 线虫已发现与多种微生物相关，包括细菌、病毒、真菌和微孢子虫。这些微生物中的许多具有值得深入研究的定植或感染表型，但通常难以培养。本方案介绍了一种富集目标肠道微生物的方法 秀丽隐杆线虫 以及相关线虫，并减少附着在角质层上的大量污染微生物。该方案包括迫使线虫进入发育的dauer阶段，并使用一系列抗生素和去垢剂洗涤步骤以去除外部污染。由于dauer阶段的线虫会发生生理变化，使其能够抵御严酷的环境条件，因此其肠道内的微生物也会受到保护而不被清除。但要实现目标微生物的富集，所关注的微生物必须在动物发育为dauer阶段时仍能维持存在。当线虫离开dauer阶段后，将单个个体分别传代，建立独立的品系。1 随后对菌群进行筛选，以获得目标微生物或感染表型，并排除可见污染。这些方法可帮助研究人员富集肠道腔内难以培养的微生物，这些微生物构成了天然微生物组的一部分 秀丽隐杆线虫 以及细胞内肠道病原体。随后可对这些微生物的定植或感染表型及其对宿主适应性的影响进行研究。

引言

模式生物 C. elegans 是研究宿主-微生物相互作用的理想 体内 系统1,2。与其他动物相比，它们的生理结构相对简单，但其细胞生物学的许多方面与哺乳动物基本相似，因此是生物学研究的良好模型1,3,4。此外，它们体型微小、易于培养，并在整个短暂的生命周期中保持透明。这些特性使得研究人员能够快速探究调控宿主-微生物相互作用的机制，并对遗传背景可调控的宿主进行 体内 感染和定植过程的可视化观察5,6。最后，C. elegans 对细菌、真菌和病毒感染能迅速 产生响应，使其成为研究宿主-微生物相互作用及肠道微生物组的优秀模型7,8,9。

野生样本采集量的增加 秀丽隐杆线虫 以及其他线虫的研究使得自由生活的线虫生态学和自然遗传变异的研究成为可能10,11同时，采样也增加了对自然界中与之相互作用的生物病原体和微生物的发现 秀丽隐杆线虫12,13,14,15，从而建立了许多用于研究宿主-微生物相互作用的模型系统 病毒、细菌、微孢子虫、卵菌或真菌16,17,18,19,20. 通常，野生型 秀丽隐杆线虫 常见于腐烂的茎和果实中，多分布在温带气候地区，且通常为自体繁殖。21将这些样品带回实验室后，将野生线虫分离为克隆种群，每个种群携带多种相关的微生物群落。在发现感兴趣的新型微生物时 秀丽隐杆线虫 线虫中，通常通过显微镜直接观察易于识别的表型来筛选动物是否被感染或定植。例如，病毒感染可表现为肠道结构的解体，而微孢子虫的不同发育阶段则可在宿主细胞内观察到，表现为孢子或裂殖体14,22当发现一种感兴趣的微生物需要进一步研究时，必须将其从野生线虫中存在的其他污染微生物中分离出来，以便对其进行纯培养研究。在许多情况下，这种感兴趣的微生物无法被培养 体外因此，必须在宿主线虫中富集该微生物。

例如，本方案描述了一种野生型 C. tropicalis 分离株，其含有一种定植于线虫肠腔内的细菌，该细菌以定向方式附着于肠上皮细胞。表型上，该细菌沿肠腔内侧垂直生长，呈现出刷状外观，在包括dauer阶段在内的动物各个发育阶段，均可通过标准的微分干涉差显微镜（Normarski显微镜）观察到。培养该野生型 C. tropicalis 菌株的线虫生长培养基（NGM）平板上可见其他微生物的明显污染。本方案的开发旨在减少平板上额外的微生物污染，以便研究这种未知的附着性细菌。通过诱导线虫进入dauer阶段以保护肠腔内的细菌，随后利用一系列洗涤步骤对线虫进行清洗。随后，通过解剖线虫肠道并扩增16S核糖体DNA进行PCR测序，从而鉴定出该未知细菌物种。

总体而言，该方案有望富集与野外捕获的线虫相关的任何目标微生物。随后，研究人员将鉴定目标微生物并进行可视化观察 体内 感染或定植表型 通过 显微镜观察，并研究其对宿主适应性或其他宿主-微生物相互作用方面的影响。分离并研究与宿主相互作用的新型微生物物种。 秀丽隐杆线虫 线虫研究可揭示宿主免疫的遗传机制，以及与微生物致病性和微生物组研究相关的宿主-微生物相互作用的新范式。

方案

1. 在NGM平板上诱导野生型线虫形成dauer幼虫

  1. 培养野生型 秀丽隐杆线虫 在标准NGM平板上使用OP50-1进行菌株培养 E. coli 在获得带有目标不可培养微生物的线虫后，将其作为食物来源。孵育这些线虫 在 20 °C。
    注意：培养的标准温度 秀丽隐杆线虫 线虫的适宜温度范围为15–25 °C，但应通过实验确定具体温度，以防止目标微生物的丢失。
  2. 在20 °C下饥饿培养线虫，持续4-5天，直至所有OP50-1细菌被消耗殆尽，且大部分线虫发育至dauer阶段。
    ​注意：滞育幼虫是由于缺乏营养而发育形成的长寿命幼虫，具有保护性角质层。

2. 线虫的清洗

  1. 向一个含有饥饿线虫的6 cm培养皿中加入5 mL M9最低盐培养基（42 mM Na2HPO4，22 mM KH2PO4，8.6 mM NaCl，19 mM NH4Cl）。
  2. 使用无菌玻璃移液管和吸球，将培养皿中的M9培养基和线虫吸起，并转移至一个无菌的15 mL离心管中。
  3. 使用临床离心机，在室温下以1000 × g 离心30秒，使线虫沉淀。
  4. 使用无菌的15 mL移液管，移除并弃去线虫沉淀上方的M9上清液。保留约50 µL的M9液体在线虫沉淀上方，以避免扰动管底的活体线虫。
  5. 向同一离心管中加入10 mL M9培养基 + 0.05% Triton X-100，并充分拧紧管盖。
  6. 将离心管置于旋转混合仪上，在室温下孵育20分钟以去除外部微生物。随后将管子从旋转混合仪上取下，并在1000 × g 条件下离心30秒，使线虫沉淀。
  7. 使用无菌移液管，移除并弃去线虫沉淀上方的M9上清液。保留约50 µL的M9液体在线虫沉淀上方，避免扰动管底的活体线虫。
  8. 重复步骤2.5至2.8，共再进行三次。

3. 线虫的消毒

  1. 在10 mL M9缓冲液中加入0.25% SDS（250 µL的10% SDS）、50 µg/mL羧苄青霉素、25 µg/mL卡那霉素、12.5 µg/mL四环素、100 µg/mL庆大霉素、50 µg/mL链霉素、37.5 µg/mL氯霉素和200 µg/mL头孢噻肟，配制抗生素和SDS溶液（见材料表）。
  2. 将含有线虫的离心管置于上述抗生素和SDS溶液中，在室温下于旋转摇床中孵育过夜。
    ​注意：所有非dauer期线虫和胚胎均会死亡，但多数dauer期线虫可在此清洁过程中存活。

4. 去除抗生素和SDS溶液

  1. 在室温下以 1000 × g 离心 1 分钟，使管中的线虫沉淀。使用无菌移液器小心吸去上清液，注意不要扰动管底的线虫。
  2. 加入 10 mL M9 缓冲液 + 0.05% Triton X-100，并将管盖充分拧紧。将管子置于摇床上，在室温下孵育 20 分钟。
  3. 从摇床上取出管子，在室温下以 1000 × g 离心 1 分钟使线虫沉淀。随后重复步骤 4.2–4.3 三次。
  4. 最后一次洗涤后，保留管底含有线虫沉淀的 100 µL 溶液，其余液体弃去。

5. 培养纯净的线虫品系

  1. 使用无菌玻璃移液管，将100 µL上清液和沉淀物转移至接种了OP50-1的10 cm NGM平板中央。静置平板，待中央液体自然干燥，期间避免扰动。
  2. 让休眠幼虫从中心爬出，穿过OP50-1菌苔5-10分钟。
  3. 小心挑取一只滞育幼虫，将其转移至一个接种了OP50-1的大肠杆菌的6 cm NGM平板上。总共至少挑取10只滞育幼虫，分别接种到10个独立的接种了OP50-1的大肠杆菌的6 cm NGM平板上。
  4. 在 20 °C 下孵育平板 4–5 天，直至滞育幼虫发育并产生下一代（F1）已达到成虫阶段。目视检查所有培养皿是否存在污染，污染表现为非OP50-1的微生物生长。
  5. 对于每个洁净的平板，验证目标微生物的生长情况 通过 微分干涉（诺马尔斯基）显微镜或荧光显微镜，例如荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）12，取决于所关注的表型。

6. 肠道解剖及微生物物种的PCR鉴定

  1. 将动物在 20 °C 下培养 3-4 天，使其饥饿并减少 OP50-1 细菌的数量。向饥饿的线虫平板中加入 5 mL M9 培养基。
  2. 使用无菌玻璃移液管和吸球，将平板中的 M9 + 线虫吸起，并转移至一个无菌的 15 mL 离心管中。
  3. 使用临床离心机，在室温下以 1000 × g 离心 30 秒，使线虫沉淀。
  4. 使用无菌 15 mL 移液管，移除离心管中的上清液，注意不要扰动管底的活线虫。
  5. 加入 10 mL M9 + 0.05% Triton X-100，将离心管置于摇床上孵育 20 分钟，以去除体表微生物。重复此步骤四次，以充分清洗线虫。
  6. 最后一次清洗后，使用无菌移液器吸头，在不扰动管底沉淀的前提下，保留 100 µL 溶液，移除其余上清液。
  7. 使用无菌移液器吸头，将 M9 和线虫转移至未接种的 NGM 平板上，让平板干燥，同时让线虫爬行 20 分钟，以帮助去除角质层和肠道内的 OP50-1。
  8. 向干燥的平板中加入 250 µL M9，用玻璃移液管将 M9 + 线虫转移至新的未接种 NGM 平板。再次让平板干燥，并让线虫爬行 20 分钟。
  9. 向平板中加入 250 µL M9，转移 100 µL 的 M9 + 线虫至洁净的凹玻片中。
  10. 使用两根无菌 26 G 注射针头，用一根针固定线虫，另一根针切断其头部以进行去头操作。去头后，肠道（呈颗粒状）和性腺（透明）会自然从体腔中排出。
  11. 用一根针固定暴露的肠道，另一根针切下一小段肠道。
    注意：如有可能，可使用诺马尔斯基显微镜、FISH 或免疫组织化学方法确认目标微生物仍存在于外翻的肠道中23。
  12. 将单个解剖得到的肠道转移至含有 10 µL 无菌水的 0.5 mL PCR 管中。重复操作，共获得至少 5 个分别来自不同个体的肠道样本 PCR 管。
  13. 将 PCR 管在 -80 °C 冰箱中冷冻至少 5 分钟。从冰箱中取出 PCR 管，使样品融化。
  14. 上下吹打液体数次，以使细菌与肠道组织分离。
  15. 根据疑似微生物类型，使用针对细菌、酵母或微孢子虫小核糖体亚基 DNA 序列的通用引物对进行 PCR 扩增。
    注意：例如，使用通用细菌 16S 引物的一个示例性实验方案见表 1。
  16. 使用基于滤膜的 DNA 纯化与浓缩试剂盒（参见材料表）纯化扩增产物，并进行桑格测序。

结果

野生 C. tropicalis 菌株（JU1848）分离自法属圭亚那努拉格斯森林中腐烂的棕榈树果实图1A)24该菌株被发现具有细长的微生物，能够以定向方式定植于肠腔内图1B）。这种微生物很容易被转移到 秀丽隐杆线虫 N2品系 通过 与菌株 JU1848 共培养时，其在肠道腔内的定植情况相似。

在接种了标准NGM平板上扩增JU1848 E. coli OP50-1 经多代传代后持续出现可见污染，表现为 OP50-1 菌苔内外存在多种深色黏液状菌落图2A）。将野生型JU1848平板进行饥饿处理以诱导线虫进入dauer阶段，并按前述方法进行清洁。将清洁后存活的单个dauer线虫转移至接种了OP50-1的单个6 cm NGM平板上，于20°C培养4天 20 °C. 多个F培养板1 子代未见明显的微生物污染图 2B）。F1 子代经证实肠道腔内仍含有附着的细菌（见下文）。

清洁 JU1848 动物后，按方案中所述（步骤 6.1–6.12）进行断头并分离肠段。解剖所得肠段肠腔内附着的细菌已得到验证 通过 微分干涉差显微镜技术（Nomarski microscopy）图3）。JU1848 肠道腔内的微生物疑似为细菌，因此将解剖获得的肠道组织作为模板，使用通用细菌 16S 引物 27F 和 1492R 进行 PCR 扩增。从共计六份独立解剖的肠道样本中获得的 PCR 产物均进行了测序 通过 Sanger 测序及清晰的色谱图显示，所有六个序列均相同。基于这些序列，该细菌被鉴定为 α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）中的一个新物种，但无法归类到已知的目或属。补充文件 1).

咖啡果腐烂过程及解剖结构；果实横切面显微图像并标注。
图1：定植于野生型管腔内的黏附细菌 C. tropicalis (A腐烂的田间样本图像 Euterpe sp. 法属圭亚那努拉格森林中棕榈科棕榈树的果实。B微分干涉（Nomarski）图像显示菌株JU1848体内有数千条细长的细菌，在宿主肠道（in）肠腔（lu）内形成刷状结构。括号（[）标示出覆盖肠道的细菌（ba）层。 请点击此处以查看此图的放大版本。

微生物研究中培养皿实验的真菌生长显微镜图像（A）与对照（B）
图 2：线虫清洗后污染性微生物生长消失。（A）野生型株系 JU1848 在接种了 E. coli OP50-1 细菌的标准 6 cm NGM 平板上表现出明显的微生物生长。（B）经过清洗后，来自单个耐久幼虫的 F1 后代在 20 °C 培养 4 天后未见明显微生物污染。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞形态的显微图像，突出显示用于生物学分析的细胞内结构。
图3：在解剖后的肠道腔内可见附着的细菌。 对一只清洁的JU1848动物进行断头处理，使其肠道外露。定植的细菌（ba）用方括号（[）标示，可见于线虫体外一段肠道（in）的腔内（lu）。请点击此处查看该图的放大版本。

试剂浓度用量
27F 引物 (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)20 mM2.5 µL
1492R 引物 (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)20 mM2.5 µL
水中解剖的肠道组织N/A3 µL
10x PCR 缓冲液10x5 µL
dNTP10 mM1 µL
Taq 聚合酶5 U/µL0.5 µL
水N/A35.5 µL

表1：使用通用细菌引物和解剖所得肠道组织的示例PCR方案。

补充文件 1：来自六份解剖的 JU1848 肠道样本的 PCR 扩增细菌 16S rDNA 序列的 MUSCLE 比对结果。 请点击此处下载该文件。

讨论

本方案描述了从野外分离的微生物中进行分离与鉴定的方法 秀丽隐杆线虫 使用一系列清洗步骤处理线虫。许多微生物与野外分离的线虫相关，其中一些具有引人注目的表型，可用于宿主-微生物相互作用和先天免疫的未来研究。已从野外线虫中分离出大量可培养的微生物组成员及致病细菌。 秀丽隐杆线虫 使用标准技术对线虫进行操作 体外 细菌生长25,26然而，并非所有微生物都能被培养 体外 因此有必要在野生线虫中富集这些微生物。某些微生物具有抗性孢子阶段，例如微孢子虫，可使用高浓度SDS杀死大多数细菌和真菌，从而实现孢子的特异性富集12本方案介绍了一种富集对SDS和抗生素处理不具抗性的不可培养肠道微生物的方法。

本实验技术利用了dauer幼虫因生理变化而产生的环境抗性，这些生理变化包括角质层的强化、咽部泵动的抑制以及口部被口塞封闭27。该实验方案中的关键步骤是使用多种抗生素和0.25% SDS进行过夜孵育，旨在杀灭所有外部微生物，同时保持内部微生物的完整性。尽管已有研究表明，C. elegans dauer幼虫可耐受高达10%的SDS处理30分钟27，但本方案采用中等浓度但较长时间的孵育，不仅可有效杀灭微生物，还能进一步增强细菌对抗生素的暴露。此外，使用中等浓度的SDS有助于确保其他Caenorhabditis物种的dauer幼虫存活，因为将C. tropicalis暴露于1% SDS过夜会导致所有dauer幼虫死亡。如果所有dauer幼虫均死亡，则应降低SDS浓度和/或缩短SDS处理时间；相反，若清洁后F1代培养板上仍可见污染，则应提高SDS浓度或延长孵育时间。

另一个关键步骤是在清洁后分离单个的持存期线虫。此步骤至关重要，因为在经过SDS和抗生素处理后，并非所有线虫都已彻底清洁。因此，需将线虫放置在含有OP50-1的10 cm NGM平板中央，使其向四周径向爬行。通常优先挑选距离中心较远的个体，因为在线虫穿过OP50-1菌苔的爬行过程中，有助于清除附着在角质层上可能残留的微生物。然而，这一操作也带来了本实验方案的局限性：如果目标微生物在群体中的丰度较低，则难以实现有效富集。在此实验中，附着的α-变形菌（Alphaproteobacteria）在群体中的占比为90%–95%，因此大多数清洁后的平板均含有该微生物组细菌。但如果目标微生物在群体中的频率显著更低，则可能需要筛选更多的F1代平板。

该方案可能可用于分离在野生线虫中发现的多种难以培养的目标微生物。然而，该微生物必须位于受dauer期角质层保护的组织内，能够在dauer期动物体内存活，并在宿主中表现出可观察的表型。因此，该技术可用于富集除本文所述的α-变形菌（Alphaproteobacteria）以外的其他肠道腔内微生物组细菌，包括那些不具有黏附能力的细菌。此外，该方案已被用于富集一种兼性胞内细菌Bordetella atropi，其可感染线虫Oscheius tipulae28。富集后发现，B. atropi能够在NGM平板上形成菌落，表明一旦快速生长的污染物被去除，原本被认为难以培养的目标微生物可能被发现可在体外（in vitro）培养。鉴于该方法具备富集胞内细菌的能力，该技术也可能适用于微孢子虫和病毒（包括Orsay病毒）。然而，这些微生物必须能够在进入和脱离dauer期的过程中存活。

需要注意的是，尽管本实验方案可在生物安全等级1级实验室中进行，但必须全程保持无菌操作，以防止进一步的微生物污染。可根据研究人员的需求对本方案进行调整，包括抗生素的种类/浓度、SDS的百分比和/或添加抗真菌剂（如制霉菌素）。通常情况下，从野外分离的线虫中发现的污染微生物数量可能差异显著。本研究中以NGM平板上非OP50-1 E. coli 菌落生长的明显消失作为线虫品系洁净的判断指标。然而，可能存在无法培养的污染微生物种群，因此有必要采用宏基因组学方法（如16S rRNA扩增子测序）来评估污染程度26。一旦线虫品系被净化，即可冷冻并保存以供后续研究使用。总体而言，本方案使研究人员能够富集野生线虫中难以培养的微生物，从而研究其对宿主适应性的影响，表征定植或感染的表型，并利用遗传工具揭示宿主-微生物相互作用的分子机制。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢 Christian Braendle 博士以及法国国家科学研究中心（CNRS）Nouragues 野外工作站。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Fisher ScientificBP1356
10% SDSInvitrogenAM9822
BD PrecisionGlide 针头 - 26 GFisher Scientific305115
羧苄青霉素Millipore-SigmaC1389-1G
头孢噻肟Millipore-SigmaC7039-500mg
氯霉素Millipore-SigmaC0378-25G
DNA 纯化与浓缩试剂盒Zymo Research11-303C
DreamTaq 聚合酶Fisher ScientificEP0711
庆大霉素Millipore-SigmaG1264-250mg
卡那霉素Millipore-SigmaK1876-1G
KH2PO4Fisher ScientificP-286
NaClFisher ScientificS-671
NH4ClFisher ScientificA-661
链霉素Millipore-SigmaS6501-50G
四环素Millipore-SigmaT7660-5G
Triton X-100Fisher ScientificBP-151
表面皿VWR470144-850

参考文献

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