DUCT：双重树脂铸型结合显微计算机断层扫描用于肝脏三维分析

摘要

双重树脂铸型微计算机断层扫描，即 DUCT，可实现对两种管状系统的同步可视化、数字化和分割，从而促进器官结构的三维分析。DUCT 结合了 离体 注射两种造影树脂，随后进行显微计算机断层扫描及断层数据的分割。

摘要

肝脏是人类和小鼠体内最大的内脏器官，其高自体荧光特性为在全器官水平上评估器官的三维（3D）结构带来了显著挑战。肝脏结构的特征在于存在多个分支的管腔结构，这些结构可被树脂填充，包括血管系统和胆道系统，它们在富含肝细胞的实质组织中形成高度规律的空间构型。本实验方案描述了双树脂灌注微计算机断层扫描（double resin casting micro-computed tomography）的操作流程，即"DUCT"技术。DUCT技术包括通过门静脉和胆总管分别注入两种不同的射线不透明合成树脂，随后进行组织固定。通过光学透明剂对一个肝叶或整个肝脏进行透明化处理，可实现对灌注质量的质控，从而预先筛选出灌注良好的样本。在DUCT流程的第二部分，可将一个肝叶或整块肝脏用于微计算机断层扫描（microCT）成像，并对门静脉系统和胆道系统的三维结构进行（半）自动分割与三维重建。microCT可生成两种树脂填充结构的三维坐标数据，从而支持对这两个系统及其空间关系进行定性与定量分析。DUCT技术适用于出生后及成年小鼠的肝脏研究，并可进一步拓展应用于其他管状网络系统，例如肺部的血管网络和气道结构。

引言

器官树脂铸型是一种可追溯至17世纪的技术^th 世纪¹现代树脂铸型技术的早期应用实例之一是对一例尸检所得的人类肝脏进行的。通过将造影剂与明胶混合后灌注至肝内胆管，随后进行X射线CT扫描成像。²DUCT技术的目的是对两种管状树脂铸型网络进行三维可视化、数字化和联合分析。

DUCT 建立在已有的单系统肝脏树脂铸型技术的丰富知识基础之上^3,4,5,6,7,8，并进一步实现了对两个系统的同步三维可视化与分析⁹。DUCT 通过将两种具有不同对比度的射线不透性树脂混合，并分别注入两个不同的网络——即胆总管和门静脉，从而将单树脂铸型技术发展为双树脂铸型技术。DUCT 可应用于出生后幼鼠，并可在出生后第15天（P15）即获得可重复的结果。与基于显微镜的成像技术相比，DUCT 的主要优势在于其操作更快、无需抗体，且肝脏组织的自发荧光不会干扰成像。此外，DUCT 可提供关于管腔形成状态、内径大小、网络连通性及灌注情况的定量数据。在分析某些器官时，区分管腔形成细胞的存在与否与其实际管状结构形态发生之间的差异至关重要，例如在 Alagille 综合征中，胆管样细胞存在但未能形成管状结构¹⁰。DUCT 的主要缺点是树脂渗透能力有限，因其黏稠，无法进入管径较小（<5 µm）的管道。在确定注射入口后，DUCT 可应用于任何管状结构，例如动脉和静脉循环系统、气道、肝外胆管或淋巴管。因此，该技术有望促进肺、胰腺等其他组织器官整体结构的分析。

MicroCT 分割图像可使用商业成像软件（如 ImageJ）或自定义流程（例如 MATLAB）进行处理。经树脂灌注的肝脏可进行定性分析，以评估网络扩张和连通性，或进行定量分析，包括单个系统的体积、长度、分支情况、扭曲度，以及两个系统之间的相互作用，例如系统间的距离或分支点依赖性（系统 1 是否在系统 2 分支附近发生分支？）。DUCT 分析流程涵盖了树脂灌注、MicroCT 扫描和 CT 数据分割，并结合对两种管状系统结构机制的详细定量分析，有望为动物模型中的全肝脏分析提供标准化方法。

方案

本研究中所述方案已获斯德哥尔摩北部动物实验伦理委员会（Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd）批准，并遵循该机构关于动物福利的规章制度。本研究所用动物为野生型或纯合Jag1H268Q突变小鼠，遗传背景为C3H/N与C57BL6J混合背景。研究中同时包含雄性和雌性动物。动物使用时间为出生后第15天，或3至8月龄的成年个体。

1. 双重树脂注射

1. 准备
   1. 准备树脂溶液。对于双系统树脂注射，按照步骤 1.1.2–1.1.4 分别准备黄色和绿色树脂。
   2. 为每只小鼠准备 1 mL 稀释后的树脂分装液。
   3. 黄色树脂：将黄色硅橡胶（高放射不透性）与透明稀释剂按 3:1 比例稀释，以制备用于注射的黄色树脂。
   4. 绿色树脂：将蓝色硅橡胶（无放射不透性）与透明稀释剂按 1:1 比例混合，制备蓝色树脂。为生成绿色树脂，将稀释后的蓝色树脂与稀释后的黄色树脂按 1:1 比例混合。充分涡旋震荡绿色树脂，直至颜色均匀。
      注意：蓝色树脂的放射不透性极低，在 microCT 下无法检测，因此必须与黄色树脂混合，以产生两种具有不同放射不透性的树脂。
      警告：树脂可能含有铬酸铅，属于致癌物。火灾时会产生有毒气体。请小心操作，并将树脂作为危险废物处理。
   5. 按照步骤 1.1.6–1.1.11 所述，准备两套注射装置（注射装置 #1 和注射装置 #2），并连接导管。
      注意：对于成年小鼠（>P30（出生后第 30 天）= P30 – 2 年），使用注射装置 #1（外径 0.6 mm 的 PE10 导管）进行胆总管注射，使用注射装置 #2（外径 0.96 mm 的 PE50 导管）进行门静脉注射。对于幼年出生后小鼠（不超过 P30），准备两套 #1 注射装置，分别用于胆管和门静脉注射（无需使用注射装置 #2，因为门静脉过窄，无法容纳 PE50 导管）。
   6. 准备注射装置 #1：剪取 30 cm 长的 PE10 导管，用手拉伸导管一端，使其尽可能变细（图 1A、B，直径约 0.15 mm；未拉伸的 PE10 导管直径为 0.6 mm）。
   7. 将拉伸后的 PE10 导管末端斜向剪切，形成斜面尖端（图 1B）。
   8. 将 PE10 导管未拉伸的一端连接至 30 G 针头（图 1A，注射装置 #1）。
   9. 准备注射装置 #2：剪取 30 cm 长的 PE50 导管，用手拉伸导管一端，使其足够细，以便插入门静脉（图 1A、B，直径约 0.7 mm；未拉伸的 PE50 导管直径为 0.96 mm）。
   10. 将拉伸后的 PE50 导管末端斜向剪切，形成斜面尖端（图 1B）。
   11. 将 PE50 导管未拉伸的一端连接至 23 G 针头（图 1A，注射装置 #2）。
       注意：每套注射装置仅能使用一次，因为树脂会在注射器和导管内固化。根据小鼠年龄、基因型和表型，调整拉伸和斜面尖端的尺寸，以匹配胆总管和门静脉的大小。若不确定导管尺寸是否合适，可在切开后、填充树脂前，先将导管插入相应导管或血管中测试。若导管过宽，需进一步拉伸。
   12. 通过异氟烷吸入麻醉动物（诱导室中先使用 4%，随后通过鼻罩使用约 2%）。
   13. 将小鼠置于解剖垫上的通风台面，通过鼻罩吸入异氟烷。采用机构/IRB 推荐的方法确认动物已失去意识，例如轻捏一只脚掌。
       警告：吸入异氟烷可能导致嗜睡或头晕，长期或反复暴露可能损害心血管系统和中枢神经系统。切勿吸入。应在通风台面和通风良好的区域操作。
       注意：可使用其他麻醉方法，只要其与心脏灌注兼容即可。
   14. 动物失去意识后，用 70% 乙醇喷洒腹部，防止毛发干扰。
   15. 使用皮肤剪刀，从腹腔正中线开始，切开皮肤、筋膜和肌肉层，直至胸腔，以暴露内脏器官。
   16. 用镊子夹住剑突，抬起胸骨，并在两侧剪开膈肌和肋骨，以暴露心脏和肺。
   17. 用剪刀剪断左右两侧肋骨，移除肋骨。操作时需格外小心，避免损伤肝脏，否则会导致树脂泄漏。
   18. 用直头镊子将心脏向肝脏方向牵拉，并剪除右心房。
   19. 将连接至蠕动灌注泵的蝴蝶针（23 G）插入左心室。通过汉克斯平衡盐溶液（HBSS）和肝素（每克小鼠体重 1 U）进行心脏灌注。以 5 mL/min 的流速灌注 3 分钟。
       注意：若灌注正确，内脏器官将变得苍白，尤其是肝脏。若肺部变白，则说明针头插入了右心室，需重新调整位置。灌注完成后，小鼠已放血，可移除鼻罩和异氟烷。
   20. 关闭异氟烷泵。
2. 树脂注射——胆道系统树脂铸型
   1. 将小鼠移至解剖显微镜下，腹部朝上，尾部朝向操作者，头部远离操作者。感兴趣的解剖标志如 图 2A 所示。
   2. 将肠道移向一侧，找到下腔静脉（图 2A）。使用弹簧剪刀在下腔静脉上做一个小的横向切口，以释放肝血管压力（图 2Bi）。
   3. 按照步骤 1.2.4–1.2.6 所述，暴露胆总管和门静脉。
   4. 使用磷酸盐缓冲液（PBS）湿润的棉签，将肠道和胰腺移至操作者右侧。
   5. 使用 PBS 湿润的棉签，将肝脏腹侧翻向心脏，以暴露脏面和肝门区域。
   6. 找到从肝门区穿过胰腺并延伸至奥狄括约肌处肠道的胆总管（图 2Bii，黄色虚线标示胆总管轮廓，黑色箭头指向奥狄括约肌）。
      注意：在整个操作过程中，应通过喷洒 PBS 保持肝脏湿润。
   7. 使用直头镊子清除胆总管周围组织（约 5 mm 区域）。将丝线缝合线（4-0 规格，0.17 mm，长 3–5 cm）置于胆总管下方（图 2Bii），并在胆总管周围打一个松散的单结（图 2Biii）。
      注意：选择打结位置时，应位于肝门区与奥狄括约肌之间的中点，并远离门静脉，以便在收紧缝线后不会干扰门静脉注射。
   8. 将弹簧剪刀平贴于胆总管，在胆总管进入胰腺和肠道、靠近奥狄括约肌的位置做斜向切口（图 2Biv，黄色虚线标示奥狄括约肌区域，黑色箭头强调）。
      注意：此步骤至关重要。必须做斜向而非横向切口，且仅为切开，不可切断胆管。若完全切断胆管，将导致导管插入极为困难。
   9. 使用前，将 1 mL 黄色树脂与 50 µL 固化剂在 1 mL 注射器中反复抽吸混合，然后将树脂-固化剂混合物装入 1 mL 鲁尔注射器中。
   10. 将装满的注射器连接至导管（装置 #1）。推动活塞，完全填充导管。确保树脂/固化剂混合物从导管尖端滴出。
       注意：为获得最佳效果，应避免并清除注射器和导管中的气泡。
   11. 使用镊子拉直胆总管切口周围区域，并将导管插入胆总管开口（图 2Bv），使斜面尖端的最长边缘朝下，朝向胆管背侧。此方向可确保树脂从朝上的导管开口顺利进入胆管（图 2Bv）。
   12. 收紧丝线结，固定导管于胆总管内（图 2Bvi）。
   13. 将树脂注入胆总管。观察胆囊和各个肝叶。
   14. 用 PBS 湿润的棉签轻柔按摩肝脏，帮助树脂均匀分布。在野生型小鼠中，树脂填充的胆管终末分支在肝脏表面隐约可见。
       注意：预期肝脏填充时间为 30–100 秒。
   15. 当肝脏表面出现树脂小点（图 2Ci，蓝色箭头）或感到阻力时，停止注射。
       注意：由于加入固化剂后树脂开始硬化，操作应尽可能迅速。加入固化剂后的可操作时间约为 15 分钟。
   16. 拔出导管，用镊子迅速收紧丝线结，防止树脂泄漏。剪除丝线的松散端，以免干扰后续门静脉注射。
   17. 将含树脂的导管、剩余树脂放入危险废物容器，针头放入锐器废物容器。
3. 树脂注射——门静脉树脂铸型
   1. 使用直头镊子清除门静脉周围组织（约 5 mm 区域），位置距其进入肝脏处约 2 cm。将丝线缝合线（4-0 规格，0.17 mm，长 3–5 cm）置于门静脉已清理区域下方（图 2Ci），并打一个松散的单结（图 2Cii）。
   2. 在远离肝脏和结扎点的位置，对门静脉做纵向切口（图 2Ciii）。
   3. 将 1 mL 绿色树脂与 50 μL 固化剂在 1 mL 注射器中反复抽吸混合 ，然后将树脂-固化剂混合物装入 1 mL 鲁尔注射器中。
   4. 将装满的注射器连接至导管（>P30 小鼠使用装置 #2，<P30 小鼠使用新的装置 #1）。推动活塞，完全填充导管。确保树脂从导管尖端滴出。
      注意：为获得最佳效果，应避免并清除注射器和导管中的气泡。
   5. 使用镊子牵拉周围组织朝向操作者，拉直门静脉，并将导管插入，使斜面尖端的最长边缘朝向血管背侧（图 2Ciii）。
   6. 收紧丝线，固定导管于门静脉内。
   7. 将树脂注入门静脉。观察血管被树脂填充的情况。用 PBS 湿润的棉签轻柔按摩肝脏，帮助树脂均匀分布（图 2Civ）。
   8. 当所有血管均被填充（门静脉末端在肝脏边缘可见）或感到阻力时，停止注射。
      注意：由于加入固化剂后树脂开始硬化，操作需迅速。加入固化剂后的可操作时间约为：装置 #1 为 15 分钟，装置 #2 为 25 分钟。
   9. 拔出导管，用镊子迅速收紧丝线结，防止树脂泄漏。
   10. 将含树脂的导管、剩余树脂放入危险废物容器，针头放入锐器废物容器。
4. 肝脏解剖与固定
   1. 剪除肝脏周围组织和膈肌，将整个肝脏完整解剖取出。
   2. 将整个肝脏轻柔放入空的 50 mL 圆锥形离心管中，腹侧朝上，背侧靠在管壁上，以防止肝脏变形。将离心管水平放置，于 4 °C 下过夜，使树脂完全固化。
      注意：任何足够容纳肝脏的容器均可替代 50 mL 圆锥形离心管。使用平底容器可进一步降低肝脏变形的风险。
   3. 将肝脏分离为各个肝叶。选择用于 microCT 分析（1.4.4–1.4.5）或质量控制（1.4.6–1.4.8）的肝叶。也可选择不分离肝叶，直接对整块肝脏进行光学透明化和 microCT 分析。
      注意：不同肝叶的胆道系统和血管系统结构存在差异，因此需进行匹配肝叶分析。光学透明化不影响 microCT 扫描，用于质量控制的肝叶可在后续进行 microCT 扫描；反之，经 microCT 扫描的样本也可后续进行光学透明化以进行比较。因此，整肝分析是可行的。在野生型小鼠（C3H/C57bl6 遗传背景）中，右侧中叶通常最先被树脂填充，因此是 microCT 分析的理想选择，具有最高可重复性。左侧外侧叶是最大的肝叶，便于预筛注射质量。用于质量控制和 microCT 扫描的肝叶（或整肝）选择取决于动物模型和研究问题。
   4. 在通风橱中，配制 4% 甲醛溶液（每管 10–20 mL）。将用于 microCT 的肝叶在 4% 甲醛中于 4 °C 下固定过夜，随后用 PBS（每管 10–20 mL）洗涤一次。
   5. 将甲醛废液收集至专用容器中。肝脏肝叶可短期保存于 PBS 中（4 °C），或长期保存于 70% 乙醇中。随后进入第 2 节：微型计算机断层扫描。
      警告：甲醛若被吞咽、吸入或接触皮肤，会引起急性毒性。甲醛为易燃液体和蒸气，可导致严重皮肤灼伤和眼睛损伤。可能引起过敏性皮肤反应。高浓度或粉末状态下吸入可致死。可能引起呼吸道刺激。怀疑可导致遗传缺陷。可能致癌。会对器官（眼睛、中枢神经系统）造成损害。预防措施：远离热源、高温表面、火花、明火及其他点火源。禁止吸烟。佩戴防护手套和防护服。发生泄漏时，立即脱去所有受污染衣物。若皮肤接触：用清水冲洗污染区域。若吸入：将人员移至空气新鲜处，若呼吸舒适则进行监测，并立即联系中毒控制中心或医生。若进入眼睛：用清水冲洗眼睛数分钟。如佩戴隐形眼镜且易于取出，应取出。
   6. 用于质量控制时，将剩余肝叶（至少一个）用 50% 甲醇（与去离子水混合）在室温下振荡固定至少 4 小时，随后用 100% 甲醇在室温下振荡过夜。将甲醇废液收集至专用容器中。
      警告：甲醇若被吞咽、吸入或接触皮肤，会引起急性毒性。甲醇为易燃液体和蒸气。操作时佩戴防护手套和防护服。避免吸入，远离火源和热源。使用后彻底清洗皮肤。发生泄漏时，立即脱去所有受污染衣物，并用清水冲洗皮肤。若吸入：将人员移至空气新鲜处，保持呼吸舒适。若吸入、吞咽或接触，立即联系中毒控制中心或医生。
   7. 在通风橱中，配制苯甲醇与苯甲酸苄酯（BA:BB，1:2）溶液（每肝叶 5–10 mL）。
   8. 将肝叶放入 15 或 50 mL 聚丙烯管（根据肝叶大小选择）中，加入 BABB 溶液。在室温下振荡，直至组织透明。此过程可能需要 2–16 小时，具体时间取决于肝叶大小。
      注意：BABB 溶液可溶解某些类型的塑料。样品可安全保存于聚丙烯管或玻璃容器中。
      ​警告：苯甲酸苄酯吞咽后可引起急性毒性。对水生生物有毒，且具有长期持续影响。预防措施：操作后彻底清洗皮肤。吞咽、皮肤接触或吸入均有害。避免吸入烟雾/蒸气。操作后彻底洗手。使用本产品时禁止饮食、饮水或吸烟。若吞咽，身体不适时立即联系中毒中心/医生。应在通风区域使用。收集泄漏物。 内容物及容器应送至批准的废物处理厂处置。
   9. 检查注射质量。仅高质量注射的肝脏方可进行 microCT 扫描。

2. 显微计算机断层扫描

1. 样品制备
   1. 通过混合100 mL蒸馏水和1 g琼脂糖粉末制备1%琼脂糖凝胶。将混合物放入微波炉中加热至琼脂糖粉末完全溶解。
   2. 将1%琼脂糖凝胶冷却至约40 °C，以避免对肝组织样品造成热损伤。
   3. 将感兴趣的肝叶放入15 mL锥形管中，并加入1%琼脂糖凝胶至管总体积的约2/3处。此步骤可最大限度减少CT扫描过程中的样品非预期移动。
2. CT扫描
   注意：以下步骤依赖于具体的CT设备，不同设备和制造商的具体设置与操作可能有所不同。本方案中使用的显微计算机断层扫描仪配备纳米焦点X射线管（180 kV/15 W）和动态平板探测器41|100（4048 px × 4048 px，像素尺寸100 mm，2倍binning），用于CT扫描。
   1. 将含有样品的15 mL锥形管安装在CT设备的旋转台上，并使其在测量腔内至少热平衡1小时。
   2. 样品完成热平衡后，将其置于视野（FOV）中心位置。
   3. 优化源-样品距离（SSD）和样品-探测器距离（SDD），以达到足够的体素分辨率，例如成年小鼠肝脏样品为12 µm，<P30肝脏为6.5 µm，分别对应于预先设定硬件条件下的视野尺寸24.3 mm × 24.3 mm和13.2 mm × 13.2 mm。
   4. 根据CT设备制造商的建议设置采集参数（如加速电压和电流、曝光时间、binning、平均次数），以获得足够强度的检测信号。这些参数不仅依赖于CT设备，也依赖于样品本身，应针对每个样品进行优化。在Hankeova 等⁹的研究中，所用参数为：80 kV加速电压、160 µA加速电流、400 ms曝光时间，共采集2000幅图像。
   5. 开始CT扫描，并使用专用的断层重建软件对CT数据进行重建。

3. 分析与数据分割

注意：以下步骤依赖于图像处理软件；具体设置和操作可能因所使用的软件而异。

1. 加载 CT 数据：选择 文件 > 导入 > 命令。进一步的选择取决于待处理 CT 数据的具体格式。
2. 使用顶部面板上的 表面确定 功能，通过全局阈值法对数据中的树脂进行分割。在对话窗口中，通过将红色的 "等值线" 设置到适当位置，利用直方图评估确定阈值，以仅分割树脂填充的管道（即，被所示 "预览面板" 中黄色线框包围的部分）（图 3A）。
3. 在左侧面板中，选择 从体数据/CAD/网格创建 ROI 模块，以创建树脂填充管道的兴趣区域（ROI）。在对话窗口中，使用 从实体创建 ROI(s) 选项，选择已处理体数据的名称并确认。
4. 消除该 ROI 背景区域中噪声簇的错误分割。在右侧面板中标记此 ROI，右键单击并选择 分割 ROI 模块。
5. 在对话窗口中，设置 最小体积 [体素] 参数以排除所有噪声颗粒——该数值依赖于实验和数据，必须针对每个待分析样本进行优化（图 3B）。
6. 在树脂铸型 ROI 中生成平滑、连续且无伪影的导管掩膜——例如，避免气泡或树脂泄漏的存在。
7. 在左侧面板中使用 平滑 模块，将 平滑强度 参数设为 1 或 2（根据具体数据而定，较高值可能导致模型变形，尤其是在处理精细结构时）。如有需要，可运行该过程两次（图 3C）。
8. 识别并分离分割后的树脂掩膜中的各个管状系统。
   1. 为使用吸收性更强的树脂（用于胆总管注射的黄色树脂）填充、在 CT 数据中具有较高强度值的系统，单独创建一个 ROI。操作步骤同 3.2 所述（图 3Di）。
   2. 标记新创建的 ROI 和树脂掩膜 ROI，右键单击并选择 减去 ROI(S)，将新 ROI 从树脂掩膜 ROI 中减去，从而为剩余的管状系统创建新的 ROI（图 3Dii, iii）。
9. 根据操作者偏好，以多种格式导出两个管状系统的最终 ROI，以便在不同软件中进行后续处理。进一步地，可在体视图形软件中处理这些 ROI，以图像或视频形式导出最终可视化结果。

结果

操作要点
当肝内胆管和门静脉血管系统均被充分填充时，即实现了成功的双重树脂灌注。作为质量控制步骤，可对一个肝叶（例如左外侧叶）进行透明化处理，以验证灌注是否成功，随后对目标肝叶进行成像。经光学透明化处理的肝叶后续可使用显微CT扫描，因此整个肝脏均可进行光学透明化处理。在灌注良好的小鼠肝脏中，门静脉血管系统应被树脂完全填充至肝脏边缘，并在侧支中可见树脂（图4），该结构在显微CT扫描及分割后的数据中可被真实再现。此外，灌注良好的肝内胆管应清晰可见，紧邻主门静脉分支并几乎延伸至边缘，主要侧支中也应可见树脂。若对照肝叶通过了质量控制步骤，则目标肝叶（包括已透明化的肝叶）可进行显微CT扫描。图中展示了灌注良好的P15小鼠（图4A、B）和成年小鼠（图4C、D）肝脏分割数据的结果。

不应进行的操作
完整的肝脏组织是成功注射的前提条件。在切开腹腔和横膈膜时需格外小心，避免意外划伤肝脏组织。如果在此过程中肝脏受到物理性损伤，树脂在门静脉注射时极有可能发生泄漏（图5A）。若肝脏存在物理损伤，则无法实现对血管系统的良好灌注。

常见的错误之一是肝脏树脂灌注不足，这可能导致后续可视化或分析困难。系统灌注不足的原因之一是，在注射完成前，树脂在针头或导管尖端过早固化（图5B，蓝色箭头和方括号指示较大的气泡）。建议每只动物使用一套独立的注射装置，并在将固化剂加入树脂后迅速操作。如果在注射过程中树脂发生固化（可通过系统半填充现象观察到，此处以门静脉血管系统半填充为例），应移除导管，斜向剪除导管尖端（始终采用斜切以形成斜面），然后推动注射器活塞。若树脂重新开始滴出，则小心地将导管重新插入并用缝线固定。如果树脂已在针头内固化，则需完全更换导管，重新填充树脂（避免产生气泡），小心地重新插入导管，并用缝线固定。更换导管可能具有挑战性，尤其是在出生后小于30天的幼鼠图5C，蓝色箭头表示在末梢分支中可见的血液）。当血管末端充满血液而非树脂时，即可观察到此现象。为避免此问题，应在注射前确保门静脉（肝脏外部分）内无任何血液残留。肝脏灌注不足的第三个原因是导管插入过深，进入某一肝叶的分支血管。为防止这种情况，导管插入位置应距离肝脏入口至少0.5 cm。

相反，其中一个或两个系统会因树脂过度填充而超载（图5D）。在整个注射过程中，必须持续肉眼观察肝脏。与门静脉树脂灌注相比，胆道系统的树脂灌注更具挑战性，因为树脂填充的胆管在肝脏表面仅呈现微弱可见，难以判断系统接近充满的时间以及何时应停止灌注。当肝脏表面出现微小的黄色树脂斑点时（图2Ci，蓝色箭头），表明胆道系统已完全充满，树脂开始从胆管中渗出。轻微的树脂渗漏可在显微CT数据分割过程中手动校正（图5D，右侧面板）。

如果注射压力过高，可能导致血管或导管破裂（图5E），从而不可逆地破坏血管或导管结构，导致肝脏不适合进行显微CT扫描或分析。为避免树脂过度填充，需针对每种小鼠模型优化注射的体积和压力。当使用经毒性饮食处理、基因修饰或存在影响胆道或静脉系统、或肝硬度改变的肝损伤小鼠时，可能需要调整注射压力和体积，因其可耐受的体积和压力可能与野生型小鼠不同。本方案描述的是两个系统的手动注射方法，但也可将注射器连接至泵以标准化注射压力。气泡是另一种常见的注射伪影，会导致管状网络填充不全（图5F-H，蓝色箭头）。为避免气泡形成，应确保注射器和管路中无任何气泡，完全充满树脂，并在注射前有树脂从管路末端滴出。在显微CT数据中表现为负信号区域的小气泡可在后期处理过程中手动校正，但该过程较为耗时。

新鲜为最佳
使用新鲜的黄色树脂是至关重要的因素，显著影响两种树脂之间的对比度以及微计算机断层扫描（microCT）数据的分割效果。当使用新开封的树脂时（图6A），黄色树脂灌注的胆管（亮白色）与绿色树脂灌注的门静脉（亮灰色）之间的对比度差异清晰可见。使用新鲜树脂灌注的肝脏样本可通过自动全局阈值法轻松处理。随着储存时间延长，树脂会发生沉淀，导致对比度下降。储存3个月后，对比度仍可能足以区分门静脉与胆管（图6B），但沉淀会影响两种树脂的混合均匀性，在充填的门静脉中表现为不均匀的不透光区域（图6B，蓝色箭头）。这种不均匀的对比度会对自动阈值分割产生负面影响，需进行手动校正，从而增加数据处理时间。若树脂储存超过六个月，其对比度会严重退化，仅凭对比度已无法区分黄色树脂灌注的胆管与绿色树脂灌注的门静脉（图6C）。此时，必须依据胆管和门静脉在肝门区域的管径和位置进行手动分割，并在整个microCT数据集中逐层追踪。该过程极为耗时，应尽量避免。

图1：树脂铸型注射装置。（A）注射装置#1由一支30 G针头和长约30 cm的PE10管组成。注射装置#2由一支23 G针头和长约30 cm的PE50管组成。（B）将管的末端拉伸并斜向剪切，以形成斜面尖端。A和B中的尺子为厘米尺，主刻度间隔为1 cm，中间刻度间隔为5 mm，次级刻度间隔为1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：双重树脂灌注流程图。（A）示意图显示小鼠静脉循环系统及心脏结构，其中右心房（应于灌注前剪除）以高亮显示，灌注时针头应插入左心室，以冲洗循环系统中的血液。肾下方的下腔静脉应切断，以释放血管压力。（B）胆管树脂灌注流程图。（i）（A）的放大图，显示下腔静脉切断位置。（ii）图像显示从肝脏门部区域至奥迪括约肌（黑色箭头）的胆总管（黄色虚线），胆总管下方有缝合线。（iii）在胆总管周围打松散单结的合适位置。（iv）黄色虚线与黑色箭头标记奥迪括约肌，展示斜切口的角度及斜切后开口应呈现的形态。（v）示意图显示PE10导管斜面开口（朝上）插入时的方向。（vi）黄色树脂注射时的外观；树脂应能顺利通过松结。IVC，下腔静脉；CBD，胆总管。（C）门静脉树脂灌注流程图。（i）绿色虚线标记从门部区域起始的门静脉。蓝色箭头指示胆道系统过度充盈。（ii）在门静脉周围打松散单结的合适位置。（iii）示意图显示插入时斜面开口（朝上）的方向。（iv）绿色树脂与黄色树脂注射后肝脏的外观；注意肝脏边缘处树脂填充的血管。PV，门静脉。图 2A 使用 Biorender.com 制作。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：体图形软件中的显微CT数据处理。（A）表面确定，（i）过高估计的等值（当前选择预览以黄色显示），（ii）过低估计的等值，（iii）门静脉和胆管正确表面确定的等值最优选择。（B）由表面确定生成的兴趣区域（ROI）分割，（i）在对话框中将阈值设得足够高，使仅保留一个片段（最大的一个），（ii）黄色框内显示较小的（被排除的）颗粒。（C）数据的表面平滑处理，（i）平滑功能位于左侧面板，（ii）将平滑强度设为1（最大为2），并创建新的平滑ROI，（iii）平滑后的数据。（D）单个管状系统的分离，（i）在表面确定功能中设置等值，使选择仅包含胆道系统（当前选择预览以黄色显示），（ii）标记两个系统的ROI以及仅胆道系统的ROI，然后从两个系统的ROI中减去胆道系统ROI，（iii）门静脉以灰色显示，胆道系统以绿色显示。请点击此处查看该图的放大版本。

图4胆管（BD）和门静脉（PV）系统显影良好。 (A出生后第15天（P15）肝脏右内侧叶（RML）经两种树脂分别注入两个系统后的光学透明化成像。比例尺：1 mm。BP15 RML 的三维渲染图如（所示A）显示门静脉血管系统为白色，胆管系统为绿色。比例尺：1 mm。C) 经光学透明化处理的成年小鼠肝脏RML，向两个系统分别注射两种树脂。比例尺为1 mm。 (D成年RML的3D渲染图，如图（所示C）显示门静脉系统为白色，胆道系统为绿色。H = 肝门区，P = 外周区。比例尺为1 mm。图A、B、D经Hankeova等许可改编。⁹. 请点击此处以查看该图的放大版本。

图5：双树脂肝脏灌注的常见问题。（A）图像显示在初次打开腹腔时意外划伤肝脏，树脂从切口处泄漏（蓝色箭头）。（B）由于树脂过早硬化导致门静脉系统灌注不良。蓝色箭头指示空的终末分支，红色括号标注大泡。比例尺为1 mm。（C）由于经心脏灌注不佳导致门静脉系统灌注不良。蓝色箭头指示终末分支中可见的血液。比例尺为1 mm。（D）因胆道系统过度填充而出现孤立的树脂球。左侧面板显示光学透明化后的肝脏，右侧面板显示三维微计算机断层扫描（microCT）重建图像。蓝色虚线框表示放大区域。黑色箭头指示在microCT扫描后光学透明化过程中受损的肝组织部分。比例尺为1 mm。（E）树脂注射过程中压力过高可导致门静脉破裂（本图中的动物携带Jag1H268Q突变），由蓝色箭头标示。比例尺为1 mm。（F）门静脉注射过程中树脂中的气泡（蓝色箭头），以及（G）胆道系统注射过程中的气泡（蓝色箭头），比例尺为1 mm。（H）microCT扫描显示气泡（蓝色箭头）、灌注不良的终末分支（红色括号）和树脂泄漏（黄色箭头），比例尺为1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：不同树脂显影对比效果。（A）新制备的黄色树脂可产生足够的对比度，以区分注射树脂的门静脉（灰色）和胆管（白色）。（B）黄色树脂储存3个月后发生沉淀，导致显影不均（门静脉呈灰白色，蓝色箭头所示）。（C）黄色树脂长期储存（>6个月）后，门静脉（灰色）与胆管（灰色）之间的对比度显著降低。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

决定DUCT技术成功的关键步骤包括样本制备以及CT设备参数的设置。为获得最佳结果，应使用对比度良好、灌注充分且无气泡的树脂，以便通过自动阈值分割进行简便的数字化处理，从而获取三维数据、图像和视频。经过培训并遵循本方案，90%的灌注实验可取得成功，并产生可重复的数据。使用新开封的黄色树脂至关重要，以实现两种灌注系统之间最佳的对比效果。黄色树脂具有很强的射线阻滞性，而蓝色树脂则几乎不显影。在新打开黄色树脂瓶后的前三个月内使用，可获得最佳效果。随着时间推移，树脂会发生沉淀，长期储存后（>6个月后，黄色和绿色树脂在CT扫描中将不再可区分。对比度差的图像需要进行大量且耗时的手动追踪和系统分割。接下来，充分拉伸的导管对于插入成年小鼠的胆总管以及新生小鼠的胆总管和门静脉至关重要。注射入口的制备必须谨慎进行。若横向切开胆总管，其很可能从周围组织中脱离，从而阻碍导管的顺利插入。此步骤在新生小鼠中尤为精细，因为胆总管容易回缩 "卷曲起来" 如果胆管已与其周围组织分离，将导致插管极为困难。胆总管的进入和注射可能需要一些练习。在准备树脂填充的导管及整个注射过程中，应避免气泡产生，因为气泡会在CT图像中形成空腔伪影，后续需耗时的手动校正。注射过程中及注射完成后，必须用湿润的棉签轻轻按摩肝脏表面，通过滚动方式促进树脂均匀分布。注射完成并拔出导管后，必须迅速而小心地收紧丝线结扎线，防止树脂在完全聚合前从肝脏中流出。为获得成功的显微CT成像，样本必须使用琼脂糖妥善固定，并进行热适应处理，以消除CT数据中的运动伪影。扫描参数的设置也至关重要，应优化以达到足够的空间分辨率，从而清晰分辨细微结构。

可通过技术改进注射方法，以实现对更年轻小鼠的注射。目前，对更年轻小鼠肝脏进行树脂铸型的主要限制在于缺乏足够细的导管，其中PE10是目前 commercially available 的最小导管。Tanimizu 等人曾成功使用玻璃毛细管向胚胎第17天（E17）小鼠的胆总管注射碳素墨水¹¹。因此，未来测试是否可通过玻璃毛细管输送树脂将具有重要意义。DUCT 方法还被进一步改进用于其他管状系统的注射，例如肺部的气道和肺动脉血管系统⁹。双树脂注射法也可进行调整，以适用于其他 commercially available 的树脂，或可用于碳素墨水的注射。

DUCT 流程的主要限制因素之一是树脂的黏度。DUCT 仅可用于直径大于 5 µm 的管状结构的树脂灌注。在本数据集中，树脂能够渗透最小直径为 5 µm 的管道⁹。这一尺寸限制使得无法对细小的导管和微小毛细血管进行分析。为了进一步将 DUCT 流程拓展至更小口径的血管，应测试其他市售树脂，或开发新型低黏度的造影剂，以改善管腔的渗透能力。

在 Hankeova 等人的研究⁹中，DUCT 方法与另外两种常用技术进行了比较：双色碳墨注射后结合组织透明化与常规摄影，以及采用 iDISCO+ 方法对血管进行 α-平滑肌肌动蛋白染色、对胆管进行细胞角蛋白 7 染色，随后进行三维成像⁹。在双重分析（由于肝脏自发荧光较强，iDISCO+ 在此方面存在困难）、三维成像、定量分析（碳墨注射法无法实现）以及管腔显影（DUCT 可提供管腔内部结构及系统灌注信息）等方面，DUCT 均优于另外两种方法。如上所述，DUCT 的主要局限性在于可注射和分析的最小管腔尺寸（下限为 5 µm），在此参数上，碳墨注射法和 iDISCO+ 表现更优。DUCT 相较于单一系统的树脂铸型^3,5,6 具有优势，因为它允许分别分析每个被注射的系统，同时便于进行双重三维分析，以研究两个系统之间的结构关系。

DUCT 可用于研究任意两种三维管状网络。作为原理验证，DUCT 已被用于可视化肝脏的胆管系统和门静脉系统，以及肺脏的肺动脉血管系统和气道⁹。肝内胆管在门静脉附近发育，而门静脉则作为结构模板和信号中心，调控胆管树的生长与分化¹²。在 Hankeova 等人的研究中⁹，DUCT 被用于探索一种模拟人类儿童疾病 Alagille 综合征的小鼠模型中的胆管再生过程。DUCT 揭示了胆管系统为实现接近野生型体积所采用的此前未见报道的结构机制⁹。Alagille 综合征小鼠采用了两种不同的策略：（1）在肝脏门部和中央区域，胆管系统增加了分支数量；（2）在肝脏外周区域，新生的胆管表现出高度扭曲的形态。尽管结构异常，这两种因素共同作用，使胆管系统的总体积接近正常水平。此外，DUCT 还检测到胆管的异常分支现象，这些分支独立于门静脉的分支模式，并形成连接两条门静脉之间的桥状结构⁹。此类表型在单一树脂铸型技术中无法被发现，在二维组织学切片中则可能被误判为胆管增生。因此，DUCT 能够提供关于整个器官或肺叶水平上两种管状网络三维结构的详细数据，支持定性分析以及深入的定量分析。DUCT 有望成为不同动物模型中出生后肝脏发育与肝脏再生研究的新标准。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 安全密封微量离心管	Sarstedt	72.706
带软管的 23 G 蝶形针	BD bioscience	367283
23 G 针头	BD bioscience	305892
30 G 针头	BD bioscience	305106
琼脂糖	Top-Bio	P045
苯甲醇	Sigma Aldrich	108006
苯甲酸苄酯	Sigma Aldrich	B6630
Corning 50 mL 离心管	Sigma Aldrich	CLS430829-500EA	聚丙烯
棉签	Medicarier	60406
解剖显微镜	Leica Camera AG		Leica M60
Dulbecco 磷酸盐缓冲液	ThermoFisher Scientific	14190144
70% 乙醇	VWR	83801.41
Falcon 15 mL 离心管	Verkon	331.850.084.006
弯头镊子	Fine Science Tools	11051-10	Fine Graefe 10 cm 弯头
直头镊子	Fine Science Tools	11050-10	Fine Graefe 10 cm 直头
甲醛溶液	Sigma Aldrich	F8775
GE Phoenix v|tome|x L 240	Waygate Technologoies		微型计算机断层扫描仪
Hanks 平衡盐溶液	ThermoFisher Scientific	14025092
肝素	Leo Pharma	B01AB01	5000 IE/mL
异氟烷	Baxter	FDG9623
甲醇	ThermoFisher Scientific	11413413
MICROFIL	Flowtech	MV-122	黄色合成树脂
MICROFIL	Flowtech	MV-120	蓝色合成树脂
MICROFIL	Flowtech	MV-diluent	透明树脂稀释剂
巴斯德吸管	Verkon	130.690.424.503
蠕动泵	AgnThos	010.6131.M20
phoenix datos|x 2.0 软件	Baker Hughes		CT 数据重建软件
摇床	VWR	444-0142
丝线缝合线	AgnThos	14757	黑色丝线，4-0，无菌，100 m
皮肤剪	Fine Science Tools	14058-09	直头虹膜剪，9 cm
弹簧剪	Fine Science Tools	15000-03	Vannas 微型剪，直头，2 mm
1 mL 鲁尔注射器	BD bioscience	303172
PE10 管路	BD bioscience	427401
PE50 管路	BD bioscience	427411
VG Studio MAX 3.3 软件	Volume Graphics GmbH		CT 数据处理与分析软件