双重树脂铸型微计算机断层扫描,即 DUCT,可实现对两种管状系统的同步可视化、数字化和分割,从而促进器官结构的三维分析。DUCT 结合了 离体 注射两种造影树脂,随后进行显微计算机断层扫描及断层数据的分割。
方法文章
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双重树脂铸型微计算机断层扫描,即 DUCT,可实现对两种管状系统的同步可视化、数字化和分割,从而促进器官结构的三维分析。DUCT 结合了 离体 注射两种造影树脂,随后进行显微计算机断层扫描及断层数据的分割。
肝脏是人类和小鼠体内最大的内脏器官,其高自体荧光特性为在全器官水平上评估器官的三维(3D)结构带来了显著挑战。肝脏结构的特征在于存在多个分支的管腔结构,这些结构可被树脂填充,包括血管系统和胆道系统,它们在富含肝细胞的实质组织中形成高度规律的空间构型。本实验方案描述了双树脂灌注微计算机断层扫描(double resin casting micro-computed tomography)的操作流程,即"DUCT"技术。DUCT技术包括通过门静脉和胆总管分别注入两种不同的射线不透明合成树脂,随后进行组织固定。通过光学透明剂对一个肝叶或整个肝脏进行透明化处理,可实现对灌注质量的质控,从而预先筛选出灌注良好的样本。在DUCT流程的第二部分,可将一个肝叶或整块肝脏用于微计算机断层扫描(microCT)成像,并对门静脉系统和胆道系统的三维结构进行(半)自动分割与三维重建。microCT可生成两种树脂填充结构的三维坐标数据,从而支持对这两个系统及其空间关系进行定性与定量分析。DUCT技术适用于出生后及成年小鼠的肝脏研究,并可进一步拓展应用于其他管状网络系统,例如肺部的血管网络和气道结构。
器官树脂铸型是一种可追溯至17世纪的技术th 世纪1现代树脂铸型技术的早期应用实例之一是对一例尸检所得的人类肝脏进行的。通过将造影剂与明胶混合后灌注至肝内胆管,随后进行X射线CT扫描成像。2DUCT技术的目的是对两种管状树脂铸型网络进行三维可视化、数字化和联合分析。
DUCT 建立在已有的单系统肝脏树脂铸型技术的丰富知识基础之上3,4,5,6,7,8,并进一步实现了对两个系统的同步三维可视化与分析9。DUCT 通过将两种具有不同对比度的射线不透性树脂混合,并分别注入两个不同的网络——即胆总管和门静脉,从而将单树脂铸型技术发展为双树脂铸型技术。DUCT 可应用于出生后幼鼠,并可在出生后第15天(P15)即获得可重复的结果。与基于显微镜的成像技术相比,DUCT 的主要优势在于其操作更快、无需抗体,且肝脏组织的自发荧光不会干扰成像。此外,DUCT 可提供关于管腔形成状态、内径大小、网络连通性及灌注情况的定量数据。在分析某些器官时,区分管腔形成细胞的存在与否与其实际管状结构形态发生之间的差异至关重要,例如在 Alagille 综合征中,胆管样细胞存在但未能形成管状结构10。DUCT 的主要缺点是树脂渗透能力有限,因其黏稠,无法进入管径较小(<5 µm)的管道。在确定注射入口后,DUCT 可应用于任何管状结构,例如动脉和静脉循环系统、气道、肝外胆管或淋巴管。因此,该技术有望促进肺、胰腺等其他组织器官整体结构的分析。
MicroCT 分割图像可使用商业成像软件(如 ImageJ)或自定义流程(例如 MATLAB)进行处理。经树脂灌注的肝脏可进行定性分析,以评估网络扩张和连通性,或进行定量分析,包括单个系统的体积、长度、分支情况、扭曲度,以及两个系统之间的相互作用,例如系统间的距离或分支点依赖性(系统 1 是否在系统 2 分支附近发生分支?)。DUCT 分析流程涵盖了树脂灌注、MicroCT 扫描和 CT 数据分割,并结合对两种管状系统结构机制的详细定量分析,有望为动物模型中的全肝脏分析提供标准化方法。
本研究中所述方案已获斯德哥尔摩北部动物实验伦理委员会(Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd)批准,并遵循该机构关于动物福利的规章制度。本研究所用动物为野生型或纯合Jag1H268Q突变小鼠,遗传背景为C3H/N与C57BL6J混合背景。研究中同时包含雄性和雌性动物。动物使用时间为出生后第15天,或3至8月龄的成年个体。
1. 双重树脂注射
2. 显微计算机断层扫描
3. 分析与数据分割
注意:以下步骤依赖于图像处理软件;具体设置和操作可能因所使用的软件而异。
操作要点
当肝内胆管和门静脉血管系统均被充分填充时,即实现了成功的双重树脂灌注。作为质量控制步骤,可对一个肝叶(例如左外侧叶)进行透明化处理,以验证灌注是否成功,随后对目标肝叶进行成像。经光学透明化处理的肝叶后续可使用显微CT扫描,因此整个肝脏均可进行光学透明化处理。在灌注良好的小鼠肝脏中,门静脉血管系统应被树脂完全填充至肝脏边缘,并在侧支中可见树脂(图4),该结构在显微CT扫描及分割后的数据中可被真实再现。此外,灌注良好的肝内胆管应清晰可见,紧邻主门静脉分支并几乎延伸至边缘,主要侧支中也应可见树脂。若对照肝叶通过了质量控制步骤,则目标肝叶(包括已透明化的肝叶)可进行显微CT扫描。图中展示了灌注良好的P15小鼠(图4A、B)和成年小鼠(图4C、D)肝脏分割数据的结果。
不应进行的操作
完整的肝脏组织是成功注射的前提条件。在切开腹腔和横膈膜时需格外小心,避免意外划伤肝脏组织。如果在此过程中肝脏受到物理性损伤,树脂在门静脉注射时极有可能发生泄漏(图5A)。若肝脏存在物理损伤,则无法实现对血管系统的良好灌注。
常见的错误之一是肝脏树脂灌注不足,这可能导致后续可视化或分析困难。系统灌注不足的原因之一是,在注射完成前,树脂在针头或导管尖端过早固化(图5B,蓝色箭头和方括号指示较大的气泡)。建议每只动物使用一套独立的注射装置,并在将固化剂加入树脂后迅速操作。如果在注射过程中树脂发生固化(可通过系统半填充现象观察到,此处以门静脉血管系统半填充为例),应移除导管,斜向剪除导管尖端(始终采用斜切以形成斜面),然后推动注射器活塞。若树脂重新开始滴出,则小心地将导管重新插入并用缝线固定。如果树脂已在针头内固化,则需完全更换导管,重新填充树脂(避免产生气泡),小心地重新插入导管,并用缝线固定。更换导管可能具有挑战性,尤其是在出生后小于30天的幼鼠图5C,蓝色箭头表示在末梢分支中可见的血液)。当血管末端充满血液而非树脂时,即可观察到此现象。为避免此问题,应在注射前确保门静脉(肝脏外部分)内无任何血液残留。肝脏灌注不足的第三个原因是导管插入过深,进入某一肝叶的分支血管。为防止这种情况,导管插入位置应距离肝脏入口至少0.5 cm。
相反,其中一个或两个系统会因树脂过度填充而超载(图5D)。在整个注射过程中,必须持续肉眼观察肝脏。与门静脉树脂灌注相比,胆道系统的树脂灌注更具挑战性,因为树脂填充的胆管在肝脏表面仅呈现微弱可见,难以判断系统接近充满的时间以及何时应停止灌注。当肝脏表面出现微小的黄色树脂斑点时(图2Ci,蓝色箭头),表明胆道系统已完全充满,树脂开始从胆管中渗出。轻微的树脂渗漏可在显微CT数据分割过程中手动校正(图5D,右侧面板)。
如果注射压力过高,可能导致血管或导管破裂(图5E),从而不可逆地破坏血管或导管结构,导致肝脏不适合进行显微CT扫描或分析。为避免树脂过度填充,需针对每种小鼠模型优化注射的体积和压力。当使用经毒性饮食处理、基因修饰或存在影响胆道或静脉系统、或肝硬度改变的肝损伤小鼠时,可能需要调整注射压力和体积,因其可耐受的体积和压力可能与野生型小鼠不同。本方案描述的是两个系统的手动注射方法,但也可将注射器连接至泵以标准化注射压力。气泡是另一种常见的注射伪影,会导致管状网络填充不全(图5F-H,蓝色箭头)。为避免气泡形成,应确保注射器和管路中无任何气泡,完全充满树脂,并在注射前有树脂从管路末端滴出。在显微CT数据中表现为负信号区域的小气泡可在后期处理过程中手动校正,但该过程较为耗时。
新鲜为最佳
使用新鲜的黄色树脂是至关重要的因素,显著影响两种树脂之间的对比度以及微计算机断层扫描(microCT)数据的分割效果。当使用新开封的树脂时(图6A),黄色树脂灌注的胆管(亮白色)与绿色树脂灌注的门静脉(亮灰色)之间的对比度差异清晰可见。使用新鲜树脂灌注的肝脏样本可通过自动全局阈值法轻松处理。随着储存时间延长,树脂会发生沉淀,导致对比度下降。储存3个月后,对比度仍可能足以区分门静脉与胆管(图6B),但沉淀会影响两种树脂的混合均匀性,在充填的门静脉中表现为不均匀的不透光区域(图6B,蓝色箭头)。这种不均匀的对比度会对自动阈值分割产生负面影响,需进行手动校正,从而增加数据处理时间。若树脂储存超过六个月,其对比度会严重退化,仅凭对比度已无法区分黄色树脂灌注的胆管与绿色树脂灌注的门静脉(图6C)。此时,必须依据胆管和门静脉在肝门区域的管径和位置进行手动分割,并在整个microCT数据集中逐层追踪。该过程极为耗时,应尽量避免。

图1:树脂铸型注射装置。(A)注射装置#1由一支30 G针头和长约30 cm的PE10管组成。注射装置#2由一支23 G针头和长约30 cm的PE50管组成。(B)将管的末端拉伸并斜向剪切,以形成斜面尖端。A和B中的尺子为厘米尺,主刻度间隔为1 cm,中间刻度间隔为5 mm,次级刻度间隔为1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2:双重树脂灌注流程图。(A)示意图显示小鼠静脉循环系统及心脏结构,其中右心房(应于灌注前剪除)以高亮显示,灌注时针头应插入左心室,以冲洗循环系统中的血液。肾下方的下腔静脉应切断,以释放血管压力。(B)胆管树脂灌注流程图。(i)(A)的放大图,显示下腔静脉切断位置。(ii)图像显示从肝脏门部区域至奥迪括约肌(黑色箭头)的胆总管(黄色虚线),胆总管下方有缝合线。(iii)在胆总管周围打松散单结的合适位置。(iv)黄色虚线与黑色箭头标记奥迪括约肌,展示斜切口的角度及斜切后开口应呈现的形态。(v)示意图显示PE10导管斜面开口(朝上)插入时的方向。(vi)黄色树脂注射时的外观;树脂应能顺利通过松结。IVC,下腔静脉;CBD,胆总管。(C)门静脉树脂灌注流程图。(i)绿色虚线标记从门部区域起始的门静脉。蓝色箭头指示胆道系统过度充盈。(ii)在门静脉周围打松散单结的合适位置。(iii)示意图显示插入时斜面开口(朝上)的方向。(iv)绿色树脂与黄色树脂注射后肝脏的外观;注意肝脏边缘处树脂填充的血管。PV,门静脉。图 2A 使用 Biorender.com 制作。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3:体图形软件中的显微CT数据处理。(A)表面确定,(i)过高估计的等值(当前选择预览以黄色显示),(ii)过低估计的等值,(iii)门静脉和胆管正确表面确定的等值最优选择。(B)由表面确定生成的兴趣区域(ROI)分割,(i)在对话框中将阈值设得足够高,使仅保留一个片段(最大的一个),(ii)黄色框内显示较小的(被排除的)颗粒。(C)数据的表面平滑处理,(i)平滑功能位于左侧面板,(ii)将平滑强度设为1(最大为2),并创建新的平滑ROI,(iii)平滑后的数据。(D)单个管状系统的分离,(i)在表面确定功能中设置等值,使选择仅包含胆道系统(当前选择预览以黄色显示),(ii)标记两个系统的ROI以及仅胆道系统的ROI,然后从两个系统的ROI中减去胆道系统ROI,(iii)门静脉以灰色显示,胆道系统以绿色显示。请点击此处查看该图的放大版本。

图4胆管(BD)和门静脉(PV)系统显影良好。 (A出生后第15天(P15)肝脏右内侧叶(RML)经两种树脂分别注入两个系统后的光学透明化成像。比例尺:1 mm。BP15 RML 的三维渲染图如(所示A)显示门静脉血管系统为白色,胆管系统为绿色。比例尺:1 mm。C) 经光学透明化处理的成年小鼠肝脏RML,向两个系统分别注射两种树脂。比例尺为1 mm。 (D成年RML的3D渲染图,如图(所示C)显示门静脉系统为白色,胆道系统为绿色。H = 肝门区,P = 外周区。比例尺为1 mm。图A、B、D经Hankeova等许可改编。9. 请点击此处以查看该图的放大版本。

图5:双树脂肝脏灌注的常见问题。(A)图像显示在初次打开腹腔时意外划伤肝脏,树脂从切口处泄漏(蓝色箭头)。(B)由于树脂过早硬化导致门静脉系统灌注不良。蓝色箭头指示空的终末分支,红色括号标注大泡。比例尺为1 mm。(C)由于经心脏灌注不佳导致门静脉系统灌注不良。蓝色箭头指示终末分支中可见的血液。比例尺为1 mm。(D)因胆道系统过度填充而出现孤立的树脂球。左侧面板显示光学透明化后的肝脏,右侧面板显示三维微计算机断层扫描(microCT)重建图像。蓝色虚线框表示放大区域。黑色箭头指示在microCT扫描后光学透明化过程中受损的肝组织部分。比例尺为1 mm。(E)树脂注射过程中压力过高可导致门静脉破裂(本图中的动物携带Jag1H268Q突变),由蓝色箭头标示。比例尺为1 mm。(F)门静脉注射过程中树脂中的气泡(蓝色箭头),以及(G)胆道系统注射过程中的气泡(蓝色箭头),比例尺为1 mm。(H)microCT扫描显示气泡(蓝色箭头)、灌注不良的终末分支(红色括号)和树脂泄漏(黄色箭头),比例尺为1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图6:不同树脂显影对比效果。(A)新制备的黄色树脂可产生足够的对比度,以区分注射树脂的门静脉(灰色)和胆管(白色)。(B)黄色树脂储存3个月后发生沉淀,导致显影不均(门静脉呈灰白色,蓝色箭头所示)。(C)黄色树脂长期储存(>6个月)后,门静脉(灰色)与胆管(灰色)之间的对比度显著降低。比例尺:100 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
决定DUCT技术成功的关键步骤包括样本制备以及CT设备参数的设置。为获得最佳结果,应使用对比度良好、灌注充分且无气泡的树脂,以便通过自动阈值分割进行简便的数字化处理,从而获取三维数据、图像和视频。经过培训并遵循本方案,90%的灌注实验可取得成功,并产生可重复的数据。使用新开封的黄色树脂至关重要,以实现两种灌注系统之间最佳的对比效果。黄色树脂具有很强的射线阻滞性,而蓝色树脂则几乎不显影。在新打开黄色树脂瓶后的前三个月内使用,可获得最佳效果。随着时间推移,树脂会发生沉淀,长期储存后(>6个月后,黄色和绿色树脂在CT扫描中将不再可区分。对比度差的图像需要进行大量且耗时的手动追踪和系统分割。接下来,充分拉伸的导管对于插入成年小鼠的胆总管以及新生小鼠的胆总管和门静脉至关重要。注射入口的制备必须谨慎进行。若横向切开胆总管,其很可能从周围组织中脱离,从而阻碍导管的顺利插入。此步骤在新生小鼠中尤为精细,因为胆总管容易回缩 "卷曲起来" 如果胆管已与其周围组织分离,将导致插管极为困难。胆总管的进入和注射可能需要一些练习。在准备树脂填充的导管及整个注射过程中,应避免气泡产生,因为气泡会在CT图像中形成空腔伪影,后续需耗时的手动校正。注射过程中及注射完成后,必须用湿润的棉签轻轻按摩肝脏表面,通过滚动方式促进树脂均匀分布。注射完成并拔出导管后,必须迅速而小心地收紧丝线结扎线,防止树脂在完全聚合前从肝脏中流出。为获得成功的显微CT成像,样本必须使用琼脂糖妥善固定,并进行热适应处理,以消除CT数据中的运动伪影。扫描参数的设置也至关重要,应优化以达到足够的空间分辨率,从而清晰分辨细微结构。
可通过技术改进注射方法,以实现对更年轻小鼠的注射。目前,对更年轻小鼠肝脏进行树脂铸型的主要限制在于缺乏足够细的导管,其中PE10是目前 commercially available 的最小导管。Tanimizu 等人曾成功使用玻璃毛细管向胚胎第17天(E17)小鼠的胆总管注射碳素墨水11。因此,未来测试是否可通过玻璃毛细管输送树脂将具有重要意义。DUCT 方法还被进一步改进用于其他管状系统的注射,例如肺部的气道和肺动脉血管系统9。双树脂注射法也可进行调整,以适用于其他 commercially available 的树脂,或可用于碳素墨水的注射。
DUCT 流程的主要限制因素之一是树脂的黏度。DUCT 仅可用于直径大于 5 µm 的管状结构的树脂灌注。在本数据集中,树脂能够渗透最小直径为 5 µm 的管道9。这一尺寸限制使得无法对细小的导管和微小毛细血管进行分析。为了进一步将 DUCT 流程拓展至更小口径的血管,应测试其他市售树脂,或开发新型低黏度的造影剂,以改善管腔的渗透能力。
在 Hankeova 等人的研究9中,DUCT 方法与另外两种常用技术进行了比较:双色碳墨注射后结合组织透明化与常规摄影,以及采用 iDISCO+ 方法对血管进行 α-平滑肌肌动蛋白染色、对胆管进行细胞角蛋白 7 染色,随后进行三维成像9。在双重分析(由于肝脏自发荧光较强,iDISCO+ 在此方面存在困难)、三维成像、定量分析(碳墨注射法无法实现)以及管腔显影(DUCT 可提供管腔内部结构及系统灌注信息)等方面,DUCT 均优于另外两种方法。如上所述,DUCT 的主要局限性在于可注射和分析的最小管腔尺寸(下限为 5 µm),在此参数上,碳墨注射法和 iDISCO+ 表现更优。DUCT 相较于单一系统的树脂铸型3,5,6 具有优势,因为它允许分别分析每个被注射的系统,同时便于进行双重三维分析,以研究两个系统之间的结构关系。
DUCT 可用于研究任意两种三维管状网络。作为原理验证,DUCT 已被用于可视化肝脏的胆管系统和门静脉系统,以及肺脏的肺动脉血管系统和气道9。肝内胆管在门静脉附近发育,而门静脉则作为结构模板和信号中心,调控胆管树的生长与分化12。在 Hankeova 等人的研究中9,DUCT 被用于探索一种模拟人类儿童疾病 Alagille 综合征的小鼠模型中的胆管再生过程。DUCT 揭示了胆管系统为实现接近野生型体积所采用的此前未见报道的结构机制9。Alagille 综合征小鼠采用了两种不同的策略:(1)在肝脏门部和中央区域,胆管系统增加了分支数量;(2)在肝脏外周区域,新生的胆管表现出高度扭曲的形态。尽管结构异常,这两种因素共同作用,使胆管系统的总体积接近正常水平。此外,DUCT 还检测到胆管的异常分支现象,这些分支独立于门静脉的分支模式,并形成连接两条门静脉之间的桥状结构9。此类表型在单一树脂铸型技术中无法被发现,在二维组织学切片中则可能被误判为胆管增生。因此,DUCT 能够提供关于整个器官或肺叶水平上两种管状网络三维结构的详细数据,支持定性分析以及深入的定量分析。DUCT 有望成为不同动物模型中出生后肝脏发育与肝脏再生研究的新标准。
ERA 实验室的另一个项目由 ModeRNA 资助。ModeRNA 对本文所述项目/方案未起任何作用。
我们感谢 Kari Huppert 和 Stacey Huppert 在胆管插管技术方面的专业知识和帮助,以及他们实验室的热情接待。同时,我们还要感谢 Nadja Schultz 和 Charlotte L. Mattsson 在共同胆管插管过程中提供的协助。
感谢以下资助机构的支持:
在 ERA 实验室开展的工作:Karolinska Institutet(2-560/2015-280)、Stockholms Läns Landsting(CIMED(2-538/2014-29))、Ragnar Söderbergs stiftelse(瑞典基金会启动资助)、欧洲肝脏研究学会(Daniel Alagille 奖)、瑞典心肺基金会(20170723)以及 Vetenskapsrådet (2019-01350)
在JK实验室的工作中:我们感谢由捷克共和国教育、青年和体育部(MEYS CR,项目号LM2018110)支持的CzechNanoLab研究基础设施。J.K. 感谢FSI-S-20-6353基金项目的资助支持。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 安全密封微量离心管 | Sarstedt | 72.706 | |
| 带软管的 23 G 蝶形针 | BD bioscience | 367283 | |
| 23 G 针头 | BD bioscience | 305892 | |
| 30 G 针头 | BD bioscience | 305106 | |
| 琼脂糖 | Top-Bio | P045 | |
| 苯甲醇 | Sigma Aldrich | 108006 | |
| 苯甲酸苄酯 | Sigma Aldrich | B6630 | |
| Corning 50 mL 离心管 | Sigma Aldrich | CLS430829-500EA | 聚丙烯 |
| 棉签 | Medicarier | 60406 | |
| 解剖显微镜 | Leica Camera AG | Leica M60 | |
| Dulbecco 磷酸盐缓冲液 | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| 70% 乙醇 | VWR | 83801.41 | |
| Falcon 15 mL 离心管 | Verkon | 331.850.084.006 | |
| 弯头镊子 | Fine Science Tools | 11051-10 | Fine Graefe 10 cm 弯头 |
| 直头镊子 | Fine Science Tools | 11050-10 | Fine Graefe 10 cm 直头 |
| 甲醛溶液 | Sigma Aldrich | F8775 | |
| GE Phoenix v|tome|x L 240 | Waygate Technologoies | 微型计算机断层扫描仪 | |
| Hanks 平衡盐溶液 | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| 肝素 | Leo Pharma | B01AB01 | 5000 IE/mL |
| 异氟烷 | Baxter | FDG9623 | |
| 甲醇 | ThermoFisher Scientific | 11413413 | |
| MICROFIL | Flowtech | MV-122 | 黄色合成树脂 |
| MICROFIL | Flowtech | MV-120 | 蓝色合成树脂 |
| MICROFIL | Flowtech | MV-diluent | 透明树脂稀释剂 |
| 巴斯德吸管 | Verkon | 130.690.424.503 | |
| 蠕动泵 | AgnThos | 010.6131.M20 | |
| phoenix datos|x 2.0 软件 | Baker Hughes | CT 数据重建软件 | |
| 摇床 | VWR | 444-0142 | |
| 丝线缝合线 | AgnThos | 14757 | 黑色丝线,4-0,无菌,100 m |
| 皮肤剪 | Fine Science Tools | 14058-09 | 直头虹膜剪,9 cm |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-03 | Vannas 微型剪,直头,2 mm |
| 1 mL 鲁尔注射器 | BD bioscience | 303172 | |
| PE10 管路 | BD bioscience | 427401 | |
| PE50 管路 | BD bioscience | 427411 | |
| VG Studio MAX 3.3 软件 | Volume Graphics GmbH | CT 数据处理与分析软件 |
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