本文介绍了利用同轴流动聚焦装置包封人多能干细胞（hPSCs）的方法。我们证明，该微流控包封技术可高效生成hPSC细胞球。
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方法文章
微流控法制备负载人多能干细胞球体的核-壳微胶囊
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
三维（3D）或球形培养的人多能干细胞（hPSCs）在分化效果和可扩展性方面具有显著优势。本文介绍一种稳定且可重复的hPSC球形体形成策略，该方法利用同轴流聚焦装置将hPSCs包裹于核-壳微胶囊内部。核心溶液含有单细胞悬浮状态的hPSCs，并通过添加高分子量聚乙二醇（PEG）和密度梯度介质以增加黏度。壳层流由PEG-4臂-马来酰亚胺（PEG-4-Mal）组成，与核心流并行流动，共同流向两个连续的油相交界处。在第一个油相交界处形成液滴，壳层溶液包裹于核心外围。在第二个油相交界处，通过引入双硫醇交联剂（1,4-二硫苏糖醇，DTT）实现壳层的化学交联。该交联剂与马来酰亚胺功能基团发生反应 通过 点击化学，从而在微胶囊周围形成水凝胶外壳。我们的包封技术以每秒10个胶囊的速率生成直径为400 µm的胶囊。所得胶囊具有水凝胶外壳和水性内核，可使单个细胞快速组装成聚集体并形成球状体。该包封过程未对人多能干细胞（hPSCs）的活力产生不利影响， >包封后3天观察到95%的细胞存活率。作为对比，包封于实心凝胶微粒（无水相核心）中的hPSCs未能形成类球体，且存活率较低。 <包封后3天细胞存活率为50%。人多能干细胞（hPSCs）在包封后48小时内于核-壳微胶囊内形成球形聚集体，其直径大小取决于细胞接种密度。总体而言，本方案中描述的微流控包封技术非常适合hPSCs的包封及球形聚集体的形成。
引言
由于三维培养体系能够更好地维持人类多能干细胞（hPSCs）的多能性并提升其分化潜能，目前人们对hPSCs的三维培养产生了广泛兴趣 1,2,3。通常可通过生物反应器、微孔板、水凝胶以及聚合物支架等方法将hPSCs形成球状体或其他三维培养结构4,5,6。包封技术则为将单个hPSC组织成球状体提供了另一种途径。一旦被包封，hPSC球状体便可方便地操作，并可转移至微孔板中用于分化、疾病建模或药物筛选实验。将hPSCs包裹在水凝胶层中还能保护细胞免受剪切力损伤，从而可在生物反应器中以较高的搅拌速率培养球状体7。
我们的干细胞包封方法随着时间不断改进。最初，我们专注于固体水凝胶微粒，并成功实现了小鼠胚胎干细胞（mESCs）的包封与培养。8然而，据观察，人胚胎干细胞（hESCs）在被包封于此类水凝胶微粒中时存活率较低，推测是由于这些细胞在包封后需要更迅速地重建细胞间接触。我们推断，具有水相核心的异质微胶囊可能更适用于....
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方案
1. 器件制备
- 使用 CAD 软件设计微封装装置和解离装置的结构10,11。
- 在硅片上依次旋涂三层 SU-8 光刻胶（图 2A），以获得所需高度的结构：60、100 和 150 µm。
注意：顶部和底部模具的制备过程相同。- 将洁净的 10 cm 硅片以 1,100 rpm 的转速旋涂 SU-8 2025 负性光刻胶，形成第一层 60 µm 厚的结构。在热板上于 65 °C 预烘 3 分钟，再于 95 °C 预烘 10 分钟后，通过无掩模对准器进行曝光：将核心通道图案的设计文件上传至 µPG 101 PC 完成曝光。随后进行曝光后烘烤，条件为 65 °C 3 分钟和 95 °C 10 分钟。
- 以 1,500 rpm 的转速旋涂第二层 SU-8 2025 光刻胶（40 µm），并通过上传相应的壳层通道 CAD 文件进行曝光。
注意：软烘和曝光后烘烤的条件与前一步相同。 - 以 1,400 rpm 的转速旋涂第三层 SU-8 2025 光刻胶，使其厚度达到 50 µm，并重复上述步骤，但对油相结构进行曝光。
- 将包含三层结构的模具一次性浸入 SU-8 显影液中进行显影，直至所有未曝光的光刻胶完全去除。
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结果
通过遵循上述方案，读者将能够制备微流控装置并生成携带细胞的微胶囊。 图3A 展示了使用微流控液滴生成技术制备的优质与次优微胶囊的示例。不同配方的PEG-4-Mal导致形成不同形态的微胶囊——表面皱缩的微胶囊与不良的凝胶化、较低的机械完整性相关，且无法耐受在搅拌式生物反应器中的培养。当PEG含量为 >6% 的微胶囊呈现出理想的囊状形态，且结构足够稳定，可用于细胞培养。通过将微珠整合至微胶囊的核层以及将荧光基团整合至壳层，证实了核-壳结构。微珠在胶囊中心聚集的现象如图所示 图3B 被用作表明核心为水相的指示，且微珠可自由移动。观察到的荧光环状结构 图3C 表明存在水凝胶外壳，并用于确定外壳厚度。我们建议用户在建立包封工艺的初期阶段采用微珠掺入和荧光标记方法。
一旦建立了包封工艺，便可进一步对人多能干细胞（hPSCs）进行包封。尽管本方案描述的是H9细胞的包封，但我们已采用类似策略成功包封了另一种人胚胎干.......
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讨论
此处描述的包封过程可重复地形成人多能干细胞（hPSC）类球体。微胶囊形式便于将类球体分配至微孔板的孔中，用于优化分化方案或测试治疗方法的实验。包封的干细胞类球体也可用于悬浮培养，其中水凝胶外壳可保护细胞免受剪切力引起的损伤7。
该方案中包含若干关键步骤。必须将核相、壳相和油相流体的流速控制在方案部分所述的范围内。如果壳相流速过低，流动将变得不稳定，导致微胶囊形态扭曲且机械稳定性差。成功的细胞包封应呈现出与图4C所示相似的微胶囊形态。微胶囊应具有相近的直径，并在核心中包含数量相当的细胞。单个细胞通常在48小时内聚集成类球体，若在72小时仍无类球体形成，则为异常信号。类球体无法形成的原因之一可能是核相中的黏性分子未能通过水凝胶壳层快速渗出。当使用高分子量聚合物（如羧甲基纤维素，分子量250 kD）调节核相溶液黏度时，我们曾遇到此类情况。可通过包封微珠（见图3B）来检测这些与细胞尺寸相当的物体是否能在核内自由移动，以及核相.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了梅奥诊所再生医学中心、J. W. Kieckhefer基金会、Al Nahyan基金会、明尼苏达再生医学（RMM 101617 TR 004）和美国国立卫生研究院（NIH，DK107255）资助项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 注射器滤器 | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml 注射器鲁尔锁头 | BD | 309628 | |
| 1× DPBS | 康宁 | 23220003 | |
| 4臂PEG马来酰亚胺，10 kDa | 莱桑公司 | 164-68 | |
| 5 ml 注射器鲁尔锁扣式针头 | BD | 309646 | |
| 6孔未处理板 | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel 涂抹套装 | Aquapel 玻璃处理剂 | 47100 | |
| CAD 软件 | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| 细胞滤网 100 µm 孔径大小 | 基数 | 335583 | |
| 氯三甲基硅烷 | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL 全自动细胞计数仪 | 生命科技 | A27974 | |
| 数字加热板 | 数据板 | ||
| 数字涡旋混合器 | Fisher Scientific | 215370 | |
| 蒸馏水 | Gibco | 15230-162 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 培养基 | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 微型离心机 | 活体 | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 50144906 | |
| 倒置荧光电动显微镜 | Olympus | Olympus IX83 | |
| 劳雷尔旋涂机 | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| 活/死哺乳动物染色试剂盒 | Fisher | L3224 | |
| 魔术胶带 | 订书钉 | 483535 | |
| 微型医用导管（0.015" 内径 × 0.043" O.D.) | 科学商品公司 | BB31695-PE/2 | |
| 微型搅拌子 | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma 滤膜镊 | Fisher Scientific | XX6200006P | |
| 矿物油 | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 基础培养基 | 干细胞技术 | 85850 | |
| 针头-不锈钢 14号规格 | CML 供应 | 901-14-025 | |
| 针头-不锈钢 15 号针头 | CML 供应 | 901-15-050 | |
| OptiPrep | 干细胞技术 | 7820 | |
| 烘箱 | 赛默飞世尔科技 | HERA THERM 烤箱 | |
| 青霉素：链霉素（10,000 U/mL 青霉素G，10 mg/mL 链霉素） | 双子座 | 400-109 | |
| 150X20 毫米无菌透气培养皿 | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| 等离子清洗系统 | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| 聚乙二醇 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide 针头 27G | BD | 305109 | |
| ROCK抑制剂Y-27632二盐酸盐 | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| 硅晶圆 100 mm | 大学晶圆 | 452 | |
| 载玻片（75 mm ´ 25 mm | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X 离心管滤器（0.22 µm） µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8显影液 | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Royaltek 外科手术设计不锈钢手术刀片 | Fisher Scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD™ 184 硅弹性体试剂盒（PDMS） | 道康宁 | 2065622 | |
| 注射泵 | New Era泵系统公司 | NE-4000 | |
| 三乙醇胺 | Sigma-Aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon 管（0.02" 内径 × 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon 管（0.04" 内径 × 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| 超声波清洗机 FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| 真空干燥器 | Bel-Art | F42025-0000 | |
| 蔡司 Stemi DV4 体视显微镜 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 激光刻写仪 | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
参考文献
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history,....
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