本文介绍了配备MitoTimer生物传感器的星形胶质细胞培养物的线粒体延时成像方法，以及对线粒体动力学、运动性、形态、生物发生、氧化还原状态和周转的多参数分析。
本文内容
摘要
摘要
尽管线粒体在神经元水平上的改变已受到广泛关注，但最近的证据表明，星形胶质细胞中线粒体的动力学和功能与认知过程密切相关。本文介绍了利用携带线粒体生物传感器MitoTimer的星形胶质细胞培养物进行延时成像的方法。MitoTimer是一种强大而独特的工具，可用于评估线粒体的动力学、运动性、形态、生物生成及氧化还原状态。本文详细阐述了细胞培养、图像采集以及后续线粒体分析的各项具体步骤。
引言
星形胶质细胞在维持大脑稳态中起着关键作用。它们最广为人知的功能是在大脑中发挥重要的结构支持作用，例如作为血脑屏障的组成部分1，以及在整个大脑中为神经元和突触提供支持2。星形胶质细胞对神经元的支持既包括结构性的3，也包括代谢性的4,5，它们不仅促进神经发生和突触形成，还为活跃的神经元提供乳酸等关键代谢物4,6,7。除了结构支持功能外，星形胶质细胞也是具有活性的细胞，参与Ca2+信号传导与缓冲（包括线粒体自发的Ca2+内流）8,9、K+缓冲10，并能在脑损伤时适应和响应大脑的需求11,12。由于这类细胞具有高度动态性，其能量需求旺盛，因此需要一个高效的线粒体网络。这些线粒体在清除过量活性氧（ROS）方面也发挥着关键作用13。除了在线粒体自身能量生成和ROS清除中的个体或局部作用外，线粒体还以网络形式协同运作14。在此意义上，它们通过分裂与融合之间的平衡来维持稳态，分别代表新生/功能减弱的线粒体和老化/氧化程度较高的线粒体15。细胞的整体氧化还原状态可通过线粒体网络的氧化还原状态来评估。在病理条件下，这一信息尤为关键，有助于揭示哪些细胞可能未处于最佳功能状态。
近年来，已开发出多种传感器用于研究细胞中线粒体的动态变化与功能。例如，目前用于研究线粒体功能的传感器可检测能量交换（ATP）、氧化还原状态（NADH/NAD+、ROS）以及酶活性（cAMP、Ca2+、Zn2+）16。其中，MitoTimer 能够追踪线粒体形态（大小、形状、表面积）、运动能力（速度、位移）和动态过程（融合与分裂事件），以及整体线粒体周转速率和氧化还原状态的变化。MitoTimer 是一种突变型红色荧光蛋白 drFP58317，携带来自人细胞色素c氧化酶亚基VIII的线粒体靶向信号序列18,19，可将新合成的线粒体标记为绿色荧光（488 nm），而将氧化后的线粒体显示为红色荧光（555 nm）。通过分析绿色（488 nm）与红色（555 nm）荧光的比值，可同时评估单个线粒体，进行形态学分析、融合/分裂事件识别以及氧化还原状态的历史追踪20,21。这一独特性质可用于探究线粒体在生理与病理过程中所扮演的多种科学问题，因此在揭示多种不同类型细胞中线粒体动态机制方面具有广阔前景。
我们近期开发了一种新型慢病毒载体（LV-G1-MitoTimer-MiR124T，以下简称LV-G1-MitoTimer），用于特异性研究星形胶质细胞中线粒体的动态变化与功能 体外 和 体内22. LV-G1-MitoTimer 使用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子 gfaABC1D 的截短版本，并携带 B3 增强子（gfaABC1D(B3)，下文简称 G1），同时结合先前描述的 miR124T 神经元脱靶系统23可实现线粒体生物传感器在星形胶质细胞中的特异性表达 体外 和 体内22本文展示了培养大鼠海马星形胶质细胞并利用LV-G1-MitoTimer生物传感器对其进行标记的各个步骤，以及通过显微成像技术连续数小时至数天追踪星形胶质细胞线粒体行为的具体操作流程。
方案
本方案已获得伦理委员会批准（协议编号 VD3602，瑞士洛桑），并遵循欧洲关于动物使用的指导方针。
1. 大鼠海马星形胶质细胞原代培养
- 在出生后第1-2天，通过断头法处死五只新生大鼠（Wistar IGS大鼠）。
- 取出脑组织并置于含有5 mL新鲜星形胶质细胞培养基（DMEM/GlutaMAX，添加1%青霉素/链霉素和10%新鲜马血清）的培养皿中。
- 分离海马组织。用5 mL星形胶质细胞培养基，先经21 G针头吹打3次，再经25 G针头吹打3次进行解离。
- 将解离的细胞转移至15 mL离心管中，用血细胞计数板进行计数。
- 接种20,000–25,000个细胞/cm²2 在多孔培养皿（9.4 mm × 10.7 mm × 9.3 mm）中培养，并于含5% CO₂的环境中37 °C保存2 对于实验的其余部分。
- 3天后完全更换培养基 体外 （DIV3）
- 在DIV8时，每细胞加入0.6 pg编码线粒体生物传感器MitoTimer的慢病毒载体p24抗原（LV-G1-MitoTimer）22) 用磷酸盐缓冲液（PBS + 0.01% BSA）稀释。
- 在DIV9时，用预热的1×无菌PBS（37 °C）洗涤，并加入新鲜的星形胶质细胞培养基。
- 在DIV11时，用预热的1×无菌PBS（37 °C）洗涤2次，并加入不含酚红的新鲜星形胶质细胞培养基。
注意：包被剂的选择取决于预期的检测类型。对于星形胶质细胞原代培养的标准包被，建议使用 0.2 mg/mL 多聚-D-赖氨酸或 8.7 µg/cm² 的包被浓度。2 基底膜基质（例如 Matrigel）。为了可视化星形胶质细胞的线粒体系统，必须使用铺展且拉伸的细胞。在此情况下，在 IBIDI u型载片上联合使用基底膜基质是最为合适的。同时，必须避免使用酚红，因其在反复光照条件下对细胞具有毒性。
2. 线粒体系统的长期监测。
- 在使用LV-G1-MitoTimer慢病毒感染后至少3-5天评估星形胶质细胞的线粒体系统（以确保线粒体中具有足够的荧光水平）。
- 使用由图像采集与分析软件及全自动采集模块控制的倒置显微镜对细胞进行成像。
注意：有关本研究中所用软件和模块的详细信息，请参见材料表。 - 确保显微镜配备有培养箱孵育系统（见材料表），以在整个实验过程中维持星形胶质细胞培养环境为5% CO2和37 °C。
- 采用顺序激发方式采集荧光图像，激发波长分别为490 nm（绿色通道）和550 nm（红色通道），检测波长范围为绿色荧光500-540 nm（绿色通道）和红色荧光550-600 nm（红色通道）。
- 每孔选择5个表达足够水平LV-G1-MitoTimer且具有完整线粒体网络的星形胶质细胞，放大倍数为40倍。应尽量选择形态扁平且较大的单个星形胶质细胞，避免选择位于细胞簇中的细胞（以便对单个细胞进行操作）。
- 将所选5个细胞的坐标保存为xlm文件（map.xlm）。该map.xlm文件可使用户在后续时间点重新定位到相同的细胞。
- 针对每个坐标点，使用150倍放大倍数（100倍油镜物镜，1.5倍中间放大）采集图像序列（每秒1帧，持续60秒）。
- 在处理后6小时、12小时和24小时，对相同的星形胶质细胞重复进行图像采集（每秒1帧，持续60秒）。
注意：应使用配备快速高效自动对焦系统的显微镜。本研究中采用了名为Perfect Focus System（PFS）的硬件解决方案。PFS利用近红外870 nm LED和CCD线传感器，在长时间成像过程中实时校正轴向焦距波动。
3. 单个线粒体形态分析及LV-G1-MitoTimer比例
注意：本研究使用尼康公司的 NIS 通用分析 3 (GA3) 软件自动完成形态计量分析。
- 对于每个图像序列（基线、6 h、12 h、24 h），通过点击 ND 处理 > 选择帧，选择红色和绿色通道的第一帧。
- 通过选择 转换 > 合并通道，将红色和绿色通道合并。
- 为校正图像明暗不均，选择 预处理 > 自动明场校正。
- 通过选择 预处理 > 滚动球法，应用滚动球算法。
- 为生成每个线粒体的二值掩膜，选择 分割 > 阈值。
- 通过选择 二值化处理 > 接触边界的对象，移除被图像边界截断的对象。
- 为测量表面积，选择 测量 > 对象面积。
- 为测量直径，选择 测量 > 等效直径。
- 为测量长度，选择 测量 > 长度。
- 为测量宽度，选择 测量 > 宽度。
- 为测量粗糙度，选择 测量 > 粗糙度。
- 为测量圆形度，选择 测量 > 圆形度。
- 为测量伸长率，选择 测量 > 伸长率。
- 将上述测量项组合成一个组（右键单击），并将其重命名为 MorphoData。
- 通过选择 测量 > 平均强度，测量绿色平均强度。
- 通过选择 测量 > 平均强度，测量红色平均强度。
- 为测量红/绿比值，选择 测量 > 比值。
- 将上述测量项组合成一个组（右键单击），并将其重命名为 RatioData。
- 通过选择 引用 > 表格导出为 CSV，将表格导出为 CSV 文件。
- 通过选择 另存为 保存分析的 GA3 脚本
注：本实验所用标准的非详尽列表汇总于 图 1、表 1 和 表 2。分析用 GA3 脚本文件见补充材料（补充代码文件 1 和 图 2）。所用阈值经过调整，以尽可能单独识别线粒体（尽可能排除大型线粒体网络）。在可能的情况下，线粒体网络将通过手动单独识别或从分析中排除。由于细胞间存在差异性，每种条件下至少应对 20–25 个细胞进行分析（每个细胞至少包含 50 个线粒体）。
4. 线粒体运动性的分析
注意：由于线粒体运动具有高度复杂性，建议采用手动运动分析。此处使用尼康的 NIS Element 系统对线粒体进行手动追踪。
- 在 NIS 中打开追踪模块，选择 查看 > 分析 > 追踪。
- 点击 定义新 ROI。
- 使用 自动检测工具，在图像序列的第一幅图像上选择 25–50 个线粒体。
- 点击 追踪自动检测的 ROI 并分析。
- 如有必要，删除错误的 ROI 追踪轨迹。
- 将表格导出为 CSV 文件。
注意：本实验所用标准的非详尽列表汇总于 图 1 和 表 3 中。追踪分析通常会生成一条路径，描绘每个被追踪对象中心的运动轨迹。不同的追踪选项必须在追踪设置中进行配置。优先选择彼此之间距离足够远的孤立线粒体，以利于追踪。仅保留能够在整个序列中持续追踪的对象。采用相同方法剔除因追踪质量差而产生的离群值。因此，本部分分析的对象集合与用于静态形态学分析的对象集合不同，通常数量更少。
5. 数据转换、标准化与统计分析
注意：主要由于线粒体的高度异质性，所获得的数据通常呈非正态分布。
- 在处理前，手动对测量值进行对数转换。
- 针对每次分析和时间范围，手动将所得数据归一化为参考采集数据的均值。
- 此外，可考虑对一个对照条件进行二次/双重归一化，例如用于评估处理效应。
- 然后，使用双向配对方差分析（two-way matched ANOVA）进行统计分析。本研究中使用了 GraphPad Prism V8。
结果
表达LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞原代培养物表现出典型的线粒体网络。在处理前，表达LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞显示出异质性的线粒体大小以及不同的绿色/红色荧光强度（图3、图4和视频1）。在加入H2O2（10 µM）孵育前后，持续监测了表达LV-G1-MitoTimer的星形胶质细胞培养物中的线粒体系统。上述不同线粒体特征在12小时内（每3小时一次）进行量化，并以细胞为单位归一化至其初始状态。在形态学水平上（图3B），H2O2的作用约在6小时后开始显现。实际上，线粒体发生断裂（长度、表面积和伸长因子减少）。在处理12小时后，这种断裂现象更加明显。需要注意的是，线粒体的直径、宽度和球形度并未降低。关于氧化还原状态和周转情况（图3C），H2O2处理3小时后，星形胶质细胞中绿色线粒体的比例增加（线粒体生物发生迅速增强的结果）。在6小时时，绿色/红色比值恢复至基线水平，但完全呈红色的线粒体数量较基础水平显著增加。12小时后，H2O2氧化处理的影响变得明显，导致红色点状结构的比例和数量大幅增加。关于动态行为和运动性（图3D），处理3小时后，所有运动参数均短暂升高。而在较长时间（12小时）后，线粒体移动速度变慢，移动距离也更短。
图 1：表达 LV-G1-MitoTimer 生物传感器的星形胶质细胞培养。（A）表达 LV-G1-MitoTimer 的星形胶质细胞的共聚焦显微图像。（B）不同碎片化程度下还原态（绿色）、平衡态（橙色）和氧化态（红色）线粒体的共聚焦图像选例。（C）表达 LV-G1-MitoTimer 的星形胶质细胞中可用于分析的各项指标的汇总示意图。比例尺：（A）上图：50 µm，下图：10 µm；（B）1 µm。请点击此处查看此图的高清版本。
图 2：线粒体形态学与比值分析。（A）用于分析单个线粒体形态学及比值的 GA3 脚本概览。（B）表达 LV-G1-MitoTimer 的星形胶质细胞初始图像，经 GA3 脚本分析。（C）星形胶质细胞线粒体系统生成的二值化掩膜示例。比例尺：10 µm（B-C）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：H2O2 对星形胶质细胞线粒体系统的影响。（A）表达 LV-G1-MitoTimer 的星形胶质细胞在 PBS（对照组）或 10 µM H2O2 处理前 1 小时及处理后 6 小时和 24 小时的图像。（B）线粒体形态学雷达图，（C）氧化还原状态与周转率，以及（D）在基础状态及 H2O2 处理后 3 小时、6 小时和 12 小时评估的星形胶质细胞运动性指标。SA：表面积；D：直径；L：长度；W：宽度；R：圆度；S：球形度；EF：伸长因子（=L/W）；G/R：红/绿荧光比值；Gpuncta：绿色点状线粒体百分比；Rpuncta：红色点状线粒体百分比；Dis：位移；Tr：轨迹长度；Sp 和 SpV：速度及速度方差；Str：直线性。比例尺：20 µm（A）和 2.5 µm（插图）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：表达 LV-G1-MitoTimer 的星形胶质细胞在基础状态下呈现均一且平衡的线粒体网络的显微照片。比例尺：20 µm 请点击此处查看该图的放大版本。
视频 1：H 的效应2O2 对培养的星形胶质细胞线粒体系统的影响 H处理前的星形胶质细胞线粒体2O2 治疗（基线）以及H后6 h和24 h2O2 与未经处理的对照细胞相比的处理组 请点击此处下载该文件。
| 形态学标准 | 范围 | 备注 | ||
| 表面积（SA） | 0.5–4 µm2 | 这些标准用于描述线粒体的碎片化与拉长特征。它们通常朝同一方向变化。碎片化的线粒体表面积、直径、长度和伸长因子会减小，而圆度、球形度和宽度可能不变或增加。 | ||
| 直径（D） | 0.5–1.5 µm | |||
| 长度（L） | 0.5–5 µm | |||
| 宽度（W） | 0.5–2 µm | |||
| 圆度（R） | 0–1 | |||
| 球形度（S） | 0–1 | |||
| 伸长因子（EF = L/W） | 1–10 | |||
表1：线粒体形态学所选参数汇总。
| 氧化还原状态标准 | 范围 | 备注 | ||
| 单个比值（G/R） | 0–10 | 该比值反映细胞线粒体氧化还原状态的结果，可提示线粒体的整体状态及其老化程度。需注意，此比值反映了线粒体生物生成与降解之间的平衡，以及氧化态线粒体与还原态线粒体之间裂变/融合的动态过程。因此，对绿色和红色点状结构数量的评估可有力辅助结果解读。当绿色荧光强度为红色的10倍时，判定为绿色点状线粒体；当红色荧光强度为绿色的10倍以上时，判定为红色点状线粒体。星形胶质细胞的氧化还原状态为该细胞内所有线粒体比值的平均值。 | ||
| 绿色点状线粒体百分比（Gpuncta） | 0%–100% | |||
| 红色点状线粒体百分比（Rpuncta） | 0%–100% | |||
表2：线粒体氧化还原状态所选参数汇总。
| 运动性判定标准 | 范围 | 备注 | ||
| 位移（Dis） | 0–10 µm | 上述参数共同反映了网络整体的运动动态特征。静止的线粒体表现为较短的位移和轨迹长度，且运动速度较低；而振荡运动的颗粒则可通过轨迹长度与位移之间的差异（导致直线性较低）以及相较于静态颗粒更高的速度加以区分。 | ||
| 轨迹长度（Tr） | 0–10 µm | |||
| 速度及速度方差（Sp 和 SpV） | 0–1.5 µm/s ± 0.2 µm/s | |||
| 直线性 | 0–1 | |||
| （Str = 位移 / 轨迹长度） | ||||
表3：线粒体运动性相关参数选择性汇总。
补充编码文件 1：用于分析单个线粒体形态的 GA3 脚本文件。 请点击此处下载该文件
讨论
本文提出了一种在培养的星形胶质细胞中纵向追踪线粒体系统动态变化与更新的新方法。与文献中常用的对固定细胞群体或单个细胞进行时间序列成像的方法24,25不同，该方法允许研究人员在数天内持续追踪同一单个细胞中线粒体系统的演变过程。与单孔活细胞成像（通常需要高强度光照，且难以筛选大量单个细胞）相比，本方法充分利用了显微镜可对同一孔中多个不同区域的细胞进行成像，并能在多个时间点重复返回并重新成像相同细胞的能力。通过对每个目标细胞的每项测量指标进行基线标准化处理，该方法充分考虑了线粒体系统的复杂性，并分析了处理因素相对于每个细胞自身基线图像所产生的影响。该显微镜可同时对多达16个孔（每孔成像5个细胞）自动执行此类成像，从而在数据分析中充分纳入线粒体系统的异质性，同时避免了在不同日期对不同实验条件进行成像所引入的实验变异性。
培养物的质量、表达LV-G1-MitoTimer生物传感器的病毒感染水平、显微镜及物镜类型，以及合适细胞的选择，是本实验方案中必须尽可能保持一致的关键变量。细胞密度、载体类型和病毒滴度可根据具体研究问题进行调整。尽管先前的研究表明，LV-G1-MitoTimer的表达对线粒体功能和动态无不良影响21,22,26,27，但仍必须验证所用浓度对细胞无毒性（例如，通过检测对照孔中细胞的总数来确认）。由于仅使用单个焦平面成像，星形胶质细胞应满足以下条件：（1）尽可能扁平；（2）与其他标记细胞分离（以简化因细胞在培养皿中位移而带来的分析困难）；（3）具有较高的荧光强度。由于培养中的细胞在形态上可能存在高度异质性，其线粒体系统也可能表现出显著差异。在此情况下，分析感兴趣区域（ROI）而非整个细胞，有助于规避某些复杂区域（如核周区域），并降低变异性。因此，应在形态相对相似的细胞中进行基线测定，并尽可能多地采样细胞。基于此，高内涵成像与分析显微镜最为适用。在进行此类纵向监测时，还需注意避免过度曝光，以防生物传感器发生光漂白。
该成像方法并非没有复杂性，在整个实验方案中包含了一些注意事项，这些注意事项考虑了此前使用显微镜进行测试时的故障排除经验。例如，所用培养板包被材料的选择取决于预期的实验类型，但本文已提供了针对星形胶质细胞原代培养最适宜选择的建议。此外，由于细胞间的变异性，每种条件下应至少对5个细胞进行成像。更具体地说，在基线成像时选定的一些细胞可能会死亡，一些会移出指定成像区域的视野，还有一些会改变其形态，导致在线分析中难以对线粒体进行个体化识别。从实验开始时对较多细胞进行成像，可提高实验结束时获得足够样本量用于分析的可能性。除了该成像技术本身的复杂性外，这种成像与分析方法在适用人群方面也存在一些明确的局限性。为了充分实现图像采集自动化的优势，所使用的显微镜必须配备能够适应图像间时间间隔速度（例如本方案中每3秒一次）的自动对焦系统，并且在每次拍摄前都能稳定地对准目标细胞。此外，若缺乏可自动完成整个图像采集过程的JOBS软件，该方法将变得极为繁琐，甚至可能无法实现，具体取决于需要成像的细胞数量，因为这将要求操作者在相应时间点手动重新定位并采集每个细胞的图像。最后，该成像方法也无法避免光漂白问题。因此，与任何长期采集方法一样，选择不易发生光漂白的荧光标记物，并优化图像采集参数以尽可能避免此问题，显得尤为重要。
该技术在关键方面不同于当前使用的其他方法。与其它延时成像研究不同，该技术无需在整个实验过程中持续对孔板中的同一位置进行成像，也无需手动移动孔板以获取其他区域的图像。这使得研究人员能够在24小时的时间范围内，在多种条件下对大量细胞进行成像。因此，能够在每个孔中对众多细胞进行成像和分析，既可以获得与广泛研究大量细胞群体时相当的群体信息，又能同时获得每个成像细胞的特定参数。尽管该方法的某些特异性可能不适用于其他图像采集方法（如上所述），但其所能实现的分析优势远超过可能遇到的复杂性。该技术使研究人员能够精确观察各种处理对线粒体系统以及培养的星形胶质细胞所产生的具体影响。
此外，该方法可根据有关线粒体行为及其在特定背景下作用的多种科学问题进行高度定制。本文所述方案主要针对培养的星形胶质细胞，但也可使用其他多种细胞类型，且可测试的处理方式仅受限于所研究的具体科学问题。此类成像技术有望推动人们对线粒体行为、导致线粒体功能障碍的潜在机制，以及多种病理状态对不同类型细胞中固有动态过程影响的集体认知与理解。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本研究由授予 K.R. 的 Synapsis 基金会博士后奖学金和洛桑大学医院（CHUV）资助。作者感谢尼康公司的帮助，特别是 J. Gannevat。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-载样片 8孔 | IBIDI | 80807 | |
| 19 G 针头 | Plexus SANTE | PL001213 | |
| 21 G 针头 | Plexus SANTE | PL000142 | |
| 25 G 针头 | Plexus SANTE | PL000133 | |
| 牛血清白蛋白 | LIFE TECH | 15260037 | |
| 相机 | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU | |
| DMEM，高糖，GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
| Glutamax 补充剂 | THERMOFISHER | 35050061 | |
| 马血清 | SIGMA | 16050122 | |
| 物镜 | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
| 光源引擎 | LUMENCOR | SPECTRA X | |
| 线性编码电动载物台 | Nikon Instruments | N/A | |
| 显微镜 | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
| 带三通道手动气体混合器和气体鼓泡/湿度模块的显微镜载物台培养箱 | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
| PBS 1x 液体 | THERMOFISHER | 20012068 | |
| 青霉素-链霉素 | SIGMA | 15140122 | |
| 培养皿 100 mm | SIGMA | P5731 | |
| 培养皿 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
| 妊娠大鼠 | CHARLES RIVERS | 3 | |
| Nikon NIS-HC 软件 | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
| Prism 软件 | GraphPad | V8.02 | |
| Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |
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