本方案旨在通过EB3蛋白转染实现微管正端的可视化，以研究其在原代细胞培养中的动态特性。该方案已应用于源自亨廷顿病患者的原代人皮肤成纤维细胞。
方法文章
基于人原代皮肤成纤维细胞的亨廷顿病模型中微管正端动态可视化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
使用荧光标记的目标蛋白与延时视频显微镜相结合进行转染，是研究细胞骨架动态特性的经典方法。本方案提供了一种适用于人类原代成纤维细胞的转染技术，由于原代细胞培养条件的特殊性，此类细胞的转染通常较为困难。此外，为维持细胞骨架的动态特性，需控制较低的转染水平，以获得良好的信噪比，同时避免微管稳定化。必须采取措施保护细胞免受光诱导应激及荧光染料淬灭的影响。在研究过程中，我们测试了多种转染方法、实验方案及不同载体，以筛选出最适合人类原代成纤维细胞研究的最优条件组合。我们对获得的延时视频进行分析，并使用ImageJ计算微管动态参数。不同区域微管正端的动态行为并不相同，因此我们将分析分为若干亚组：中心体区域、成纤维细胞的片状伪足区及尾部区域。值得注意的是，本方案亦可用于 体外 分析患者样本中的细胞骨架动态，推动对各类疾病发展动态的深入理解。
引言
亨廷顿病（Huntington's disease, HD）是一种由编码亨廷顿蛋白（huntingtin protein, HTT）基因突变引起的、目前无法治愈的神经退行性疾病。HTT 主要与囊泡和微管相关，可能参与微管依赖性运输过程1,2。为了研究突变型 HTT 对微管 动态行为的影响，我们采用体外（in vitro ）可视化方法观察 EB3 蛋白，该蛋白通过结合并稳定微管生长的正端来调控微管的动态特性。为将荧光标记的 EB3 导入人皮肤成纤维细胞，采用了质粒转染技术。本研究使用从 HD 患者皮肤活检样本中获得的原代成纤维细胞培养物。
HTT 蛋白基因的突变导致多聚谷氨酰胺链的延长3。HTT 参与多种细胞过程，如内吞作用4、细胞运输1,2、蛋白质降解5等。这些过程的很大一部分涉及细胞骨架的各种组分，包括微管。
人原代细胞是尽可能准确模拟患者细胞内发生事件的最佳模型。要建立此类模型，需要从人体活检组织（例如手术....
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方案
本方案遵循俄罗斯联邦生物医学署下属联邦物理化学医学研究中心于2015年9月8日发布的指南。
注意：图1 概述了本实验方案的流程。
1. 获取人皮肤成纤维细胞的原代培养物（图2）
- 在皮肤活检取得知情同意后，由医生在无菌条件下进行操作，并在数小时内将活检组织置于添加了50 µg/mL青霉素和50 U/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中送至实验室。
注意：皮肤活检必须由医生在患者签署知情同意书后，于无菌条件下进行。 - 将活检组织放入6 cm的培养皿中，并加入少量培养基。
- 使用无菌手术刀将活检样本切成约0.5–1 mm大小的组织块。取1–2个所得组织碎片放入3.5 cm培养皿中，并在组织块上覆盖一片无菌盖玻片。缓慢加入1.5 mL具有如下成分的生长培养基：DMEM、50 U/mL青霉素-链霉素和10%胎牛血清（FBS）。
- 将成纤维细胞在CO2培养箱中培养，培养条件为5% CO2、37 °C、80%湿度的生长培养基环境。
注意：4–7天后，首先角质形成细胞，随后成纤维细....
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结果
使用本方案生成的GFP-EB3动态影像（图1）展示了微管的动态特性。微管参与多种细胞过程，其动态特性影响着来自患者活检组织的原代人类细胞培养物的多种生命特征（图2）。
微管动态不稳定的特性由以下参数决定：微管的生长（聚合）速率和缩短（解聚）速率；发生 catastrophe 的频率（从聚合状态转变为解聚状态）；发生 rescue 的频率（从解聚状态转变为聚合状态）；以及暂停状态——即微管既不聚合也不解聚的状态12。所有这些参数均受到严密调控，单个微管的聚合与解聚速率在相同或不同类型的细胞中均可表现出显著差异13,14,15,16,
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讨论
要获得更高质量的微管动力学分析结果，需要使用高质量的显微图像。进行活细胞延时成像时，必须满足所有必要的观察条件，并正确调整成像参数。使用带有玻璃底的特殊细胞培养皿（共聚焦培养皿）非常重要，因为玻璃与塑料对光的折射率不同。玻璃的厚度及其在整个区域内的均匀性也极为关键，因为这些参数对于样本的正常聚焦至关重要。若这些参数不符合要求，必然导致完美的聚焦系统失效，造成聚焦不良，从而使失焦视频无法用于后续分析（图5A）。活细胞成像的另一个重要条件是防止活性氧（ROS）的损伤。为此可使用多种试剂20。在我们的工作中，采用矿物油，它能将培养基完全与大气隔离，阻止气体交换。同样也可使用可降低ROS的oxyrase酶，但该酶并不适用于所有细胞类型，且更多用于长时间成像实验。
在选择转染后细胞的最佳孵育时间（24 或 48 小时）时，应注意转染细胞的数量。用于分析的细胞数量无需达到表达标记蛋白的最大细胞数，少于该数量亦已足够。应避免蛋白过表达，因为在过表达情况下微管会被稳定化，从而无法分析其动态特.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由俄罗斯联邦科学与高等教育部资助，项目编号 075-15-2019-1669（成纤维细胞转染）；以及由俄罗斯科学基金会资助，项目编号 19-15-00425（成纤维细胞培养相关的其他所有工作） 体外）。本研究部分得到了莫斯科国立大学发展计划PNR5.13（成像与分析）的支持。作者感谢A. N. 贝洛泽尔斯基物理化学生物学研究所尼康卓越中心提供的支持。我们特别感谢Ekaterina Taran在配音方面提供的帮助。作者还感谢Pavel Belikov在视频剪辑方面的协助。手稿中的插图使用BioRender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| 荧光滤光片组 HYQ FITC | Nikon | 替代选择：Leica、Olympus、Zeiss | |
| LUNA-II 自动细胞计数仪 | Logos Biosystems | L40002 | |
| 用于延时成像的显微镜培养箱 | Okolab | 温度控制器 H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| 气体控制器 CO2-O2-UNIT-BL | |||
| 物镜 CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | 替代选择：Leica、Olympus、Zeiss | |
| 宽场荧光倒置显微镜 Eclipse Ti-E | Nikon | 替代选择：Leica、Olympus、Zeiss | |
| 软件 | |||
| Fiji (Image J 版本 2.1.0/1.53c) | 开源图像处理软件 | ||
| NIS Elements | Nikon | 替代选择：Leica、Olympus、Zeiss | |
| 其他试剂 | |||
| 矿物油（轻质白油） | MP | 151694 | |
| 细胞培养皿 | |||
| 细胞培养皿 | SPL Lifesciences | 20035 | |
| 共聚焦培养皿（玻璃厚度 170 µm） | SPL Lifesciences | 211350 | 替代选择：MatTek |
| 锥形离心管 | SPL Lifesciences | 50015 | |
| 冻存管 | Corning-Costar | 430659 | |
| 微量离心管 | Nest | 615001 | |
| 培养 | |||
| Lipofectamine 3000 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| 二甲基亚砜 | PanEko |  135 | |
| DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基） | PanEko | C420 | |
| DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲液） | PanEko | P060 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| 明胶（牛皮来源） | PanEko | 070 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| 青霉素-链霉素 | PanEko | A063 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| 转染 | |||
| 含 EB3-GFP 的质粒 DNA | 由 Dr. A. Akhmanova 授权，Dr. I. Kaverina [范德堡大学，纳什维尔] 惠赠 [伊拉斯姆斯大学，鹿特丹] | Stepanova 等，2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
参考文献
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
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