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基于人原代皮肤成纤维细胞的亨廷顿病模型中微管正端动态可视化

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DOI：

10.3791/62963

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2022年1月8日

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1A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, 4Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案旨在通过EB3蛋白转染实现微管正端的可视化，以研究其在原代细胞培养中的动态特性。该方案已应用于源自亨廷顿病患者的原代人皮肤成纤维细胞。

摘要

使用荧光标记的目标蛋白与延时视频显微镜相结合进行转染，是研究细胞骨架动态特性的经典方法。本方案提供了一种适用于人类原代成纤维细胞的转染技术，由于原代细胞培养条件的特殊性，此类细胞的转染通常较为困难。此外，为维持细胞骨架的动态特性，需控制较低的转染水平，以获得良好的信噪比，同时避免微管稳定化。必须采取措施保护细胞免受光诱导应激及荧光染料淬灭的影响。在研究过程中，我们测试了多种转染方法、实验方案及不同载体，以筛选出最适合人类原代成纤维细胞研究的最优条件组合。我们对获得的延时视频进行分析，并使用ImageJ计算微管动态参数。不同区域微管正端的动态行为并不相同，因此我们将分析分为若干亚组：中心体区域、成纤维细胞的片状伪足区及尾部区域。值得注意的是，本方案亦可用于 体外 分析患者样本中的细胞骨架动态，推动对各类疾病发展动态的深入理解。

引言

亨廷顿病（Huntington's disease, HD）是一种由编码亨廷顿蛋白（huntingtin protein, HTT）基因突变引起的、目前无法治愈的神经退行性疾病。HTT 主要与囊泡和微管相关，可能参与微管依赖性运输过程1,2。为了研究突变型 HTT 对微管 动态行为的影响，我们采用体外（in vitro ）可视化方法观察 EB3 蛋白，该蛋白通过结合并稳定微管生长的正端来调控微管的动态特性。为将荧光标记的 EB3 导入人皮肤成纤维细胞，采用了质粒转染技术。本研究使用从 HD 患者皮肤活检样本中获得的原代成纤维细胞培养物。

HTT 蛋白基因的突变导致多聚谷氨酰胺链的延长3。HTT 参与多种细胞过程，如内吞作用4、细胞运输1,2、蛋白质降解5等。这些过程的很大一部分涉及细胞骨架的各种组分，包括微管。

人原代细胞是尽可能准确模拟患者细胞内发生事件的最佳模型。要建立此类模型，需要从人体活检组织（例如手术样本）中分离细胞。所获得的原代细胞系可用于通过各种遗传学、生物化学、分子生物学和细胞生物学方法研究发病机制。此外，人原代细胞培养物还可作为构建各类转分化和转基因细胞培养体系的前体6。

然而，与永生化细胞系相比，原代细胞的主要缺点是其传代能力有限。因此，我们建议使用早期传代阶段的细胞（最多至第15代）。较老的细胞培养物会迅速退化，失去其独特的特性。因此，新获得的原代细胞应冻存以用于长期保存。

原代细胞培养对培养条件较为敏感，因此通常需要采用特定的方法并对生长条件进行优化。特别是本实验所用的人皮肤原代成纤维细胞对基质要求较高，因此我们根据实验类型的不同使用了多种额外的包被材料（如明胶或纤连蛋白）。

细胞骨架决定了细胞的形态、运动性和迁移能力。在间期和有丝分裂过程中，细胞骨架的动态变化对许多细胞内过程至关重要。特别是由微管蛋白（tubulin）聚合形成的细胞骨架结构，具有高度动态性和极性，能够实现马达蛋白介导的定向细胞内运输。微管末端持续发生重组，其组装阶段与去组装阶段交替进行，这种行为被称为"动态不稳定性"7,8,9。多种相关蛋白可调节聚合反应的平衡，促使反应向聚合物形成或蛋白单体生成的方向进行。微管蛋白亚基的添加主要发生在微管的正端（plus-end）10。末端结合蛋白（end-binding, EB）家族包含三个成员：EB1、EB2 和 EB3。它们作为正端追踪蛋白（+TIPs），通过结合并稳定微管生长中的正端，调控微管的动态特性11。

许多研究采用荧光分子标记的微管蛋白显微注射，或结合延时成像与视频分析的转染方法，在体外可视化微管结构。in vitro。这些方法可能对细胞具有侵入性并造成损伤，尤其是对原代人源细胞。最具挑战性的步骤是确定适合细胞转染的条件。我们尝试在不影响细胞活力和固有细胞形态的前提下，实现尽可能高的转染效率。本研究应用经典方法，探究健康供体与亨廷顿病患者皮肤成纤维细胞中微管动态行为的差异。

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方案

本方案遵循俄罗斯联邦生物医学署下属联邦物理化学医学研究中心于2015年9月8日发布的指南。

注意：图1 概述了本实验方案的流程。

1. 获取人皮肤成纤维细胞的原代培养物（图2）

  1. 在皮肤活检取得知情同意后，由医生在无菌条件下进行操作，并在数小时内将活检组织置于添加了50 µg/mL青霉素和50 U/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中送至实验室。
    注意：皮肤活检必须由医生在患者签署知情同意书后，于无菌条件下进行。
  2. 将活检组织放入6 cm的培养皿中，并加入少量培养基。
  3. 使用无菌手术刀将活检样本切成约0.5–1 mm大小的组织块。取1–2个所得组织碎片放入3.5 cm培养皿中，并在组织块上覆盖一片无菌盖玻片。缓慢加入1.5 mL具有如下成分的生长培养基：DMEM、50 U/mL青霉素-链霉素和10%胎牛血清（FBS）。
  4. 将成纤维细胞在CO2培养箱中培养，培养条件为5% CO2、37 °C、80%湿度的生长培养基环境。
    ​注意：4–7天后，首先角质形成细胞，随后成纤维细胞开始从组织块迁移至培养皿底部。

2. 原代培养物的保存、冷冻与解冻

  1. 从培养皿中取出细胞（参见步骤 3.2-3.4）。
  2. 将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，用 900 µL 预冷的胎牛血清（FBS）重悬细胞沉淀。
  3. 逐滴转移至冻存管中，并加入 100 µL 二甲基亚砜（DMSO）。
  4. 将冻存管置于 -80 °C 超低温冰箱中。24 小时后，将冻存管转移至液氮（−196 °C）中进行长期保存。
  5. 复苏冻存细胞时，从液氮储存罐中取出冻存管，并在 1 分钟内将 1 mL 内容物转移至含有 9 mL 预热至 37 °C 运输培养基的 15 mL 圆锥形离心管中。
  6. 轻轻重悬细胞后，在 200 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，用所需体积的生长培养基重悬细胞沉淀，并接种于所需直径的培养皿中。

3. 细胞培养

  1. 用蒸馏水配制的经高压灭菌的0.1%明胶溶液覆盖培养皿底部。孵育15分钟。
    注意：如需进行转染可视化，应使用玻璃底培养皿（共聚焦培养皿，玻璃厚度为170 µm）。
  2. 配制如下成分的培养基：DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、50 U/mL青霉素-链霉素。充分混匀后置于4 °C保存。使用前将培养基预热至37 °C。
  3. 在显微镜下观察细胞培养状态。吸除培养基，并用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤成纤维细胞。
  4. 向细胞中加入1 mL预热的0.25%胰蛋白酶溶液。在显微镜下观察细胞是否完全从基质上脱离。加入1 mL培养基以终止胰蛋白酶消化作用。
  5. 将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。在200 × g 条件下离心5分钟，弃上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL培养基中。
  6. 计数细胞数量。根据所需接种密度为8–15 × 103/cm2 计算所需细胞数，并将其重悬于2 mL培养基中。
  7. 从培养皿中移除明胶溶液，并立即加入2 mL细胞悬液。将成纤维细胞置于37 °C、CO2 培养箱中培养。
  8. 每2–4天更换一次培养基。
    ​注意：实验中应使用第4–11代的细胞。

4. 转染

  1. 转染前24小时，将培养基更换为新鲜的培养基。
    注意：细胞融合度应为70-80%。
  2. 根据细胞接种面积和密度配制DNA-脂质复合物。使用基于脂质体的转染试剂。
    注意：细胞接种密度为1 × 104 个细胞/cm2。
  3. 取3 µL商品化转染试剂加入125 µL不含抗生素的优化最低必需培养基（Opti-MEM）中，避免接触管壁，轻轻混匀。
  4. 将1 µg质粒DNA（GFP-EB3）加入125 µL Opti-MEM中稀释质粒DNA，轻轻混匀。
    注意：编码GFP-EB3的表达载体11由Vanderbilt大学Nashville分校的I. Kaverina博士惠赠，并获得Erasmus大学Rotterdam分校A. Akhmanova博士的许可11。
  5. 将稀释后的质粒DNA加入已稀释的转染试剂管中（体积比1:1），室温孵育30分钟。
  6. 将DNA-脂质复合物加入含细胞的6 cm培养皿中，以十字形摇动混匀30秒。细胞与转染试剂共孵育24小时后更换为新鲜培养基。分别在转染后24小时和48小时检测转染效率。
    ​注意：转染24小时后转染效率为10-15%，48小时后可达40%。

5. 成像前准备

  1. 在进行细胞活体成像前，将培养基更换为不含pH指示染料的培养基，以减少自发荧光。
  2. 小心地将矿物油涂抹于培养基表面，使其完全覆盖培养基，隔绝外界环境，以减少 O2 渗透和培养基蒸发。
  3. 使用汞灯和高数值孔径的60x或100x油镜物镜拍摄图像。
    注意：对于 体内 观察时，显微镜必须配备孵育箱，以维持细胞所需的培养条件，包括将载物台和物镜加热至 +37 °C，以及具有 CO₂ 控制的密闭腔室2 供应和湿度水平支持。使用双蒸水创造湿度环境。拍摄前检查双蒸水的液位。
  4. 将共聚焦培养皿连同细胞一起放入显微镜载物台中，准备成像。确保培养皿和相机牢固固定在载物台上，以避免成像过程中发生漂移。

6. 设置成像参数

  1. 选择较低的曝光值，因为光照会诱导产生对细胞有害的活性氧（ROS）。
    注意：为了研究人皮肤成纤维细胞中微管的动力学，选择了300 ms的曝光时间。
  2. 聚焦于目标观察对象。
    注意：对于长期的时间序列成像，应使用自动对焦稳定系统以补偿可能在z轴方向发生的位移。
  3. 根据细胞的光敏感性和荧光染料的褪色速率选择最佳成像条件。
    注意：由于微管是高度动态的结构，可选择相对较短的时间间隔，且帧率必须足够高。为研究皮肤成纤维细胞中的微管动力学，我们采用了每秒1帧的频率，持续3-5分钟。
  4. 在选择下一个成像目标时，应远离已成像的区域。由于该区域已受到光照影响，会出现明显的光漂白现象。
    注意：由于使用了相对较高的成像频率，快门在连续成像之间未关闭，光源在整个成像期间持续点亮，因此褪色现象加剧。
  5. 在视觉上分析微管动力学时，应选择最佳的视频，综合考虑转染质量、微管图像质量（最佳信噪比）以及待分析细胞是否存在漂移（图3）。
  6. 使用选定的视频，在ImageJ或Fiji程序中追踪微管正端，以研究其动态行为（图4）。
    注意：定量分析的操作说明请参见补充图2和补充文件1。

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结果

使用本方案生成的GFP-EB3动态影像（图1）展示了微管的动态特性。微管参与多种细胞过程，其动态特性影响着来自患者活检组织的原代人类细胞培养物的多种生命特征（图2）。

微管动态不稳定的特性由以下参数决定：微管的生长（聚合）速率和缩短（解聚）速率；发生 catastrophe 的频率（从聚合状态转变为解聚状态）；发生 rescue 的频率（从解聚状态转变为聚合状态）；以及暂停状态——即微管既不聚合也不解聚的状态12。所有这些参数均受到严密调控，单个微管的聚合与解聚速率在相同或不同类型的细胞中均可表现出显著差异13,14,15,16,

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讨论

要获得更高质量的微管动力学分析结果，需要使用高质量的显微图像。进行活细胞延时成像时，必须满足所有必要的观察条件，并正确调整成像参数。使用带有玻璃底的特殊细胞培养皿（共聚焦培养皿）非常重要，因为玻璃与塑料对光的折射率不同。玻璃的厚度及其在整个区域内的均匀性也极为关键，因为这些参数对于样本的正常聚焦至关重要。若这些参数不符合要求，必然导致完美的聚焦系统失效，造成聚焦不良，从而使失焦视频无法用于后续分析（图5A）。活细胞成像的另一个重要条件是防止活性氧（ROS）的损伤。为此可使用多种试剂20。在我们的工作中，采用矿物油，它能将培养基完全与大气隔离，阻止气体交换。同样也可使用可降低ROS的oxyrase酶，但该酶并不适用于所有细胞类型，且更多用于长时间成像实验。

在选择转染后细胞的最佳孵育时间（24 或 48 小时）时，应注意转染细胞的数量。用于分析的细胞数量无需达到表达标记蛋白的最大细胞数，少于该数量亦已足够。应避免蛋白过表达，因为在过表达情况下微管会被稳定化，从而无法分析其动态特...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由俄罗斯联邦科学与高等教育部资助，项目编号 075-15-2019-1669（成纤维细胞转染）；以及由俄罗斯科学基金会资助，项目编号 19-15-00425（成纤维细胞培养相关的其他所有工作） 体外）。本研究部分得到了莫斯科国立大学发展计划PNR5.13（成像与分析）的支持。作者感谢A. N. 贝洛泽尔斯基物理化学生物学研究所尼康卓越中心提供的支持。我们特别感谢Ekaterina Taran在配音方面提供的帮助。作者还感谢Pavel Belikov在视频剪辑方面的协助。手稿中的插图使用BioRender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
Camera iXon DU897 EMCCDAndor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 REppendorf Corporate
荧光滤光片组 HYQ FITCNikon替代选择：Leica、Olympus、Zeiss
LUNA-II 自动细胞计数仪Logos BiosystemsL40002
用于延时成像的显微镜培养箱Okolab温度控制器 H301-T-UNIT-BL-PLUS
气体控制器 CO2-O2-UNIT-BL
物镜 CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)Nikon替代选择：Leica、Olympus、Zeiss
宽场荧光倒置显微镜 Eclipse Ti-ENikon替代选择：Leica、Olympus、Zeiss
软件
Fiji (Image J 版本 2.1.0/1.53c)开源图像处理软件
NIS ElementsNikon替代选择：Leica、Olympus、Zeiss
其他试剂
矿物油（轻质白油）MP151694
细胞培养皿
细胞培养皿SPL Lifesciences20035
共聚焦培养皿（玻璃厚度 170 µm）SPL Lifesciences211350替代选择：MatTek
锥形离心管SPL Lifesciences50015
冻存管Corning-Costar430659
微量离心管Nest615001
培养
Lipofectamine 3000 转染试剂Thermo Fisher ScientificL3000001
二甲基亚砜PanEkofigure-materials-1135
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）PanEkoC420figure-materials-2
DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲液）PanEkoP060figure-materials-3
胎牛血清（FBS）HycloneK053/SH30071.03
明胶（牛皮来源）PanEkofigure-materials-4070
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050038
Opti-MEM (1x) + GlutamaxGibco519850026
青霉素-链霉素PanEkoA063figure-materials-5
胰蛋白酶-EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific25200072
转染
含 EB3-GFP 的质粒 DNA由 Dr. A. Akhmanova 授权，Dr. I. Kaverina [范德堡大学，纳什维尔] 惠赠
[伊拉斯姆斯大学，鹿特丹]		Stepanova 等，2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003

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