用于肽组学研究的胺类还原甲基化法样品制备与相对定量

摘要

本文介绍了一种基于加热灭活的样品制备方法，用于保护内源性肽段以避免死后降解，随后采用同位素标记结合液相色谱-质谱法（LC-MS）进行相对定量。

摘要

肽组学可定义为对生物样品中肽类进行定性和定量分析。其主要应用包括鉴定疾病或环境胁迫的肽类生物标志物、鉴定神经肽、激素及具有生物活性的细胞内肽类、从蛋白质水解物中发现抗菌肽和营养功能肽，以及用于研究蛋白水解过程。近年来，样品制备、分离方法、质谱技术以及与蛋白质测序相关的计算工具的进步，显著增加了已鉴定肽段的数量和被表征的肽组。肽组学研究通常分析在细胞内天然生成的肽段。本文描述了一种基于热灭活的样品制备方案，该方法可消除蛋白酶活性，并在温和条件下进行提取，从而避免肽键的断裂。此外，还展示了利用胺基还原甲基化进行稳定同位素标记以实现肽段相对定量的方法。该标记方法具有若干优势：试剂 commercially available（商品化）、成本较低、化学性质稳定，并允许在单次液相色谱-质谱（LC-MS）分析中同时检测多达五个样品。

引言

"组学" 科学的特点是对一系列分子（如DNA、RNA、蛋白质、肽、代谢物等）进行深入分析。这些产生的大规模数据集（基因组学、转录组学、蛋白质组学、肽组学、代谢组学等）已彻底改变了生物学，并推动了对生物过程的深入理解¹肽组学（peptidomics）这一术语始于21世纪初^th 世纪，一些作者将其称为蛋白质组学的一个分支²然而，肽组学具有其独特之处，主要关注在细胞过程中天然生成的肽类物质的组成，以及这些分子生物学活性的表征。^3,4.

最初，生物活性肽的研究仅限于通过埃德曼降解法和放射免疫分析法进行的神经肽和激素肽研究。然而，这些技术无法实现全局分析，因为它们依赖于每种肽的高浓度分离、抗体的制备时间，以及存在交叉反应的可能性⁵。

肽组学分析只有在液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）和基因组学项目取得多项进展后才成为可能，这些进展为蛋白质组学/肽组学研究提供了全面的数据资源^6,7此外，需要建立一种针对肽组的特异性肽提取....

方案

以下多肽提取与还原性甲基化的操作步骤改编自先前已发表的方法^24,25,26,27。本方案遵循巴西国家动物实验控制委员会（CONCEA）的指导原则，并已获得圣保罗州立大学生物科学研究所动物使用伦理委员会（CEUA）的批准。方案步骤见图1。

注意：所有水溶液均需使用超纯水配制。

1. 肽段提取

1. 细胞培养
   1. 在37 °C、5% CO₂条件下，将SHSY5Y细胞培养于15 cm培养皿中₂ 在含15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中。
   2. 每个样本使用2-3个培养板。将细胞培养至100%汇合度。
   3. 处理结束后，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。随后加入10 mL磷酸盐缓冲液，刮取细胞并收集至15 mL离心管中。
   4. 以 800 x g 离心 g 5 分钟后去除上清液。将沉淀物重悬于 1 mL 80 °C 的超纯去离子水中。

结果

在质谱仪上运行所获得的结果被存储在原始数据文件中，这些文件可在质谱仪软件中打开。在质谱图中，可以观察到代表标记肽的峰群，其数量取决于所使用的标记方案，标记数通常为2至5个。例如，在图2中，展示了在同一运行中对两个不同样品使用两种同位素标记时，在某一色谱时间点检测到的成对峰。图3展示了在每次液相色谱-质谱（LC-MS）运行中使用3种和4种不同标记时其他可能的阳性结果。当在一次液相色谱/质谱（LC/MS）运行中使用4种或5种标记时，不同标签标记肽的峰可能会发生重叠，需进行校正，以获得各峰的真实强度值（图4）。

同位素标记也可用于显示底物和产物 体外 对于特定的蛋白酶或肽酶，如图所示 图5最后，可以使用不同的软件来鉴定标记的肽段，例如 Peaks Studio 或 MASCOT。这些软件专为蛋白质组学分析而设计，因此其蛋白质定量数据不.......

讨论

在大多数肽组学研究中，一个关键步骤无疑是样品制备，必须谨慎操作以避免死后数分钟内蛋白酶降解产生的肽段片段。早期对非微波处理样品制备的脑组织提取物研究表明，10-kDa 微滤液中存在大量蛋白质片段。已有多种方法被描述用于避免蛋白质降解带来的肽谱干扰：采用聚焦微波辐照法处死动物^6,8、冷冻切片后使用沸水提取缓冲液^31,以及动物处死后使用家用微波炉对组织进行微波辐照^9,26。对于细胞培养物和某些组织，可通过直接加入80 °C的水实现蛋白酶的失活。然而，某些样品（如神经组织）对死后变化更为敏感，微波辐照灭活蛋白酶被认为是一种优选方法。此外，肽提取过程中的另一个重要环节是确保在加入酸之前提取物始终处于冰浴状态，以防止酸不稳定的化学键断裂，例如Asp-Pro键的裂解²⁶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 kDa 截留分子量滤膜	Merck Millipore	UFC801024	Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL 膜, 10 kDa
丙酮	Sigma-Aldrich	179124
乙腈	Sigma-Aldrich	1000291000
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	11213
分析柱（EASY-Column）	EASY-Column	(SC200)	10 cm, 内径75 µm, 3 µm, C18-A2
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
荧光胺	Sigma-Aldrich	F9015
甲醛溶液	Sigma-Aldrich	252549
甲醛-13C, d2, 溶液	Sigma-Aldrich	596388
甲醛-d2 溶液	Sigma-Aldrich	492620
甲酸	Sigma-Aldrich	33015
通风橱	Quimis	Q216
盐酸 - HCl	Sigma-Aldrich	258148
LoBind 蛋白质保留管	Eppendorf	EP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific	LTQ Velos
微波炉	Panasonic	NN-ST67HSRU
n Easy-nLC II 纳米液相色谱仪	Thermo Fisher Scientific	LC140
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions Inc.	VERSION 8.5
磷酸盐缓冲液	Invitrogen	3002	片剂
预柱（EASY-Column）	Thermo Fisher Scientific	(SC001)	2 cm, 内径100 µm, 5 µm, C18-A1
冷冻离心机	Hermle	Z326K	用于锥形管
冷冻离心机	Vision	VS15000CFNII	用于微量管
反相净化柱  （Oasis HLB 1 cc 小柱）	Waters	186000383	Oasis HLB 1 cc 小柱
氰基硼氘化钠 - NaBD3CN	Sigma-Aldrich	190020
氰基硼氢化钠 - NaBH3CN	Sigma-Aldrich	156159
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S9763	注：0.2 M PB = 0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 6.8（26.85 mL 1M Na2HPO3）加 0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 6.8（23.15 mL 1M NaH2PO3）定容至 250 mL 水
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	S3139
超声波破碎仪	Qsonica	Q55-110
标准肽段	Proteimax		氨基酸序列：LTLRTKL
三乙基铵缓冲液 - TEAB 1 M	Sigma-Aldrich	T7408
三氟乙酸 - TFA	Sigma-Aldrich	T6508
超纯水	Milli-Q	Direct-Q 3UV
真空离心浓缩仪	GeneVac	MiVac DNA 浓缩仪
水浴锅	Cientec	266
Xcalibur 软件	ThermoFisher Scientific	OPTON-30965