使用胺还原甲基化进行样品制备和相对定量，用于肽学研究

Summary

本文介绍了一种基于热灭活的样品制备方法，以保存内源性肽，避免死后降解，然后使用同位素标记和LC-MS进行相对定量。

Abstract

肽学可以定义为生物样品中肽的定性和定量分析。其主要应用包括鉴定疾病或环境应激的肽生物标志物，鉴定神经肽，激素和生物活性细胞内肽，从蛋白质水解物中发现抗菌和营养保健肽，并可用于研究以了解蛋白水解过程。最近在样品制备，分离方法，质谱技术和与蛋白质测序相关的计算工具方面的进步有助于增加已鉴定的肽数量和所表征的肽。肽研究经常分析细胞中自然产生的肽。这里描述了一种基于热灭活的样品制备方案，其消除了蛋白酶活性，并且在温和的条件下提取，因此没有肽键裂解。此外，还显示了通过胺的还原甲基化使用稳定同位素标记的肽的相对定量。这种标记方法具有一些优点，因为试剂是市售的，与其他试剂相比价格低廉，化学稳定，并且允许在单次LC-MS运行中分析多达五个样品。

Introduction

"组学"科学的特点是对分子集进行深入分析，例如DNA，RNA，蛋白质，肽，代谢物等。这些生成的大规模数据集（基因组学、转录组学、蛋白质组学、肽学、代谢组学等）彻底改变了生物学，并导致了对生物过程的高级理解¹。肽学一词在20^世纪初 开始引入，一些作者将其称为蛋白质组学的一个分支²。然而，肽学具有独特的特殊性，其主要兴趣是研究细胞过程中自然产生的肽含量，以及这些分子的生物活性的表征^3，4。

最初，生物活性肽研究仅限于通过Edman降解和放射免疫测定的神经肽和激素肽。然而，这些技术不允许进行全局分析，这取决于高浓度中每种肽的分离，抗体产生的时间，以及交叉反应性的可能性⁵。

只有在液相色谱耦合质谱（LC-MS）和基因组项目取得多项进展后，肽学分析才成为可能，这些项目为蛋白质组学/肽学研究提供了全面的数据池^6，7。此外，需要建立针对肽酶的特定肽提取方案，因为第一批分析大脑样本中全球神经肽的研究表明，检测受到蛋白质大规模降解的影响，蛋白质....

Protocol

以下肽提取和还原甲基化程序改编自先前发表的程序^{24，25，26，27}。该协议遵循国家动物实验控制委员会（CONCEA）的指导方针，并得到圣保罗州立大学生物科学研究所动物使用伦理委员会（CEUA）的批准。协议步骤如图 1 所示。

注意:在超纯水中准备所有水溶液。

1. 肽提取

1. 细胞培养
   1. 在含有15%胎牛血清和1%青霉素的Dulbecco改性Eagle培养基中，在37°C下在5%CO ₂ 下培养SHSY5Y细胞。
   2. 每个样品使用2-3个板。将细胞培养至100%汇合。
   3. 预定处理后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次。接下来，加入10mL磷酸盐缓冲盐水，刮擦细胞并收集到15mL管中。
   4. 以800× g 离心5分钟，除去上清液。将沉淀重悬于1mL超纯化去离子水中，温度为80°C。
   5. 将管的内容物（细胞裂解物）转移到2mL微量离心管中。<....

Results

从质谱仪上进行的运行中获得的结果存储在原始数据文件中，可以在质谱仪软件中打开。在MS光谱中，可以根据所使用的标记方案观察代表标记肽的峰组，范围从2-5个标记。例如，在 图2中，在色谱时间内检测到的峰对在实验中表示，其中在同一次运行中，在两个不同的样品中仅使用了两个同位素标记。 图3 显示了在每次LC-MS运行中使用3个和4个不同标签的阳性结果的其他可能性。当在LC / MS运行中使用4或5个标记时，标记肽的峰可能与需要校正以获得每个峰的真实强度值的不同标记重叠（图4）。

同位素标记也可用于 在体外 显示给定蛋白酶或肽酶的底物和产物，如图 5所示。最后，可以使用不同的软件来识别标记的肽，例如Peaks Studio或MASCOT。这些软件应用程序是为蛋白质组学分析而创建的;因此，不应将蛋白质定量数据用于肽分析，并且必须检查在可靠性.......

Discussion

在大多数肽学研究中，毫无疑问，关键步骤之一是应仔细进行的样品制备，以避免在死后几分钟后存在蛋白酶产生的肽片段。对从非微波样品制备的脑提取物的初步研究表明，10 kDa微滤液中存在大量的蛋白质片段。已经描述了避免蛋白质降解肽光谱的不同方法:聚焦微波照射动物牺牲^6，8，冷冻器解剖，然后煮沸提取缓冲液^31， 以及使用家用型微波炉对组织进行牺牲后微波照射^9，26.对于细胞培养和某些组织，蛋白酶灭活可以通过在80°C下加水直接完成。 然而，一些样品，如神经组织，可能对死后的变化更敏感，并且通过微波照射使蛋白酶失活已被证明是一种选择方法。此外，肽提取过程中的另一个重要点是确保提取物在添加酸之前是冰冷的，以防止酸不稳定键断裂，如Asp-Pro键的分裂²⁶。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa 截止滤光片	Merck Millipore	UFC801024	Amicon Ultra-4、PLGC Ultracel-PL 膜、10 kDa
丙酮	Sigma-Aldrich	179124
乙腈	Sigma-Aldrich	1000291000
氢铵	Sigma-Aldrich	11213
分析柱（EASY色谱柱）	EASY-色谱柱	（SC200）	10 厘米，ID75 和微型;m、3 和微;m， C18-A2
-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
萤	Sigma-Aldrich	F9015
甲醛溶液	Sigma-Aldrich	252549
甲醛-13C， d2， 溶液	Sigma-Aldrich	596388
甲醛-d2解决方案	Sigma-Aldrich	492620
甲酸	Sigma-Aldrich	33015
通风橱	Quimis	Q216
盐酸 - HCl	Sigma-Aldrich	258148
LoBind-蛋白质保留管	Eppendorf	EP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific	LTQ Velos
微波炉	Panasonic	NN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLC	Thermo Fisher Scientific	LC140
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions Inc.	版本 8.5
磷酸盐缓冲盐水	Invitrogen	3002	片剂
前柱（EASY-Column）	Thermo Fisher Scientific	（SC001）	2 cm，ID100 µm、5 和微型;m， C18-A1
冷冻离心机	Hermle	Z326K	用于锥形管
冷冻离心机	Vision	VS15000CFNII	用于微管
反相净化柱  （Oasis HLB 1 cc 小柱）	Waters	186000383	Oasis HLB 1 cc 小柱
氰基氢化钠 - NaBD3CN	Sigma-Aldrich	190020
氰基硼氢化钠 - NaBH3CN	Sigma-Aldrich	156159
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S9763	注：0.2 M PB= 0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 6.8（26.85 mL Na2HPO3 1M）加上 0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 6.8（23.15 mL NaH2PO3 1M）至 250 ml 水
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	S3139
超声仪	Qsonica	Q55-110
标准肽	Proteimax		氨基酸序列： LTLRTKL
三乙基铵缓冲液 - TEAB 1 M	Sigma-Aldrich	T7408
三氟乙酸 - TFA	Sigma-Aldrich	T6508
超纯水	Milli-Q	Direct-Q 3UV
真空离心机	GeneVac	MiVac DNA 浓缩仪
水浴	Cientec	266
Xcalibur软件	ThermoFisher Scientific	OPTON-30965