软件辅助的骨关节炎软骨下骨厚度定量测量

摘要

本方法学文章介绍了一种软件辅助的定量测量方案，用于量化小鼠骨关节炎膝关节及作为对照的正常膝关节中组织学上的软骨下骨厚度。该方案对细微增厚具有高度敏感性，适用于检测早期骨关节炎相关的软骨下骨改变。

摘要

软骨下骨增厚和硬化是骨关节炎（OA）在动物模型和人类中的主要特征。目前，组织学上软骨下骨增厚的严重程度主要依赖于基于半定量评分系统的视觉估测。本文介绍了一种可重复且易于操作的实验方案，用于定量测量内侧半月板失稳（DMM）诱导的小鼠膝关节OA模型中的软骨下骨厚度。该方案利用ImageJ软件，在定义股骨内侧髁和胫骨内侧平台这一DMM诱导膝关节OA中常见软骨下骨增厚的感兴趣区域后，对组织学图像上的软骨下骨厚度进行量化分析。以假手术组小鼠膝关节的组织学图像作为对照。统计学分析表明，新建立的定量软骨下骨测量系统具有高度可重复性，且观察者内和观察者间的变异率较低。结果提示，与广泛使用的视觉评分系统相比，该新方案对轻微或轻度的软骨下骨增厚更为敏感。本方案适用于检测早期及进展期骨关节炎相关的软骨下骨改变，并可用于评估 体内 OA 治疗疗效与 OA 软骨分级相结合的评估

引言

骨关节炎（OA）是最常见的关节炎类型，其放射学特征表现为由于关节软骨丢失、骨赘形成以及软骨下骨（SCB）硬化所导致的关节间隙变窄^1,2。尽管关节周围骨组织在OA病因学中的作用尚未完全明确，但通常认为骨赘形成和软骨下骨硬化是疾病进程的结果而非致病因素；然而，关节周围骨结构/形态及生物学特性的改变可能参与了OA的发生与发展^3,4。建立一种准确且易于执行的OA分级系统，包括对软骨下骨的测量，对于不同研究实验室之间的比较研究以及评估旨在预防或减缓OA进展的治疗药物疗效至关重要。

软骨下骨（SCB）由一层薄的穹顶状骨板和其下方的松质骨层构成。SCB骨板即为皮质骨板，位于钙化软骨下方并与之平行。动脉和静脉的小分支以及神经穿过SCB骨板中的通道，在钙化软骨与松质骨之间进行沟通。软骨下松质骨含有血管、感觉神经和骨髓，比SCB骨板更具孔隙性且代谢更为活跃。因此，SCB具有缓冲震荡和支持作用，同时在正常关节中对软骨的营养供应和代谢也具有重要意义^5,6,7,8。

在组织学中，软骨下骨（SCB）增厚和在放射学中的硬化是骨关节炎（OA）的主要特征，也是OA病理生理学研究的关键领域。测量SCB增厚是评估OA严重程度的组织学方法中的重要组成部分。既往已有报道采用数字显微放射技术测量啮齿类动物SCB的矿化密度⁹，以及基于显微计算机断层扫描（micro-CT）对OA啮齿类动物模型中SCB进行定量测量的方法^10,11,12,13，这些技术加深了我们对SCB结构及其在OA病理生理过程中作用的理解。此外，已有研究利用配备专用且昂贵的骨组织形态计量学软件的复杂计算机系统，通过组织学切片对SCB面积和厚度进行量化¹⁴。然而，目前基于视觉估计的半定量OA分级系统（包括SCB增厚分级）仍比micro-CT更为广泛使用，因为这些分级系统操作简便，尤其适用于大量组织学图像的筛查。但大多数现有的OA分级系统主要关注软骨的改变^15,16,17。一种广泛使用的骨关节炎SCB厚度分级方法将SCB增厚分为轻度、中度和重度，但该方法在很大程度上依赖主观判断，其可靠性尚未得到充分验证¹⁵。目前尚缺乏完善或标准化的、可可靠执行的骨关节炎SCB厚度测量操作步骤方案。

本研究旨在建立一种可重复、灵敏且易于操作的定量测量骨关节炎（OA）小鼠模型中软骨下骨（SCB）厚度的实验方案。通过严格的测量测试和统计学分析，我们证实了这种基于ImageJ软件辅助的定量测量方法能够对正常和骨关节炎膝关节中的SCB厚度进行量化。新建立的方案具有良好的可重复性，并且对轻微的SCB改变比广泛使用的视觉评分系统更为敏感。该方法可用于早期骨关节炎SCB变化的检测以及相关干预效果的评估 体内 OA 治疗疗效与 OA 软骨分级相结合的评估

方案

本方案中包含的所有动物实验程序均经堪萨斯大学医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，符合所有联邦和州的法律与法规要求。

1. 小鼠膝骨关节炎的建立

1. 通过手术切断内侧半月板（DMM）以建立小鼠膝骨关节炎模型，方法参照Glasson等人的描述。¹⁸ 在22只10至11周龄的野生型BALB/c小鼠中进行实验。另选取相同遗传背景和年龄的8只小鼠进行假手术作为对照。
   注意：本研究的原始项目使用了两种性别的实验对象，以满足美国国立卫生研究院（NIH）关于将性别作为生物变量加以考虑的要求，但本方案并不涉及对性别差异的考察。
2. 通过吸入异氟烷对动物进行麻醉。通过监测其呼吸频率/呼吸力度以及对脚趾/尾部夹捏无反应来检查麻醉深度。将动物置于仰卧位。
3. 剃除膝关节区域的毛发，使用聚维酮碘-酒精皮肤擦洗剂清洁皮肤，重复交替进行三次。
4. 在手术显微镜下对右膝进行DMM手术。通过内侧髌旁切口（长1.2–1.5 cm）暴露膝关节，并切开关节囊。保持髌骨和髌腱完整。仔细暴露将内侧半月板固定于胫骨平台的内侧半月板胫骨韧带（MML）后，使用显微外科剪将其横断，以使内侧半月板失稳。
5. 在右膝进行假手术作为对照操作，其中仅暴露内侧半月板韧带（MML）但不予以切断。
6. 使用8-0可吸收聚乳酸羟基乙酸缝线缝合关节囊，使用7-0不可吸收缝线缝合皮肤切口，DMM组和假手术组均采用此方法，以确保愈合后膝关节功能正常。
7. 术前立即皮下注射缓释型丁丙诺啡（SR Buprenorphine，0.20–0.5 mg/kg）以提供镇痛，单次给药可维持镇痛效果长达72小时。术后密切监测动物状态。
8. 使用 CO₂ 术后2、8和16周处死动物。动物失去意识后，通过物理方法（打开胸腔）确认死亡。这些安乐死方法符合美国兽医医学协会（AVMA）安乐死专家组的建议。
9. 在DMM手术后2、8和16周以及假手术后2和16周采集膝关节，用于组织学分析，以获得具有不同程度骨关节炎严重性或软骨下骨增厚的小鼠膝关节。

2. 组织切片与组织学图像的制备

1. 用2%多聚甲醛固定小鼠膝关节组织样本，25%甲酸脱钙，石蜡包埋，并进行冠状面切片，以观察内侧和外侧间室。
2. 使用切片机从膝关节后侧切割膝关节标本，以70–80 µm的间隔收集厚度为5 µm的组织切片，共获得约40张跨越整个膝关节的组织切片。根据微米尺辅助估算，第1–6号切片来自膝关节最远后部，第11–18号来自中后部，第23–30号来自中前部，第35–40号来自最远前部。中间的切片可弃去或另行收集用于其他染色。
3. 按照制造商说明书，每五张切片进行一次Safranin-O和快绿染色，以特异性识别软骨细胞和基质。按照制造商说明书进行苏木精-伊红染色，以在细胞和组织水平上观察膝关节，方法如先前所述^19,20,21,22。
4. 使用配备数字相机的显微镜采集组织学图像。组织病理学的一般分析及骨关节炎组织学分级按先前所述方法进行^{15,19,20,21,22}。

3. 使用 ImageJ 软件对骨关节炎软骨下骨进行定量测量

1. 下载 ImageJ 软件并打开感兴趣的组织学图像。
   1. 从 https://imagej.nih.gov/ij/ 下载捆绑 Java 1.8.0_172 的 ImageJ。
   2. 打开 ImageJ 程序。点击功能区上的 文件 选项卡，然后点击 打开 选项以打开组织学图像。
   3. 找到文件目录地址，选择图片文件，然后点击 打开。
2. 使用组织学图像上的显微测微尺对 ImageJ 进行校准。
   1. 使用直线工具在显微测微尺上绘制一个单位长度，然后点击 分析>（然后）设置标尺。将 已知距离 和 像素纵横比 设置为 1，然后点击 确定。ImageJ 可将像素长度转换为显微测微尺上的单位长度。
   2. 将测量因子设置为面积。点击 分析> 设置测量，并在新窗口中勾选 面积 和 限制于阈值 选项。此步骤将 ImageJ 设置为在选定的 "阈值" 范围内测量 "面积" 参数。
3. 测量感兴趣区域的全部软骨下骨（SCB）面积。
   1. 将 SCB 感兴趣区域（ROI）定义为 图 1A 中橙色框所示区域，该区域覆盖股骨内侧髁（MFC）和胫骨内侧平台（MTP）中 SCB 皮质板及其下方邻近皮质板的一部分小梁骨，每个 ROI 具有特定尺寸。骨关节炎相关的 SCB 增厚通常发生于这些区域。为确保所有动物的特定 ROI 测量尺寸一致，应在所有被检关节的每个 MFC 或 MTP 中以相同形状和尺寸定义 SCB ROI。
   2. 使用 ImageJ 主窗口中的多边形选择工具勾勒出整个 SCB 感兴趣区域的轮廓。
      注：选择工具为系统提供一个阈值，以限制测量区域。
   3. 测量总 SCB 面积：选定阈值后，点击 分析> 测量。将弹出一个显示面积测量结果的 "结果" 窗口。
4. 测量不含骨髓的实骨部分面积。
   1. 点击 编辑> 清除外侧，以排除总 SCB 区域以外的部分。
      注：点击 清除外侧 选项后，仅总 SCB 区域可见，该区域外的图像将变为黑色。此步骤使观察者能够专注于感兴趣区域内的实骨部分。
   2. 点击 图像> 调整> 颜色阈值，打开 "颜色阈值" 窗口。在 "颜色阈值" 窗口底部点击 原始，将图像恢复至原始状态。使用第 3.3.2 步中的选择工具在实骨区域绘制一个小框。在 "颜色阈值" 窗口底部点击 取样 选项，以定义实骨区域。
      注："颜色阈值" 窗口中的 "取样" 选项允许 ImageJ 在整个 SCB 区域中选取与实骨样本区域相同的全部像素。所选的实骨区域将变为红色。
   3. 在颜色阈值平衡窗口底部点击 选择，以创建面积测量的阈值。在 ImageJ 主菜单中点击 分析> 测量，实骨面积的测量结果将显示在 "结果" 窗口中。
   4. 保存总 SCB 面积和实骨面积的数据。
5. 计算实骨面积（mm²）与总 SCB 面积（mm²）的比值，该比值代表在总 SCB 面积内实骨的厚度（mm²/1.0 mm²）。
6. 测量 DMM 诱导的骨关节炎远后侧、中后侧、中前侧和远前侧区域（如步骤 2.2 所述）组织切片/图像的 SCB 厚度（如步骤 3.1–3.5 所述），以评估 6 个膝关节的区域特异性 SCB 厚度（图 1B）。
   ​注：此操作可验证该定量测量方案的可靠性，因为已知骨关节炎相关的 SCB 改变与软骨病变共定位，且在啮齿类动物膝关节的负重区域（中段）中，伴有 SCB 增厚的骨关节炎性软骨损伤更为严重^14,15。因此，使用中段切片进行骨关节炎性 SCB 增厚的定量测量是合理的。

4. 统计学

1. 使用定量测量和SCB厚度视觉分级的数据进行统计分析。通过Pearson相关系数分析确定观察者间和观察者内变异性和可重复性。
2. 采用Student t-检验或单因素方差分析（ANOVA），随后使用电子表格软件进行事后检验（Tukey），以确定研究组间差异的显著性。将p值小于0.05视为具有统计学显著性。

结果

视觉估算法与ImageJ辅助定量测量的可重复性比较：
对24个膝关节/动物每个膝关节的中段选取感兴趣区域（ROI），共48个区域（24个内侧股骨髁，MFC，和24个内侧胫骨平台，MTP），由三位独立观察者根据文献中已有的0-3级视觉评分系统^15,23进行评分，其中0分表示正常（无软骨下骨增厚），1分为轻度，2分为中度，3分为重度软骨下骨增厚。这些图像选自DMM或假手术后三个不同的术后时间点：2周、8周和16周。通常情况下，接受DMM手术的小鼠在术后2周时视觉评分为0分，8周时为1-2分，16周时为2-3分。随后，由另外三位独立观察者使用ImageJ软件对这些组织学图像的软骨下骨厚度进行定量测量，以验证新评分系统的可重复性和敏感性。图2展示了MFC和MTP区域用于视觉评分或定量测量的代表性组织学图像，部分图像标出了ROI。所分析的图像分为三组：假手术膝关节（视觉评分0分）、DMM膝关节（视觉评分0分）和DMM膝关节（视觉评...

讨论

测量软骨下骨（SCB）增厚是评估骨关节炎（OA）严重程度组织学评价中的重要组成部分。现有的大多数OA分级系统主要关注软骨的改变^15,16,17。一种广泛使用的小鼠骨关节炎SCB厚度分级方法将SCB增厚分为轻度、中度和重度，但该方法在很大程度上依赖主观判断，其可靠性尚未得到充分验证¹⁵。本研究开发并验证了一种新的SCB厚度定量测量方案，包括以下步骤：在小鼠中建立膝关节OA模型、制备组织切片和组织学图像、使用ImageJ软件对骨关节炎软骨下骨进行定量测量，以及通过统计分析验证该方案的敏感性和可重复性。

尽管本实验方案的总体技术遵循 ImageJ 软件的操作说明，但我们已补充了详细的分步技术内容，以便新用户更容易理解和验证其可重复性。BoneJ 程序是 ImageJ 软件的一个插件，适用于测量黑白二维图像，但在排除骨髓区域以计算骶骨板（SCB）总面积时效果...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
番红O	Sigma-Aldrich	S8884
快绿	Sigma-Aldrich	F7252
苏木精	Sigma-Aldrich	GHS216
伊红	Sigma-Aldrich	E4382
插图绘制者	Adobe	不适用