本文介绍了利用单分子成像技术——DNA幕帘法，研究EWS-FLI1凝聚物在DNA上组装的生物物理机制。
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方法文章
单分子成像观察EWS-FLI1凝聚体在DNA上的组装
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
染色体易位产生的融合基因已在多种实体瘤或白血病中被发现。EWS-FLI1 属于 FUS/EWS/TAF15（FET）家族的融合癌蛋白，是尤文肉瘤中最常涉及的融合基因之一。这些 FET 家族融合蛋白通常在其 N 末端含有 FET 蛋白的低复杂性结构域（LCD），在 C 末端含有 DNA 结合结构域（DBD）。已证实 EWS-FLI1 可通过 LCD-LCD 和 LCD-DBD 相互作用，在其靶向结合位点形成生物分子凝聚体，这些凝聚体能够招募 RNA 聚合酶 II 以增强基因转录。然而，这些凝聚体如何在其结合位点组装仍不清楚。最近，一种单分子生物物理方法——DNA 幕帘技术（DNA Curtains）被用于可视化 EWS-FLI1 凝聚体的组装过程。本文讨论了应用 DNA 幕帘技术研究生物分子凝聚体在靶 DNA 上组装的详细实验方案及数据分析方法。
引言
转录调控是活细胞中实现基因精确表达的关键步骤。染色体修饰、转录因子（TFs）和非编码RNA等多种因素参与了这一复杂过程。1,2,3在这些因素中，转录因子通过识别并结合被称为启动子或增强子的特定DNA序列，进而招募其他功能蛋白以激活或抑制转录，从而赋予转录调控以特异性。4,5,6,7这些转录因子如何在人类基因组中搜寻其靶位点，并与包裹在组蛋白及非组蛋白DNA结合蛋白上的DNA相互作用，几十年来一直困扰着科学家。在过去几年中，已建立了多个经典的转录因子靶向搜寻机制模型，用以描述它们如何 "载玻片" "啤酒花" "跳跃" 或 "节段间转移" 沿着DNA链8,9,10,11这些模型主要....
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方案
1. 脂质双层母液的制备
- 用双蒸水（ddH2O）和99%乙醇冲洗玻璃小瓶，并在60 °C的干燥烘箱中干燥。
- 通过将1 g 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷胆碱（DOPC）、100 mg 聚乙二醇修饰脂质（18:1 的 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（PEG2000 DOPE））和25 mg 生物素化脂质（18:1 的 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-（帽生物素）（钠盐）（Biotinyl Cap DOPE））溶解于10 mL 氯仿中，配制脂质母液。
- 按每瓶1 mL将脂质母液分装至洁净玻璃小瓶中，并于-20 °C保存。
注意：溶解后的脂质应保存在玻璃小瓶中，储存时瓶盖需用封口膜包裹。
2. 脂质体溶液的制备
- 用 ddH2O 和 99% 乙醇冲洗一个 2 mL 玻璃小瓶，并在 60 °C 的干燥烘箱中彻底干燥。
- 用氯仿冲洗一个 250 µL 玻璃注射器，然后将 200 µL 脂质母液转移至干燥的玻璃小瓶中。
- 使用氮气喷枪轻轻吹入 N2，同时将小瓶朝一个方向持续旋转。
注意：N2 有助于蒸发氯仿，残留的脂质将在玻璃小瓶内壁形成一层薄膜。初始时....
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结果
DNA Curtains 示意图如图所示 图1A, 图1B，以及 图1D含有25个连续GGAA重复的克隆目标序列位于 NORB1 尤因肉瘤中启动子的关键靶序列对于EWS-FLI1的招募至关重要28通过561 nm激光检测mCherry标记的EWS-FLI1信号来观察EWS-FLI1分子图1C 和 图1E）。在完成DNA Curtains实验的设置后， 体外 在DNA底物的25× GGAA位点处，EWS-FLI1生物分子凝聚物的形成可被直接可视化（图1B-E）。通过凝胶电泳迁移率实验，使用含25个GGAA重复序列和不含GGAA的DNA模.......
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讨论
由于单分子方法对反应体系的组分极为敏感，在DNA Curtains实验过程中，必须投入额外努力以确保所有材料和溶液的质量，特别是第1和第2节中制备的脂质以及第5节中使用的缓冲液。缓冲液必须使用更高纯度的试剂配制，并且必须为单分子实验新鲜配制。
当将500 nM的mCherry标记的EWS-FLI1冲洗入样品室时，在含有25× GGAA序列的Lambda DNA上出现了多个品红色斑点。请注意，即使在用空白缓冲液清洗10分钟后，整个DNA上仍存在连续的非特异性品红色信号分布（图1B，C）。有趣的是，在无缓冲液流动条件下孵育10分钟后，EWS-FLI1分子在DNA上发生重排，并聚集形成数个斑点（图1D，E）。其中一个斑点形成于克隆的25× GGAA位点处，而其余所有斑点均形成于含有高密度连续GGAA基序的区域。该现象强烈表明，无流动孵育过程可使EWS-FLI1分子更快速地在DNA上搜寻靶位点并组装成复合.......
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致谢
本工作得到国家自然科学基金项目 No. 31670762（Z.Q.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 488 nm 半导体泵浦固体激光器 | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm 半导体泵浦固体激光器 | Coherent | OBIS561LS | |
| 琼脂 | Rhawn | R003215-50g | |
| 生物素标记的 DOPE | Avanti | 870273P | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7030 | |
| 氯仿 | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | 导电保护涂层 |
| 牛脱氧核糖核酸酶 I | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| 玻璃盖玻片 | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| λ DNA | NEB | N3013S | |
| λ 噬菌体包装提取物 | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| 尼康倒置显微镜 | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM 肉汤 | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, 乙基乳酸酯 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, 苯甲醚 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B 科学级 CMOS 相机 | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| 蛋白酶 K | NEB | P8107S | |
| 石英玻璃载玻片 | G.Finkenbeiner | ||
| 六通进样阀 | Idex | MXP9900-000 | |
| 链霉亲和素 | Thermo | S888 | 用 ddH2O 稀释 |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA 连接酶 | NEB | M0202S | |
| Tris 碱 | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 碘化物 (491/509) | Invitrogen | Y3601 | 用 DMSO 稀释 |
参考文献
- Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histon....
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重印与许可
