利用血流增强型超声实现眼部深层血管成像

摘要

我们介绍一种无需使用造影剂的非侵入性超声技术，用于生成眼部的三维血管造影。

摘要

眼内的视网膜是人体中能量需求最高的组织之一，因此需要丰富的血液供应以实现高效的氧气输送。脉络膜的毛细血管层位于视网膜的外表面，是大多数脊椎动物视网膜氧气供应的主要来源。然而，由于该血管床位于高度吸光的视网膜后方，使用传统的光学技术对其进行成像十分困难。本文介绍了一种高频超声技术，结合后续的血流增强方法，可对眼部深层血管床（0.5–3 cm）进行高时空分辨率成像。这种非侵入性方法在具有有核红细胞的物种（非哺乳动物及胎儿动物模型）中效果良好。该技术能够在无需使用造影剂的情况下生成非侵入性的三维血管造影图像，且不受血流角度影响，其灵敏度高于基于多普勒的超声成像技术。

引言

脊椎动物视网膜的高代谢率在两个相互矛盾的需求之间形成了一种内在的权衡：一方面需要高血流量，另一方面又需要一条无血管的透光路径。为了避免灌注红细胞对视觉造成干扰，所有脊椎动物的视网膜均通过位于感光细胞后方的一层毛细血管网——脉络膜毛细血管层（choriocapillaris）^1,2,3——获取氧气和营养物质。然而，这种单一的营养和氧气来源对视网膜厚度造成了扩散限制^4,5，因此许多视觉活跃的物种演化出多种复杂的血管网络，以向这一代谢活跃的器官提供额外的血液供应⁶。这些血管床包括哺乳动物和某些鱼类中灌注视网膜内层的血管^4,7,8,9,10，存在于多种鱼类、爬行动物和鸟类视网膜内侧（即面向光线的一侧）的血管^4,11,12,13，以及鱼类脉络膜中具有逆流交换结构的血管系统——脉络膜rete mirabile，该结构能够产生高于大气压的氧分压^{14,15,16,17,18,19,20}。尽管这些额外的非脉络膜途径在满足优异视觉所需的代谢需求方面发挥着关键作用⁴，但这些血管结构的三维解剖构型仍知之甚少，限制了我们对脊椎动物眼球形态演化的理解。

传统上，视网膜的血液供应主要通过光学技术进行研究，例如眼底检眼镜检查。这类技术能够以高分辨率无创、高效地获取非脉络膜血管解剖结构的信息²¹，因此广泛应用于临床中对视网膜血管结构异常的诊断²²。然而，视网膜色素上皮层会吸收透射光，限制了这些光学技术的观察深度，导致在不使用对比剂的情况下，难以获取有关脉络膜结构与功能的充分信息²¹。光学相干断层扫描（OCT）也存在类似的深度限制。该技术虽能利用光波生成高分辨率的眼底血管造影图像，但以牺牲穿透深度为代价²³；而增强深度成像OCT虽可显示脉络膜，却会降低视网膜成像的质量²⁴。磁共振成像克服了检眼镜和OCT的光学局限性，能够绘制视网膜血管层，但分辨率较低²⁵。组织学和显微计算机断层扫描（µCT）虽保持了光学技术的高分辨率，并可提供整个眼球血管形态的信息⁴，但两者均需获取眼部样本，因此无法在临床实践中应用，也不适用于稀有或濒危物种。为了克服上述现有视网膜成像技术的部分局限，本研究提出一种针对麻醉动物的超声成像方案，通过应用此前在胚胎和心血管成像^26,27,28以及OCT血管造影²⁹中描述的类似技术，对覆盖整个眼球的一系列等间距二维超声扫描图像进行in silico血流运动映射。该方法能够在不使用对比剂的情况下，实现无创的三维深层眼部血管造影，为跨物种研究眼内血流分布开辟了新的途径。

方案

以下方案已获得丹麦食品、农业和渔业部下属的丹麦动物实验监察局（丹麦兽医和食品管理局）的许可（许可证号 2016-15-0201-00835）。

1. 麻醉与超声耦合介质

1. 对实验动物进行麻醉。
   注意：合适的麻醉剂类型和剂量高度依赖于物种。通常，浸入式麻醉剂如 MS-222（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）、苯佐卡因（对氨基苯甲酸乙酯）和丙泊酚（2,6-二异丙基苯酚）适用于鱼类和两栖类，这些动物可通过鳃或皮肤快速吸收麻醉剂（例如，在虹鳟中使用 0.05 mg·L^-1 苯佐卡因）。对于羊膜动物，可选择多种可通过静脉、肌肉或腹腔注射的溶解性化合物，也可使用气体麻醉剂。肌肉注射阿法沙龙对爬行动物有效（例如，在蜥蜴中使用 30 mg·kg^-1），而气体异氟烷对鸟类有效（例如，鸽子使用 2% 异氟烷与空气混合）。有关跨物种可用麻醉剂的全面概述，请参考已发表的文献^30,31,32。
2. 检测动物的反射以确认达到理想的麻醉深度。确保动物在操作过程中完全静止，因为血流增强型超声技术对运动噪声非常敏感。
   1. 麻醉过深可能改变血流模式，因此在实验启动阶段应进行剂量滴定。
   2. 逐步增加麻醉剂量，并借助简单的亮度模式（B 模式）超声观察眼部血流情况。
      注意：当动物除呼吸外完全静止且眼内血流清晰可见时，即达到理想的麻醉深度。
3. 如果所用麻醉剂的类型或剂量会抑制呼吸运动，则必须确保动物获得充分通气，例如使用气泵为水生动物供氧，或使用呼吸机为陆生动物提供通气支持。
4. 将动物置于合适体位，以便从上方直接接触其眼睛。
   注意：根据物种不同，可采用仰卧位或侧卧位。可使用一小块惰性金属（如不锈钢）和松紧橡胶带制作简易固定装置（见 图 1）。
5. 在动物眼部放置适当的超声耦合介质。若眼睛被鳞状眼睑（超声不可穿透）覆盖，可用棉签轻轻移开。
   ​注意：对于水生动物，最佳超声介质是动物日常生活的清洁养殖用水。对于陆生动物，应使用足量的超声耦合凝胶，以确保超声探头（即线阵探头）可在整个眼球表面自由移动并成像。陆生动物对侧眼睛需涂抹兽用眼膏以保护角膜。

2. 二维和三维眼部超声图像采集

1. 将超声探头置于眼睛内侧，根据所需的图像方向选择背腹向或头尾向。
2. 在B模式下，将最大成像深度调至眼内最内侧及最深部区域，并确保所有目标结构均可见于图像视野中。
   注意：在某些物种中，晶状体占玻璃体的比例相对较大，可能会吸收超声波，尤其是在较高频率下。
3. 缓慢地将探头向两侧移动，同时观察实时图像。确保所有目标结构均在图像视野中可见；若无法清晰显示，应更换为频率较低且景深更大的探头。
   注意：以下中心频率对应的最大景深为：21 MHz：3 cm，40 MHz：1.5 cm，50 MHz：1 cm（参见 表1然而，如果眼球内存在钙化或其他超声波无法穿透的结构，这些最大景深值可能会显著降低。
4. 调整图像深度、深度偏移（从图像顶部到目标结构的距离）、图像宽度，以及焦点区域的数量和位置，以覆盖所有三个空间维度中感兴趣的目标区域（例如., 1 厘米成像深度，2 毫米深度偏移，1 厘米成像宽度，单聚焦区。
   注意：尽管不同超声系统中用于调节这些参数的按钮名称可能有所不同，但大多数系统均配备有名称直观的按钮以进行此类调节。这些图像参数设置通常会影响超声采集的时间分辨率的可调范围。
5. 将帧率设置在50-120帧·s的范围内^-1.
   注意：时间分辨率（即连续B扫描之间的时 间间隔）必须足够低，以显示成像血管中较大的像素强度变异性；也就是说，时间分辨率不能过高。另一方面，为了在合理时间内完成对眼睛的完整3D记录，时间分辨率也不能过低。建议采用50–120帧·s⁻¹的时间分辨率。^-1 对于大多数物种的血流增强型操作而言，通常已足够。在某些超声系统上，可通过切换“常规成像”（高空间分辨率/低时间分辨率）和“心脏模式”（低空间分辨率/高时间分辨率）来获得所需的时间分辨率。
6. 将二维增益调节至适当水平（约5 dB），使B模式成像中解剖结构刚好可见，以提高后续血流增强重建中的信噪比。
7. 在单一层面位置获取二维血流增强图像时，将探头移动至该位置，然后继续执行步骤 3.1。
8. 为获取整个目标区域（例如视网膜）的三维记录，将换能器移至目标区域的一端极限位置。
   1. 为确定感兴趣区域最末端的精确位置，可短暂增加二维增益。
   2. 正确放置换能器后，在记录前降低二维增益，以确保后续血流增强重建中的最大信噪比。
9. 对于三维记录中的每一步（切片），采集不少于100帧（理想情况下不少于1000帧）。
10. 使用显微操作器或内置换能器电机，以例如 25 µm 或 50 µm （注意记录步长），并在每一步重复采集 ≥100 帧图像。
11. 根据所在机构的动物护理指南实施实验动物安乐死。

3. 流动增强图像重建

1. 将记录导出为医学数字成像和通信（DICOM）文件格式（小端序）。
2. 基于≥100帧图像生成一幅血流增强图像T）电影记录，在像素级别上计算标准差（STD(x,y)）使用以下公式：
   
   何处 I_t(x,y) 是该像素的强度 (x,y) 时间点的像素坐标 t，以及 该源文本为空，无内容可翻译。_t(x,y) 是算术平均值 I 随着时间的推移。
3. 对3D记录中的每个切片重复步骤3.2。
4. 为自动化处理三维记录中多个切片的STD计算和图像重建流程，可使用ImageJ及配套的宏脚本以批处理模式执行此操作（补充文件 1).
5. 将所有重建的切片合并为一个图像堆栈（图像堆叠 ImageJ 中的命令
6. 根据采集过程中使用的步长指定切片厚度（特性 ImageJ 中的命令
7. 将图像堆栈保存为3D TIF文件。
   注意：眼部血管的流量加权三维记录可进一步用于生成容积渲染图像，并构建眼内血管结构的数字解剖模型和实体解剖模型。这些图像处理方法不在本实验方案的范围之内；更多细节请参阅已发表的相关文献。^33,34,35.

结果

用于成像眼部血管床的血流增强型超声技术可应用于多种物种，目前已在46种不同的脊椎动物中使用（图1，表1）。在非成年哺乳类脊椎动物中，有核红细胞的存在使得在动态影像记录中流动血液相对于静止组织呈现出正向对比（补充文件2）。然而，在逐帧分析时，血液与周围组织之间的清晰区分则不那么明显（图2A）。本方案中描述的血流增强处理方法本质上是将二维空间中的多时间点记录（由 T 帧构成的一个切片）合成为一幅单一图像，其中位于流动血液区域的像素固有的信号值波动具有比周围静止组织更高的标准差，从而产生正向对比（图2B）。为了明显增强血管对比度，可使用查找表（Look Up Tables）生成伪彩图像（图2C）。在三维采集过程中，多个已知间距的平行切片可被组合成三维图像数据（补充文件3 和

讨论

利用血流增强型超声进行血管成像，为眼部血管系统提供了一种新的无创成像方法，相较于现有技术具有多项优势，但也存在其固有的局限性。血流增强型超声的主要优势在于能够生成穿透视网膜色素上皮层的ocular angiography，而光学成像技术的成像深度受限于该结构。在超声成像中，空间分辨率和成像深度最终由超声换能器的频率决定：频率越高，空间分辨率越高，但成像深度随之减小，因此换能器频率的选择本质上是在成像深度与空间分辨率之间进行权衡。根据我们的经验，在小眼球中实现最佳视网膜超声成像，宜采用高频超声换能器（≥50 MHz），并配合适当的成像深度 <1 cm及更低频率的换能器（20-40 MHz）用于较大眼球，成像深度为1.5-3.0 cm。对于三维超声扫描，附加切片维度的分辨率由二维超声扫描序列中各扫描间步长决定。根据我们的经验，步长小于20 µm的三维扫描难以实现。

血流增强型二维超声具有较高的时间分辨率。理想情况下，血流增强血管成像需要每幅图像采集≥1000帧，因此每次图像扫描至少需要8秒。在进行三维血流增强超声时，时间分辨率显著降低，因为扫描时间随三维扫描图像堆栈中图像数量...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MS-222	西格玛	E10521-50G
苯佐卡因	西格玛	E-1501
丙泊酚	B Braun	12260470_0320
阿法沙龙	Jurox	NA
异氟烷	Zoetis	50019100
超声扫描仪	VisualSonics	Vevo 2100