我们介绍一种无需使用造影剂的非侵入性超声技术，用于生成眼部的三维血管造影。
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本文内容
摘要
摘要
眼内的视网膜是人体中能量需求最高的组织之一，因此需要丰富的血液供应以实现高效的氧气输送。脉络膜的毛细血管层位于视网膜的外表面，是大多数脊椎动物视网膜氧气供应的主要来源。然而，由于该血管床位于高度吸光的视网膜后方，使用传统的光学技术对其进行成像十分困难。本文介绍了一种高频超声技术，结合后续的血流增强方法，可对眼部深层血管床（0.5–3 cm）进行高时空分辨率成像。这种非侵入性方法在具有有核红细胞的物种（非哺乳动物及胎儿动物模型）中效果良好。该技术能够在无需使用造影剂的情况下生成非侵入性的三维血管造影图像，且不受血流角度影响，其灵敏度高于基于多普勒的超声成像技术。
引言
脊椎动物视网膜的高代谢率在两个相互矛盾的需求之间形成了一种内在的权衡：一方面需要高血流量，另一方面又需要一条无血管的透光路径。为了避免灌注红细胞对视觉造成干扰，所有脊椎动物的视网膜均通过位于感光细胞后方的一层毛细血管网——脉络膜毛细血管层（choriocapillaris）1,2,3——获取氧气和营养物质。然而，这种单一的营养和氧气来源对视网膜厚度造成了扩散限制4,5，因此许多视觉活跃的物种演化出多种复杂的血管网络，以向这一代谢活跃的器官提供额外的血液供应6。这些血管床包括哺乳动物和某些鱼类中灌注视网膜内层的血管4,7,8,9,10，存在于多种鱼类、爬行动物和鸟类视网膜内侧（即面向光线的一侧）的血管4,<....
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方案
以下方案已获得丹麦食品、农业和渔业部下属的丹麦动物实验监察局（丹麦兽医和食品管理局）的许可（许可证号 2016-15-0201-00835）。
1. 麻醉与超声耦合介质
- 对实验动物进行麻醉。
注意：合适的麻醉剂类型和剂量高度依赖于物种。通常，浸入式麻醉剂如 MS-222（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）、苯佐卡因（对氨基苯甲酸乙酯）和丙泊酚（2,6-二异丙基苯酚）适用于鱼类和两栖类，这些动物可通过鳃或皮肤快速吸收麻醉剂（例如，在虹鳟中使用 0.05 mg·L-1 苯佐卡因）。对于羊膜动物，可选择多种可通过静脉、肌肉或腹腔注射的溶解性化合物，也可使用气体麻醉剂。肌肉注射阿法沙龙对爬行动物有效（例如，在蜥蜴中使用 30 mg·kg-1），而气体异氟烷对鸟类有效（例如，鸽子使用 2% 异氟烷与空气混合）。有关跨物种可用麻醉剂的全面概述，请参考已发表的文献30,31,32。 - 检测动物的反射以确认达到理想的麻醉深度。确保动物在操作过程中完全静止，因为血流增强型超声技术对运动噪声非常敏感。
- 麻醉过深可能改变血流模式，因此在实验启动阶段应进行剂量滴定。
- 逐步增加麻醉剂量，....
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结果
用于成像眼部血管床的血流增强型超声技术可应用于多种物种，目前已在46种不同的脊椎动物中使用（图1，表1）。在非成年哺乳类脊椎动物中，有核红细胞的存在使得在动态影像记录中流动血液相对于静止组织呈现出正向对比（补充文件2）。然而，在逐帧分析时，血液与周围组织之间的清晰区分则不那么明显（图2A）。本方案中描述的血流增强处理方法本质上是将二维空间中的多时间点记录（由 T 帧构成的一个切片）合成为一幅单一图像，其中位于流动血液区域的像素固有的信号值波动具有比周围静止组织更高的标准差，从而产生正向对比（图2B）。为了明显增强血管对比度，可使用查找表（Look Up Tables）生成伪彩图像（图2C）。在三维采集过程中，多个已知间距的平行切片可被组合成三维图像数据（补充文件3 和
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讨论
利用血流增强型超声进行血管成像，为眼部血管系统提供了一种新的无创成像方法，相较于现有技术具有多项优势，但也存在其固有的局限性。血流增强型超声的主要优势在于能够生成穿透视网膜色素上皮层的ocular angiography，而光学成像技术的成像深度受限于该结构。在超声成像中，空间分辨率和成像深度最终由超声换能器的频率决定：频率越高，空间分辨率越高，但成像深度随之减小，因此换能器频率的选择本质上是在成像深度与空间分辨率之间进行权衡。根据我们的经验，在小眼球中实现最佳视网膜超声成像，宜采用高频超声换能器（≥50 MHz），并配合适当的成像深度 <1 cm及更低频率的换能器（20-40 MHz）用于较大眼球，成像深度为1.5-3.0 cm。对于三维超声扫描，附加切片维度的分辨率由二维超声扫描序列中各扫描间步长决定。根据我们的经验，步长小于20 µm的三维扫描难以实现。
血流增强型二维超声具有较高的时间分辨率。理想情况下，血流增强血管成像需要每幅图像采集≥1000帧，因此每次图像扫描至少需要8秒。在进行三维血流增强超声时，时间分辨率显著降低，因为扫描时间随三维扫描图像堆栈中图像数量.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作获得了嘉士伯基金会（Carlsberg Foundation，项目号：CF17-0778；CF18-0658）、伦德贝克基金会（Lundbeck Foundation，项目号：R324-2019-1470；R346-2020-1210）、维卢克斯基金会（Velux Foundations，项目号：00022458）、A.P. 穆勒医学科学促进基金会（The A.P. Møller Foundation for the Advancement of Medical Science）、欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议（编号：754513）下的资助，以及奥胡斯大学研究基金会（The Aarhus University Research Foundation）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MS-222 | 西格玛 | E10521-50G | |
| 苯佐卡因 | 西格玛 | E-1501 | |
| 丙泊酚 | B Braun | 12260470_0320 | |
| 阿法沙龙 | Jurox | NA | |
| 异氟烷 | Zoetis | 50019100 | |
| 超声扫描仪 | VisualSonics | Vevo 2100 |
参考文献
- Yu, C. Q., Schwab, I. R., Dubielzig, R. R. Feeding the vertebrate retina from the Cambrian to the Tertiary. Journal of Zoology. 278 (4), 259-269 (2009).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distrib....
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重印与许可
