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方法文章

利用自制微型生物反应器由诱导性多能干细胞生成脑类器官

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DOI：

10.3791/62987

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2021年12月11日

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1Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 4Department of Pathological Anatomy, North-Western State Medical University, 5Department of Biology, Lomonosov State University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方案。为了大量且高质量地获得脑类器官，我们使用自制的微型生物反应器。

摘要

由iPSC衍生的脑类器官是一种极具前景的技术 体外 模拟神经系统病理及药物筛选。该技术为近期新兴，尚处于发展初期，仍存在一些尚未解决的局限性。目前的实验方案尚无法获得足够一致的类器官用于药物发现和临床前研究。类器官的成熟过程可能长达一年，迫使研究人员同时启动多个分化流程，从而增加了实验室在空间和设备方面的额外成本。此外，脑类器官常在中心区域出现坏死区，这是由于营养和氧气供应不足所致。因此，目前大多数实验方案采用循环培养系统以改善营养供应。

同时，目前尚无价格低廉的动态系统或生物反应器用于类器官培养。本文介绍了一种利用紧凑且低成本的自制微型生物反应器培养脑类器官的方案。该方案可实现高质量类器官的大规模制备。

引言

由人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的模型已广泛应用于神经发育和神经退行性疾病的研究所1。在过去十年中，三维脑组织模型（即所谓的脑类器官）在很大程度上补充了传统的二维神经元培养体系2。类器官在一定程度上重现了胚胎脑的三维结构，从而实现了更精确的建模。目前已发表多种用于生成代表不同脑区类器官的实验方案，包括大脑皮层3,4,5、小脑6、中脑、前脑、下丘脑7,8,9以及海马体10。已有多个应用类器官研究人类神经系统疾病的成功范例11。此外，类器官还被应用于药物发现12，以及包括SARS-CoV-2在内的感染性疾病研究13,14。

类脑器官的直径可达数毫米。因此，类脑器官的内部区域可能因缺氧或营养不良而最终发生坏死。为此，许多实验方案中包含了特殊的生物反应器8、摇床或微流控系统15。这些设备可能需要大量昂贵的细胞培养基，且设备本身的成本通常较高。一些生物反应器由许多机械部件组成，难以进行灭菌以重复使用。

大多数实验方案都存在"批次效应"16，这会导致来源于相同iPSC的类器官之间出现显著的变异性。这种变异性阻碍了需要高度一致性的药物筛选或临床前研究。通过获得足够数量的类器官以筛选出大小均一的个体，可能在一定程度上解决这一问题。

时间因素也是一个重要问题。Matsui 等人（2018 年）表明，脑类器官需要至少六个月才能达到成熟17。Trujillo 等人（2019 年）也证明，类器官只有在培养六个月后才会出现电生理活动18。由于类器官成熟周期较长，研究人员往往在前一批分化尚未完成时就启动新的分化过程。多个并行的分化流程需要额外的经费、设备和实验室空间。

我们最近开发了一种微型生物反应器，主要解决了上述问题19。该自制生物反应器由一个超低黏附性或未经处理的培养皿组成，其中心带有一个塑料凸钮。该塑料凸钮可防止类器官在培养皿中心聚集和黏连，这种聚集和黏连通常由摇床旋转引起。本文描述了这种廉价且简单的自制微型生物反应器如何实现高质量脑类器官的大规模制备。

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方案

注意：除步骤 1.2 和 1.3 外，整个实验方案均需使用无菌操作技术。所有培养基和溶液在加入细胞或类器官前需预热至 37 °C。将细胞置于 37 °C、5% CO2、相对湿度 80% 的 CO2 培养箱中培养。实验流程示意图见图 1。

1. 将培养皿转化为微型生物反应器

  1. 将无菌的 15 mL 离心管切成高度为 7–8 mm 的环状；对这些环进行高压灭菌。
  2. 将低吸附性、未处理或微生物用的培养皿打碎成碎屑。将约 1 g 塑料碎屑溶于 10 mL 氯仿中，过夜溶解以制备液态塑料。
    ​注意：操作应在通风橱中进行。
  3. 检查所得液态塑料是否具有足够的黏稠度以便移液；其液滴应能保持球形，且不在表面扩散。若液体过稀，则加入更多塑料碎屑；若过于黏稠，则加入氯仿稀释。
  4. 在无菌的超低吸附性 6 cm 培养皿中央制作一个塑料凸起。以下两种方法均适用，具体如下：
    1. 将已高压灭菌的塑料环置于培养皿中央，然后将液态塑料滴加至环内。
    2. 不使用塑料环，直接将液态塑料滴加在培养皿的中央。
  5. 将培养皿在超净工作台中敞口放置 2–3 小时，直至完全干燥。随后用紫外线照射处理干燥后的培养皿 15–20 分钟。

2. 诱导iPSCs的神经元分化

  1. 将iPSCs在含有细胞外蛋白的基质预包被的35 mm培养皿中，用多能干细胞培养基培养至75-90%融合度。
  2. 制备A-SR培养基。详见表1。
  3. 在分化第0天，吸除培养基，并加入2 mL A-SR培养基。
  4. 制备培养基A（见表2）。
  5. 从第2天至第14天，使用培养基A培养细胞两周，每隔一天更换一次培养皿中的培养基。

第14天神经上皮前体细胞形成球状体

  1. 第14天，使用一种特殊的24孔培养板（每孔含有约1,200个微孔）将神经上皮前体细胞制成类球体（图2C）。请遵循以下步骤。
    注意：在此分化阶段，一个35 mm的培养皿通常含有3 - 3.5 × 106个神经上皮前体细胞。因此，一个35 mm培养皿中的神经上皮前体细胞足以用于3 - 4个24孔微孔培养板的孔。
  2. 准备带有微孔的24孔培养板：向每孔加入1 mL培养基A。使用配备板架的摆动转子，在1,300 × g条件下短暂离心5分钟。在显微镜下检查，确保微孔中无气泡。
  3. 配制培养基B（表3）。
  4. 移除含有神经上皮前体细胞的培养皿中的培养基；用2 mL DMEM/F12洗涤细胞。为使细胞脱离，加入1.5 mL用PBS配制的0.48 mM EDTA溶液。在显微镜下观察细胞脱离情况。
  5. 将细胞收集至15 mL离心管中。向管中加入5 mL DMEM/F12洗涤细胞。在200 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于2 mL培养基B中。
  6. 通过台盼蓝染色和血细胞计数板检测细胞浓度和活力。计算获得总共1 × 106个活细胞所需的悬液体积。
  7. 将含有1 × 106个细胞的细胞悬液转移至24孔微孔板的每一孔中。向每孔加入培养基B至总体积达2 mL，轻轻吹打混匀数次，然后在100 × g条件下短暂离心1分钟，以使细胞落入微孔中。
    注意：每孔细胞数量不应超过1 × 106个，否则相邻微孔中的类球体会发生融合。
  8. 在显微镜下检查细胞是否均匀分布在微孔中。若分布不均，需重复吹打和离心操作。
  9. 将培养板置于培养箱中过夜，使细胞聚集形成类球体。

4. 类器官的获取与培养

  1. 次日早晨（第15天），在显微镜下检查类球体的质量。健康的类球体应透明且表面光滑（图2A、B）。小心地将每个孔中的类球体收集至15 mL离心管中，静置2–3分钟使其依靠重力沉淀，然后移除上清液。
  2. 向类球体中加入2 mL在冰上同步解冻的基质胶，用移液器轻轻混匀，于室温孵育30分钟。
  3. 为洗去多余的基质胶，向离心管中加入8 mL培养基B，轻轻吹打混匀，然后以100 × g离心1分钟。
    注意：离心时间和速度不得超过上述条件，以免导致类球体发生不可逆聚集。
  4. 移除上清液，向离心管中加入2 mL培养基B，轻轻吹打混匀。将类球体悬液均分至两个微型生物反应器中，每个反应器中预先加入4 mL培养基B。将微型生物反应器置于15 cm培养皿中，以防止水分蒸发和污染。
  5. 将装有微型生物反应器的培养皿置于摇床上，以70–75 rpm的转速培养类器官。
  6. 第16天，配制培养基C（表4）。
  7. 将类器官转移至15 mL离心管中，静置5分钟使其沉降至管底，吸除上清液后加入5 mL培养基C，再将类器官重新转移回微型生物反应器中。
    注意：类球体透明且几乎不可见，操作时需小心避免丢失。
  8. 在培养基C中继续培养类球体两周，每两天更换一次培养基。两周培养结束后，每个微型生物反应器中保留约100个类球体用于后续培养，其余过量的类球体用冻存液在液氮中冷冻保存。
  9. 第30天，配制培养基D（表5）。
  10. 更换为培养基D进行培养，该培养基为成熟培养基。每2–3天更换一次培养基，持续三周，之后使用不含BDNF和GDNF的培养基D继续培养。

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结果

方案流程如图1所示。该方案包含五种培养基，诱导iPSCs分化为脑类器官，持续至少一个月。当iPSCs生长至75-90%融合度时，开始进行分化（图2A，B）。在培养基A中培养iPSCs的第10-11天，开始出现向神经元分化的最初迹象，此时细胞开始聚集成“玫瑰花环”样结构（图2C）。在第14-15天，iPSCs分化为神经上皮前体细胞。99%的细胞表达神经上皮标志物SOX1，且不表达多能性细胞标志物TRA-1-81和OCT4（补充图S1）。随后，我们使用含EDTA的溶液收获细胞，并将其转移至培养基B中，接种于带有微孔的特殊24孔培养板中（图2D）。细胞转移至微孔后的状态如图2E所示。每个微孔促进细胞聚集成一个单一的球形结构。所有微孔中形成的球体大小一致，每个球体约含100个细胞（<...

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讨论

所述方案包含两个关键步骤，可生成大小均一的高质量类器官。首先，类器官由细胞数量和细胞成熟度几乎相同的球状体发育而来。其次，自制的生物反应器为每个类器官提供了均一的生长环境，使类器官不会相互拥挤或粘连。

细胞质量和细胞成熟状态对于执行该方案至关重要。诱导iPSCs进行神经元分化时，应在其融合度达到75-90%时开始。如果细胞密度过低，iPSCs可能向非神经元方向分化。iPSCs的神经元诱导时间不应超过两周，因为之后神经前体细胞会变得更加脆弱。在分化过程中，应定期为细胞和类器官提供新鲜培养基，因为营养缺乏会导致类器官质量急剧下降。在动态培养中仅允许短暂的中断。

允许对该实验方案进行一些修改。可用于在迷你生物反应器中心部位制作凸起的惰性生物材料包括：氟塑料、聚乙烯、聚丙烯。如果使用微生物学用的培养皿来制备液态塑料，则所制得的迷你生物反应器应检测其对神经元的细胞毒性。不同直径的培养皿可作为生物反应器的底座，但此时必须调整旋转速度。此外，若培养基体积发生变化，也需调整旋转速度。例如，在6 cm培养皿中加入8 mL培养基时，最佳转速为70...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由俄罗斯联邦科学与高等教育部资助（项目编号 075-15-2019-1669，用于 RT-PCR 分析）以及俄罗斯科学基金会资助（项目编号 19-15-00425，用于其余所有工作）。作者还感谢 Pavel Belikov 在视频剪辑方面的帮助。稿件中的图示使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc34425含微孔的24孔培养板
B-27 SupplementGibco17504044神经元补充剂B
GlutaMAX SupplementGibco35050061200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
Human BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
Human FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
Human GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028血清替代物
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850多能干细胞培养基
N2 SupplementGibco17502001
Neurobasal MediumGibco21103049神经细胞维持用基础培养基
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1抗微生物剂
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS DorsomorphinMiltenyi Biotec130-104-466Dorsomorphin
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Trypan Blue SolutionGibco15250061
Versen solutionGibco15040066含0.48 mM EDTA的PBS
β-mercaptoethanolGibco31350010

参考文献

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