本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方案。为了大量且高质量地获得脑类器官，我们使用自制的微型生物反应器。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
由iPSC衍生的脑类器官是一种极具前景的技术 体外 模拟神经系统病理及药物筛选。该技术为近期新兴，尚处于发展初期，仍存在一些尚未解决的局限性。目前的实验方案尚无法获得足够一致的类器官用于药物发现和临床前研究。类器官的成熟过程可能长达一年，迫使研究人员同时启动多个分化流程，从而增加了实验室在空间和设备方面的额外成本。此外，脑类器官常在中心区域出现坏死区，这是由于营养和氧气供应不足所致。因此，目前大多数实验方案采用循环培养系统以改善营养供应。
同时，目前尚无价格低廉的动态系统或生物反应器用于类器官培养。本文介绍了一种利用紧凑且低成本的自制微型生物反应器培养脑类器官的方案。该方案可实现高质量类器官的大规模制备。
引言
由人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的模型已广泛应用于神经发育和神经退行性疾病的研究所1。在过去十年中，三维脑组织模型（即所谓的脑类器官）在很大程度上补充了传统的二维神经元培养体系2。类器官在一定程度上重现了胚胎脑的三维结构，从而实现了更精确的建模。目前已发表多种用于生成代表不同脑区类器官的实验方案，包括大脑皮层3,4,5、小脑6、中脑、前脑、下丘脑7,8,9以及海马体10。已有多个应用类器官研究人类神经系统疾病的成功范例11。此外，类器官还被应用于药物发现12，以及包括SARS-CoV-2在内的感染性疾病研究13,14。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：除步骤 1.2 和 1.3 外，整个实验方案均需使用无菌操作技术。所有培养基和溶液在加入细胞或类器官前需预热至 37 °C。将细胞置于 37 °C、5% CO2、相对湿度 80% 的 CO2 培养箱中培养。实验流程示意图见图 1。
1. 将培养皿转化为微型生物反应器
- 将无菌的 15 mL 离心管切成高度为 7–8 mm 的环状；对这些环进行高压灭菌。
- 将低吸附性、未处理或微生物用的培养皿打碎成碎屑。将约 1 g 塑料碎屑溶于 10 mL 氯仿中，过夜溶解以制备液态塑料。
注意：操作应在通风橱中进行。 - 检查所得液态塑料是否具有足够的黏稠度以便移液；其液滴应能保持球形，且不在表面扩散。若液体过稀，则加入更多塑料碎屑；若过于黏稠，则加入氯仿稀释。
- 在无菌的超低吸附性 6 cm 培养皿中央制作一个塑料凸起。以下两种方法均适用，具体如下：
- 将已高压灭菌的塑料环置于培养皿中央，然后将液态塑料滴加至环内。
- 不使用塑料环，直接将液态塑料滴加在培养皿的中央。
- 将培养皿在超净工作台中敞口放置 2–3 小时，直至完全干燥。随后用紫外线照射处理干燥后的培养....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
方案流程如图1所示。该方案包含五种培养基，诱导iPSCs分化为脑类器官，持续至少一个月。当iPSCs生长至75-90%融合度时，开始进行分化（图2A，B）。在培养基A中培养iPSCs的第10-11天，开始出现向神经元分化的最初迹象，此时细胞开始聚集成“玫瑰花环”样结构（图2C）。在第14-15天，iPSCs分化为神经上皮前体细胞。99%的细胞表达神经上皮标志物SOX1，且不表达多能性细胞标志物TRA-1-81和OCT4（补充图S1）。随后，我们使用含EDTA的溶液收获细胞，并将其转移至培养基B中，接种于带有微孔的特殊24孔培养板中（图2D）。细胞转移至微孔后的状态如图2E所示。每个微孔促进细胞聚集成一个单一的球形结构。所有微孔中形成的球体大小一致，每个球体约含100个细胞（<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
所述方案包含两个关键步骤，可生成大小均一的高质量类器官。首先，类器官由细胞数量和细胞成熟度几乎相同的球状体发育而来。其次，自制的生物反应器为每个类器官提供了均一的生长环境，使类器官不会相互拥挤或粘连。
细胞质量和细胞成熟状态对于执行该方案至关重要。诱导iPSCs进行神经元分化时，应在其融合度达到75-90%时开始。如果细胞密度过低，iPSCs可能向非神经元方向分化。iPSCs的神经元诱导时间不应超过两周，因为之后神经前体细胞会变得更加脆弱。在分化过程中，应定期为细胞和类器官提供新鲜培养基，因为营养缺乏会导致类器官质量急剧下降。在动态培养中仅允许短暂的中断。
允许对该实验方案进行一些修改。可用于在迷你生物反应器中心部位制作凸起的惰性生物材料包括：氟塑料、聚乙烯、聚丙烯。如果使用微生物学用的培养皿来制备液态塑料，则所制得的迷你生物反应器应检测其对神经元的细胞毒性。不同直径的培养皿可作为生物反应器的底座，但此时必须调整旋转速度。此外，若培养基体积发生变化，也需调整旋转速度。例如，在6 cm培养皿中加入8 mL培养基时，最佳转速为70.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由俄罗斯联邦科学与高等教育部资助（项目编号 075-15-2019-1669，用于 RT-PCR 分析）以及俄罗斯科学基金会资助（项目编号 19-15-00425，用于其余所有工作）。作者还感谢 Pavel Belikov 在视频剪辑方面的帮助。稿件中的图示使用 BioRender.com 制作。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 含微孔的24孔培养板 |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | 神经元补充剂B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | 血清替代物 |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | 多能干细胞培养基 |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | 神经细胞维持用基础培养基 |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | 抗微生物剂 |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 含0.48 mM EDTA的PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
参考文献
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
