单颗粒干涉反射成像表征单个细胞外囊泡及其群体动力学

摘要

本方案介绍了用于细胞外囊泡（EV）尺寸、EV 数量、EV 表型及 EV 生物标志物共定位的多层级和综合性测量的单颗粒干涉反射成像技术。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是一类由大多数细胞分泌的、具有脂质双层结构的纳米级囊泡。EVs 携带多种不同的生物分子，包括蛋白质、脂质、DNA 和 RNA，被认为可在多种组织和器官中介导细胞间的通讯。近年来，EVs 作为疾病诊断的生物标志物以及多种疾病的治疗载体，受到了广泛关注。目前已有多种用于 EVs 表征的方法，但现有的 EVs 分析技术均存在各自的局限性。因此，随着这一前沿研究领域的不断发展，开发高效且可靠的 EVs 分离与表征方法仍是其中的关键步骤之一。本文提供了一种详细的实验方案，介绍单颗粒干涉反射成像传感器技术（SP-IRIS），该方法可用于直接检测未经纯化的生物样本或经其他方法纯化后的 EVs，并对其进行表征。这一先进技术可实现对 EVs 尺寸、EVs 数量、EVs 表型及生物标志物共定位等多层面、全面的分析测量。

引言

细胞外囊泡（EVs）是源于细胞的纳米级膜性囊泡，可从多种生物体液中分离获得，包括血液、乳汁、唾液、尿液、胆汁、胰液以及脑脊液和腹腔液。EVs 的产生源于 通过 三种主要机制：凋亡、释放 通过 多泡体与细胞膜的融合，以及细胞膜的出芽¹有证据表明，细胞外囊泡（EV）可将供体细胞的组分转移至邻近或远端的细胞与组织，提示这些由膜包被的颗粒可能在旁分泌以及远距离或内分泌信号级联反应中发挥重要作用^1,2,3由于细胞外囊泡（EVs）能够反映细胞表型的快照，其作为多种疾病诊断和治疗工具的潜力已成为当前研究的热点领域。^4,5,6,7,8.

目前已开发出多种用于EV表征的方法^9,10

方案

根据堪萨斯大学医学中心（KUMC）机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案，采集了小鼠的血清样本。在这些实验中使用这些生物样本也已获得KUMC的批准。

1. 样品制备（第1天）

1. 使用纳米颗粒追踪法或等效技术测定EV浓度。
2. 用孵育溶液将样品稀释至浓度为 5 × 10⁷–5 × 10⁸ 个EVs/mL；所需样品体积至少为50 µL。
   注意：对于EV浓度未知的样品，可使用总蛋白浓度1 µg/mL作为替代指标。若样品预期浓度较低，上样前应至少以孵育溶液进行1:1稀释。
3. 将24孔板置于平坦、无振动且避免剧烈移动的表面上。
   注意：为增强对比度，可在板下方放置一张白纸。
4. 向孔周围区域加入水（图2）。

结果

图7（左图）显示了一个三色复合图像，该图展示了来源于HEK293条件培养基的细胞外囊泡（EVs），这些囊泡结合在芯片的CD63点上，并分别在绿色、红色和蓝色通道中对CD81、CD63和CD9进行染色。图7（右上图）为放大图像，显示每个被捕获的EV可表现出一种或多种颜色在各通道中的共定位，且强度各异。被捕获EV染色的差异反映了三种四跨膜蛋白在单个囊泡上表达的异质性，可通过数据分析软件进行量化。图7（右下图）展示了EVs的粒径分布直方图，其粒径均大于50 nm。粒径直方图显示，在CD63点上捕获的EVs的众数粒径为50 nm。每个结合于点阵图像上的EV的颜色共定位情况、荧光强度和粒径构成了表型数据，这些数据是测量中的基础数据。

讨论

目前的细胞外囊泡（EV）表征方法在很大程度上依赖于纯化的EV，而这受到现有EV纯化技术实验局限性的制约^{9,10,11,12,13}。单颗粒干涉反射成像技术（SP-IRIS）是一种有效的技术，能够消除样本分析所需的纯化步骤，从而节省时间并降低典型EV工作流程中的成本。该方法所需的样本投入量通常非常小，剩余样本仍可用于其他分析方法。

此外，以抗原特异性方式检测细胞外囊泡（EVs）的能力，对于基础EV研究以及诊断和治疗应用中的稀有事件检测都具有重要意义。然而，与血液中其他循环EVs和污染物相比，疾病特异性的EVs可能浓度较低^2,11,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 厘米无菌培养皿	Fisher	FB0875712
15 毫升无菌离心管	n/a	各种
24 孔细胞培养板，平底	Fisher	08-772-1
封闭溶液	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
芯片文件（Chipfiles）	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
芯片（Chips）	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
芯片夹具（Chuck）	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
Corning Easy Grip 一次性聚苯乙烯无菌瓶，250 毫升	Fisher	09-761-4
Corning Easy Grip 一次性聚苯乙烯无菌瓶，500 毫升	Fisher	09-761-10
去离子水（DI 水）	Fisher	LC267404
EMS 型碳纤维尖头镊子	Fisher	50-193-0842
ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	可捕获 hCD81、hCD9、hCD63 及 IgG 对照  + 标记 hEV-A（hEV-CD63-647、hEV-CD81-555、hEV-CD9-488），每试剂盒含 16 片芯片
ExoView R100 成像仪	NanoView Biosciences	EV-R100	干涉显微镜，配备高性能相机，支持三色荧光检测，并可对细胞外囊泡进行无标记的粒径分析与计数
荧光标记的人源 CD9 IgG 抗体	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
荧光标记的人源 CD63 IgG 抗体	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
荧光标记的人源 CD81 IgG 抗体	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
孵育溶液	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
可调节转速至 500 rpm 的轨道摇床或微孔板摇床	n/a	各种
板封膜（Plate Seal）	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
溶液 A	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
溶液 B	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
溶液 C	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
溶液 D	NanoView Biosciences	EV-TETRA-C	包含于 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒中。
方形/平头镊子	Fisher	50-239-62
直头尖锐 Boley 型镊子	Fisher	16-100-124
Thermo Scientific 粘性 PCR 板封膜	Fisher	AB-0558