成蚊的唾液腺（SG）是所有蚊媒病原体（包括病毒和寄生虫）向人类宿主传播所必需的。本视频展示了从四龄幼虫（L4）阶段的Anopheles gambiae蚊子中高效分离唾液腺，并对L4唾液腺进行后续分析前处理的操作方法。
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摘要
摘要
蚊子的唾液腺（SGs）是虫媒病原体传播所必需的门户器官。致病因子包括病毒以及引起疟疾的疟原虫（Plasmodium）寄生虫，这些病原体会在唾液腺细胞的分泌腔中聚集，当蚊子再次吸血时即可传播给脊椎动物宿主。由于成蚊的唾液腺是由幼虫期唾液腺导管芽体的残留部分在早期蛹期组织溶解后进一步发育而成，因此幼虫唾液腺成为限制疾病传播的理想干预靶点。深入了解幼虫唾液腺的发育过程，有助于更好地理解其形态结构与功能适应性，并有助于评估针对该器官的新干预措施。本视频方案展示了一种高效分离、固定和染色冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）幼虫唾液腺的技术。从幼虫中解剖出的腺体置于25%乙醇溶液中，随后用甲醇-冰醋酸混合液固定，再经冷丙酮洗涤。在磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗数次后，唾液腺可用多种广谱标记染料和/或针对唾液腺表达蛋白的抗血清进行染色。该幼虫唾液腺分离方法也可用于收集组织，以开展原位杂交分析、其他转录组学应用及蛋白质组学研究。
引言
疟疾是一项重大的公共卫生威胁，2019年几乎造成2.3亿例感染和约40.9万人死亡1。大多数死亡病例发生在撒哈拉以南非洲地区，由疟原虫Plasmodium falciparum引起，其昆虫传播媒介为冈比亚按蚊Anopheles gambiae，本视频演示即以该蚊种为主题。尽管数据显示，自本世纪初以来年度死亡人数已显著下降（每年减少>30万例），但从2000年至2015年期间疾病发病率的积极下降趋势正在减缓，提示需要新的策略来限制疾病传播2。在控制甚至可能根除疟疾的诸多有前景的新策略中，包括利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑和基因驱动技术来靶向干预蚊媒的传播能力3,4,5。事实上，正是针对蚊媒的干预措施（例如广泛使用长效杀虫剂处理的蚊帐）在降低疾病传播方面发挥了最大作用6。
雌性蚊子在吸血过程中从感染疟原虫的人体中获取疟原虫配子体。在蚊子这一必需宿主体内，经过受精、成熟、穿过中肠上皮、种群扩增以及在血腔中迁移等过程后，成百上千至数以万计的疟原虫子孢子侵入蚊子的唾液腺（SGs），并充满其分泌细胞的分泌腔。一旦进入分泌腔，寄生虫便直接与唾液导管相通，因此在蚊子下一次吸血时即可传播至新的脊椎动物宿主。由于唾液腺对于将致疟子孢子传播给人类宿主至关重要，而实验室研究表明唾液腺对蚊子吸血、存活或繁殖能力并非必需7,8,9，因此唾液腺是实施阻断传播措施的理想靶标。成蚊的唾液腺是由幼蚊唾液腺中残留的“导管芽”（"duct bud"）结构进一步发育而来，这些结构在蛹早期唾液腺组织溶解后仍持续存在10，这使得幼蚊唾液腺成为限制成蚊阶段疾病传播的理想干预靶点。
对按蚊唾液腺（SG）幼虫阶段的发育进行表征，不仅有助于更深入地理解其形态结构和功能适应性，还可为靶向该器官的新型干预措施（例如通过基因编辑关键SG调控因子）的效果评估提供支持。由于此前所有关于幼虫唾液腺结构的研究均早于免疫染色和现代成像技术的应用10,11，我们已建立了一种可利用多种抗体和细胞标记物对唾液腺进行分离与染色的实验方案12。本视频展示了从冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）L4期幼虫中提取、固定并染色幼虫唾液腺，进而进行共聚焦成像的完整操作流程。
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方案
1. 溶液与工具的准备
- 解剖液的制备
- 制备解剖液时，将 2.5 mL 100% 乙醇加入 7.5 mL 去离子 H2O 中，置于 15 mL 塑料离心管内。轻轻颠倒混匀 3 次。
注意：该溶液可在室温下保存数周。
- 制备解剖液时，将 2.5 mL 100% 乙醇加入 7.5 mL 去离子 H2O 中，置于 15 mL 塑料离心管内。轻轻颠倒混匀 3 次。
- 10x 磷酸盐缓冲液（PBS）储备液的制备
- 制备 10x PBS 储备液时，将 17.8 g Na2HPO4• 2H2O、2.4 g KH2PO4、80 g NaCl 和 2 g KCl 加入 800 mL 去离子水中，使用磁力搅拌器搅拌至固体完全溶解。再用纯化水定容至 1 L。
注意：该溶液可在室温下保存数月。
- 制备 10x PBS 储备液时，将 17.8 g Na2HPO4• 2H2O、2.4 g KH2PO4、80 g NaCl 和 2 g KCl 加入 800 mL 去离子水中，使用磁力搅拌器搅拌至固体完全溶解。再用纯化水定容至 1 L。
- 1x PBS 的制备
- 在无菌玻璃瓶中，将 10 mL 10x PBS 加入 90 mL H2O 中。盖紧瓶盖，颠倒混匀 3 次。
注意：该溶液可在 4 °C 保存数周。
- 在无菌玻璃瓶中，将 10 mL 10x PBS 加入 90 mL H2O 中。盖紧瓶盖，颠倒混匀 3 次。
- 固定液的制备
- 将 600 µL 甲醇加入 200 µL 冰醋酸中。每次使用前需新鲜配制。
- 橡皮泥板的构建（即填充硅橡胶的组织培养皿）
- 按 1:50 的比例混合环氧树脂（1 g）和水（50 mL），将混合物倒入培养皿中。待其完全干燥后方可使用。
注意：一旦制备完成，橡皮泥板可长期使用多年。
- 按 1:50 的比例混合环氧树脂（1 g）和水（50 mL），将混合物倒入培养皿中。待其完全干燥后方可使用。
2. 腺体解剖（图1A）
- 使用塑料移液管从饲养盘中收集晚期四龄幼虫（孵化后约10天；图2）。
注：有关蚊虫饲养与幼虫培养的标准操作，请参阅此在线手册13。- 将腻子板置于解剖显微镜载物台上，并将幼虫转移至腻子板上。
注：在分装幼虫进行初次解剖时，使用塑料移液管一次性转移约10条幼虫至腻子板上较为方便。
- 将腻子板置于解剖显微镜载物台上，并将幼虫转移至腻子板上。
- 在腻子板上滴加一滴解剖液（1:3 EtOH:H2O），与10条幼虫分开放置。
- 使用塑料移液管或一次性玻璃移液管，将一条L4幼虫放入25% EtOH液滴中。
- 双手各持一把镊子（#5），用非优势手夹住幼虫头部，优势手持另一把镊子夹住幼虫头部下方位置，施加轻微且持续的拉力，使头部与身体其余部分分离，同时确保腺体仍附着于头部。丢弃幼虫的躯体部分。
注：解剖过程中，可在附近放置一张纸巾，用于收集幼虫残体。 - 将头部/腺体收集至1.5 mL离心管中的1 mL 1×PBS缓冲液内。每约40个已解剖的腺体及其附着的头部使用1 mL PBS。等待头部/唾液腺沉降至缓冲液底部。
3. 抗体染色的固定（图1B）
- 使用玻璃移液管从微量离心管顶部开始吸除PBS，避免触碰黏性的蚊虫组织，并尽可能去除PBS溶液，同时不损伤组织。随后加入800 µL甲醇与冰醋酸按3:1比例配制的混合液。将离心管置于4 °C环境中过夜（建议12–24小时，推荐19小时）。
- 次日，吸除溶液，并替换为1 mL预冷的100%丙酮。静置90秒。
- 移除丙酮，随后每次用1 mL的1×PBS轻柔冲洗组织，共冲洗三次。
注意：每次加入PBS时，样品应随液体流动缓慢上浮，待PBS加完时应重新沉降至管底。
4. 免疫染色（图1B）
- 在200 µL的1×PBS总体积中，按适当稀释比例（1:100）加入一抗（例如Rab11）。用移液枪头轻轻吹打混匀管内液体。4 °C条件下孵育过夜。
- 移除一抗溶液，用1 mL的1×PBS洗涤三次（轻轻吹打液体进出移液枪头）。
- 在200 µL的总体积中，按适当稀释比例（1:200）加入二抗（Alex Fluor 488标记的山羊抗兔IgG）。用移液枪头轻轻吹打混匀管内液体。室温孵育90分钟。
- 在此步骤中，向200 µL的PBS中加入染料，如尼罗红（标记脂质，5 µL，1 µg/µL）和/或Hoechst（标记DNA，3 µL，1 µg/µL）。室温额外孵育60分钟。用1×PBS轻轻洗涤三次。
5. 染色腺体的显微镜封片（图1C）
- 用移液器吸取 200 µL 的 100% 甘油滴加到显微镜载玻片上。
注意：由于甘油具有黏性，需将移液器吸头保留在液体中直至达到所需体积。直接进入 100% 甘油时未观察到组织收缩现象。然而，研究人员也可在将样品转移至 100% 甘油前，先在试管中依次经过 30% 和 50% 甘油洗涤。 - 使用软毛刷将染色后的头部（每张载玻片最多 20 个）连同附着的腺体（及其他内部结构）转移至显微镜载玻片上（图 3A）。将样品均匀分散分布在载玻片表面。
注意：当用刷子将腺体置于盖玻片上时，可用镊子轻轻调整唾液腺（SGs）的方向，使其全部朝向一致。 - 在解剖显微镜下，使用两对镊子将幼虫头部与腺体分离，并朝相反方向小心拉扯两种组织。
注意：由于完全分离唾液腺较为困难，可仅移除头部，保留唾液腺及其相关内部结构。即使唾液腺仍与其他组织相连，在使用 Hoechst 及其他标记物染色后仍可轻易识别（图 3B、C）。 - 移除并丢弃头部，并对每个唾液腺重复上述分离操作。
注意：移除头部时，可在旁边放置一张纸巾用于收集。 - 轻轻放置一片厚度为 1.5 mm 的盖玻片于上方（避免产生气泡），并用透明指甲油封片。
- 将载玻片置于避光容器中，4 °C 保存。
注意：染色后的腺体载玻片在避光条件下于 4 °C 可保存六个月至一年，质量无明显变化。若随时间推移甘油开始渗漏，可轻轻抬起盖玻片，并用移液器补充甘油以填充空隙。
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结果
唾液腺相对容易从所有4龄幼虫中解剖获得。在晚期L4幼虫阶段，可通过雌性幼虫背侧胸部具有一条红色条纹而雄性则无此特征来区分雌雄（图2）。我们还观察到，雄性L4幼虫的触角形态比雌性更为复杂（图2），这与成蚊中该结构的性别差异相似。在L4阶段显著的整体生长过程中，唾液腺还会在L4阶段形成管腔12。使用Hoechst染色的早期L4幼虫分离唾液腺显示，近端叶和远端叶之间由一条狭窄的缩窄部分隔开（图3B、C）。正在形成的管腔将从最前端的唾液导管（未显示）一直延伸至远端叶。在中期至晚期L4幼虫的免疫染色远端唾液腺中可观察到正在形成的管腔（图4）。围绕正在形成管腔的分泌细胞顶区表现出强烈的尼罗红染色（图4B、C），提示存在微绒毛样结构。在顶面附...
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讨论
本方案改编自果蝇唾液腺解剖方案和成蚊成体解剖方案14,15,16。然而，使用成体解剖及唾液腺染色方法时，大多数标记物无法穿透基底膜（数据未显示）。对成体方案的改进包括：在25% EtOH溶液中解剖腺体，用MeOH与冰醋酸的混合液洗涤腺体，并进行90秒的丙酮洗涤。在原始的成体方案中，成体唾液腺是在1x PBS中进行解剖的14,15,16。在25% EtOH溶液中解剖有助于保持唾液腺结构完整，并防止染色过程中组织受损。进行初始解剖时，将幼虫唾液腺的方向调整为头部朝向非优势手一侧，并用优势手轻轻向外牵拉，操作最为方便（因为幼虫活动非常活跃）。通过MeOH与冰醋酸混合液洗涤腺体所实现的组织通透性改善，提示幼虫唾液腺基底膜和/或细胞质膜中的脂质成分与成体唾液腺存在差异。90秒的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢约翰斯·霍普金斯大学疟疾研究所提供并饲养An. gambiae幼虫。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| 丙酮 | Millipore Sigma | 179124 | |
| 软毛刷 | Amazon (SN NJDF) 细节绘画刷套装 | B08LH63D89 | |
| 盖玻片（22 × 50 mm） | VWR | 48393-195 | |
| DAPI（DNA染色） | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| 200 证明乙醇 | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 移液器 | Gilson | P200 | |
| 冰醋酸 | Sigma Aldrich | 695092 | |
| 珠宝商镊子，Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| 甲醇 | Millipore Sigma | 1414209 | |
| 指甲油 | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red（脂质染色） | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| 纸巾/擦拭纸 | ULINE | S-7128 | |
| 培养皿（用于制作腻子板） | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| 移液器吸头 | Gilson | Tips E200ST | |
| 塑料移液管 | Fisher Scientific | S304671 | |
| 一抗（例如 Crb、Rab11） | 发育研究杂交瘤库（DSHB）；Andrew 实验室 | 小鼠抗 Crb（Cq4）或兔抗 Rab11 | |
| 带荧光标记的二抗（例如 Alexa Fluor 488 羊抗兔） | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| 用于腻子板的硅树脂及固化剂 | 陶氏化学 - Ximeter 硅胶 | PMX-200 | |
| 载玻片，一端磨砂用于标记 | VWR 20 × 50 mm | 48393-195 | |
| 麦胚凝集素（Wheat Germ Agglutinin） | ThermoFisher Scientific | W834 |
参考文献
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