成蚊的唾液腺（SG）是所有蚊媒病原体（包括病毒和寄生虫）向人类宿主传播所必需的。本视频展示了从四龄幼虫（L4）阶段的Anopheles gambiae蚊子中高效分离唾液腺，并对L4唾液腺进行后续分析前处理的操作方法。
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摘要
摘要
蚊子的唾液腺（SGs）是虫媒病原体传播所必需的门户器官。致病因子包括病毒以及引起疟疾的疟原虫（Plasmodium）寄生虫，这些病原体会在唾液腺细胞的分泌腔中聚集，当蚊子再次吸血时即可传播给脊椎动物宿主。由于成蚊的唾液腺是由幼虫期唾液腺导管芽体的残留部分在早期蛹期组织溶解后进一步发育而成，因此幼虫唾液腺成为限制疾病传播的理想干预靶点。深入了解幼虫唾液腺的发育过程，有助于更好地理解其形态结构与功能适应性，并有助于评估针对该器官的新干预措施。本视频方案展示了一种高效分离、固定和染色冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）幼虫唾液腺的技术。从幼虫中解剖出的腺体置于25%乙醇溶液中，随后用甲醇-冰醋酸混合液固定，再经冷丙酮洗涤。在磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗数次后，唾液腺可用多种广谱标记染料和/或针对唾液腺表达蛋白的抗血清进行染色。该幼虫唾液腺分离方法也可用于收集组织，以开展原位杂交分析、其他转录组学应用及蛋白质组学研究。
引言
疟疾是一项重大的公共卫生威胁，2019年几乎造成2.3亿例感染和约40.9万人死亡1。大多数死亡病例发生在撒哈拉以南非洲地区，由疟原虫Plasmodium falciparum引起，其昆虫传播媒介为冈比亚按蚊Anopheles gambiae，本视频演示即以该蚊种为主题。尽管数据显示，自本世纪初以来年度死亡人数已显著下降（每年减少>30万例），但从2000年至2015年期间疾病发病率的积极下降趋势正在减缓，提示需要新的策略来限制疾病传播2。在控制甚至可能根除疟疾的诸多有前景的新策略中，包括利用基于CRISPR/Cas9的基因编辑和基因驱动技术来靶向干预蚊媒的传播能力3,4,5。事实上，正是针对蚊媒的干预措施（例如广泛使用长效杀虫剂处理的蚊帐）在降低疾病传播方面发挥了最大作用6。
雌性蚊子在吸血过程中从感染疟原虫的人体中获取疟原虫配子体。在蚊子这一必需宿主体内，经过受精、成熟、穿过中肠上皮、种群扩增以及在血腔中迁移等过程后，成百上千至数以万计的疟原虫子孢子侵入蚊子的唾液腺（SGs），并充满其分泌细胞的分泌腔。....
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方案
1. 溶液与工具的准备
- 解剖液的制备
- 制备解剖液时，将 2.5 mL 100% 乙醇加入 7.5 mL 去离子 H2O 中，置于 15 mL 塑料离心管内。轻轻颠倒混匀 3 次。
注意：该溶液可在室温下保存数周。
- 制备解剖液时，将 2.5 mL 100% 乙醇加入 7.5 mL 去离子 H2O 中，置于 15 mL 塑料离心管内。轻轻颠倒混匀 3 次。
- 10x 磷酸盐缓冲液（PBS）储备液的制备
- 制备 10x PBS 储备液时，将 17.8 g Na2HPO4• 2H2O、2.4 g KH2PO4、80 g NaCl 和 2 g KCl 加入 800 mL 去离子水中，使用磁力搅拌器搅拌至固体完全溶解。再用纯化水定容至 1 L。
注意：该溶液可在室温下保存数月。
- 制备 10x PBS 储备液时，将 17.8 g Na2HPO4• 2H2O、2.4 g KH2PO4、80 g NaCl 和 2 g KCl 加入 800 mL 去离子水中，使用磁力搅拌器搅拌至固体完全溶解。再用纯化水定容至 1 L。
- 1x PBS 的制备
- 在无菌玻璃瓶中，将 10 mL 10x PBS 加入 90 mL H2O 中。盖紧瓶盖，颠倒混匀 3 次。
注意：该溶液可在 4 °C 保存数周。
- 在无菌玻璃瓶中，将 10 mL 10x PBS 加入 90 mL H2O 中。盖紧瓶盖，颠倒混匀 3 次。
- 固定液的制备
- 将 600 µL 甲醇加入 200 µL 冰醋酸中。每次使用前需新鲜配制。
- 橡皮泥板的构建....
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结果
唾液腺相对容易从所有4龄幼虫中解剖获得。在晚期L4幼虫阶段，可通过雌性幼虫背侧胸部具有一条红色条纹而雄性则无此特征来区分雌雄（图2）。我们还观察到，雄性L4幼虫的触角形态比雌性更为复杂（图2），这与成蚊中该结构的性别差异相似。在L4阶段显著的整体生长过程中，唾液腺还会在L4阶段形成管腔12。使用Hoechst染色的早期L4幼虫分离唾液腺显示，近端叶和远端叶之间由一条狭窄的缩窄部分隔开（图3B、C）。正在形成的管腔将从最前端的唾液导管（未显示）一直延伸至远端叶。在中期至晚期L4幼虫的免疫染色远端唾液腺中可观察到正在形成的管腔（图4）。围绕正在形成管腔的分泌细胞顶区表现出强烈的尼罗红染色（图4B、C），提示存在微绒毛样结构。在顶面附.......
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讨论
本方案改编自果蝇唾液腺解剖方案和成蚊成体解剖方案14,15,16。然而，使用成体解剖及唾液腺染色方法时，大多数标记物无法穿透基底膜（数据未显示）。对成体方案的改进包括：在25% EtOH溶液中解剖腺体，用MeOH与冰醋酸的混合液洗涤腺体，并进行90秒的丙酮洗涤。在原始的成体方案中，成体唾液腺是在1x PBS中进行解剖的14,15,16。在25% EtOH溶液中解剖有助于保持唾液腺结构完整，并防止染色过程中组织受损。进行初始解剖时，将幼虫唾液腺的方向调整为头部朝向非优势手一侧，并用优势手轻轻向外牵拉，操作最为方便（因为幼虫活动非常活跃）。通过MeOH与冰醋酸混合液洗涤腺体所实现的组织通透性改善，提示幼虫唾液腺基底膜和/或细胞质膜中的脂质成分与成体唾液腺存在差异。90秒的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢约翰斯·霍普金斯大学疟疾研究所提供并饲养An. gambiae幼虫。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| 丙酮 | Millipore Sigma | 179124 | |
| 软毛刷 | Amazon (SN NJDF) 细节绘画刷套装 | B08LH63D89 | |
| 盖玻片（22 × 50 mm） | VWR | 48393-195 | |
| DAPI（DNA染色） | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| 200 证明乙醇 | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 移液器 | Gilson | P200 | |
| 冰醋酸 | Sigma Aldrich | 695092 | |
| 珠宝商镊子，Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| 甲醇 | Millipore Sigma | 1414209 | |
| 指甲油 | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red（脂质染色） | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| 纸巾/擦拭纸 | ULINE | S-7128 | |
| 培养皿（用于制作腻子板） | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| 移液器吸头 | Gilson | Tips E200ST | |
| 塑料移液管 | Fisher Scientific | S304671 | |
| 一抗（例如 Crb、Rab11） | 发育研究杂交瘤库（DSHB）；Andrew 实验室 | 小鼠抗 Crb（Cq4）或兔抗 Rab11 | |
| 带荧光标记的二抗（例如 Alexa Fluor 488 羊抗兔） | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| 用于腻子板的硅树脂及固化剂 | 陶氏化学 - Ximeter 硅胶 | PMX-200 | |
| 载玻片，一端磨砂用于标记 | VWR 20 × 50 mm | 48393-195 | |
| 麦胚凝集素（Wheat Germ Agglutinin） | ThermoFisher Scientific | W834 |
参考文献
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al.
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