本研究通过使用稳定同位素标记的葡萄糖示踪剂，对多囊卵巢综合征小鼠模型中的肝脏葡萄糖生成进行直接测定 通过 在禁食和高糖状态下同时进行尾静脉注射。
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本文内容
摘要
摘要
多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见疾病，可导致葡萄糖代谢紊乱，如胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良。葡萄糖代谢失调是该疾病的重要表现，也是其发病机制的关键。因此，针对PCOS中葡萄糖代谢评估的研究具有重要意义。目前极少有研究在PCOS模型中使用非放射性葡萄糖示踪剂直接定量肝脏葡萄糖生成。本研究逐步阐述了通过测定[6,6-2H2葡萄糖，一种稳定的同位素标记葡萄糖示踪剂 通过 气相色谱-质谱联用（GCMS）。该实验流程包括制备稳定的同位素标记葡萄糖示踪剂溶液，通过尾静脉插管，在同一小鼠体内依次进行禁食状态和高糖状态下的葡萄糖示踪剂输注。[6,6-2H2采用五乙酸酯衍生物法通过气相色谱-质谱联用（GCMS）测定葡萄糖。该技术可用于多种涉及肝脏葡萄糖生成速率直接测定的研究。
引言
多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见疾病，影响12%–20%的育龄女性1,2这是一种复杂的疾病，可导致多种表型，包括多囊卵巢、月经不规律以及临床或实验室检查显示高雄激素血症；通常在女性符合上述三项标准中的任意两项时即可确诊。3多囊卵巢综合征（PCOS）的一个主要特征及其发病机制中的关键因素是患者女性中存在的代谢紊乱。患有PCOS的女性出现胰岛素抵抗、糖耐量异常、肥胖和代谢综合征的几率更高。3,4,5,6胰岛素抵抗不仅是该疾病的临床表现，还被认为通过增强黄体生成素在卵巢中的作用，促进雄激素的过度产生，从而参与疾病的发生发展。7,8胰岛素抵抗被认为可能有多种成因，但研究表明其可能源于胰岛素受体信号传导的异常模式9,10已采用胰岛素-正葡萄糖钳夹技术这一金标准方法，对多囊卵巢综合征患者中的....
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方案
所有动物实验程序均经贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. [6,6-2H2]葡萄糖的制备
- 在实验前一天，将稳定同位素葡萄糖示踪剂用生理盐水配制。本实验使用[6,6-2H2]葡萄糖作为示踪剂，用于测定血浆葡萄糖出现率。
注意：本实验中需测量禁食状态和富葡萄糖条件下的葡萄糖生成情况，因此需配制两种不同的葡萄糖同位素溶液。配制时应使最终输注剂量分别接近1 mg/(kg·min)和2 mg/(kg·min)。这些浓度经过多次前期预实验优化确定。 - 通过将无菌无热原的[6,6-2H2]葡萄糖溶解于无菌0.9%氯化钠溶液中，配制第一种输注液，仅含[6,6-2H2]葡萄糖示踪剂，用于代表禁食状态。
- 通过将[6,6-2H2]葡萄糖示踪剂与非同位素葡萄糖（约20 mg/kg·min）共同溶解于无菌0.9%氯化钠溶液中，配制第二种输注液，以模拟进食状态。
注意：在本实验中，采用初始脉冲加恒速输注的方式，[6,6-2H2]葡萄糖在禁食条件下的输注速率为约1.08 mg/(kg·min)，在富葡....
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结果
根据先前描述的同位素稀释方程，通过在空腹和富葡萄糖条件下使用五乙酸酯衍生物测定[6,6-2H2]葡萄糖的M+2富集度，计算总血浆葡萄糖速率（glucoseRa）21。在稳态条件下，假设葡萄糖的出现速率等于其消失速率。对照组在空腹6小时后总glucoseRa为19.98 ± 2.53 mg/(kg·min)，在富葡萄糖条件下为25.80 ± 1.76 mg/(kg·min)。根据上述计算，GPR在空腹6小时后为19.08 ± 2.53 mg/(kg·min)，在富葡萄糖条件下为8.56 ± 1.40 mg/(kg·min)（表1 和 图1）。
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讨论
高血糖及葡萄糖代谢/稳态异常是多囊卵巢综合征（PCOS）的特征。血糖水平由饮食摄入的葡萄糖和内源性葡萄糖生成共同维持。 通过 糖原分解、糖异生和糖原合成，这些过程受激素和酶的调控。肝脏葡萄糖生成在循环血糖水平升高时受到抑制。在葡萄糖代谢异常的疾病中，葡萄糖生成的抑制调节功能受损，导致高血糖。尽管已有许多研究在多囊卵巢综合征（PCOS）动物模型中间接测量了肝脏葡萄糖生成，但直接测量该指标的研究仍较少。本研究描述了一种可同时在多只小鼠中直接测定肝脏葡萄糖生成速率的简便方法。该技术可广泛应用于涉及不同小鼠模型中葡萄糖代谢的多种研究。此外，该技术还可作为进一步扩展测量的基础，例如糖异生和糖原分解的测定。20,23.
本实验的关键步骤是导管插入以及准确定量[6,6-2H2]葡萄糖和天然葡萄糖配制输注溶液，以适于进行气相色谱-质谱分析（GCMS）。导管插入技术参见 Marini 等（2006）的描述。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了贝勒医学院妇产科系的培训资助（ALG）以及美国国立卫生研究院向CSB、SC和JM提供的R-01研究资助（资助号 DK114689）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠溶液 | McKesson | 275595 | |
| 10 mL BD 鲁尔锁头注射器 | VWR | 75846-756 | 每只动物使用两个注射器（一个用于同位素标记葡萄糖溶液，一个用于高葡萄糖浓度的同位素溶液） |
| 1 英寸透明透波胶带 | 3M | 70200400169 | |
| 1 英寸标签胶带 | Fisher | GS07F161BA | 品牌仅为示例 |
| 含肝素化生理盐水冲洗液的 5 mL 注射器 | McKesson | 191-MIH-2235 | 也可自行配制肝素冲洗液（每毫升 0.9% 氯化钠溶液中含 10 单位肝素） |
| 5 mm Medipoint Goldenrod 动物采血针 | Fisher Scientific | NC9891620 | 若动物年龄在 2 至 6 个月之间，则使用 5 mm 针头 |
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 650501 | |
| 高级加热磁力搅拌器 | VWR | 97042-602 | 品牌仅为示例 |
| BD 27 号 0.5 英寸针头 | Health Warehouse | A283952 | |
| BD 30 号 0.5 英寸针头 | Medvet | 305106 | |
| BD Intramedic 聚乙烯（PE）管，内径 0.28 mm × 外径 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| BD Intramedic 聚乙烯（PE）管，内径 0.28 mm × 外径 0.61 mm | VWR | 63019-004 | |
| 烧杯，1000 mL | 任意品牌 | ||
| 笼养颗粒 | |||
| 带密封盖的透明 VOA 玻璃小瓶 | Fisher Scientific | 05-719-120 | 用于储存丙酮和采血样本 |
| 铜制无齿鳄鱼夹（用于止血带） | Amazon | 任意品牌；由实心铜制成、表面光滑无齿的鳄鱼夹 | |
| D-(+)-葡萄糖 >99.5% | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-葡萄糖（6,6-D2, 99%） | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-349-PK | |
| 道康宁硅胶管，内径 0.3 mm × 外径 0.64 mm | VWR | 62999-042 | |
| 放大镜 | Amazon | 任意品牌；类似于 LANCOSC 带光源和支架的放大镜 | |
| 微量天平 | Ohaus Adventurer Pro | AV264C | 任何具有 0.0001 g 精度的类似型号均可使用 |
| Nalgene 瓶，500 mL | Sigma-Aldrich | B0158-12EA | 或任何类似品牌；需沿中线剖开（包括瓶盖），并在底部切出适合尾巴穿过的凹口 |
| PHD Ultra 多通道注射泵 | Harvard Apparatus | 70-3024A | |
| 有机玻璃板 | 任意品牌；用于在导管插入过程中稳定小鼠 | ||
| 有机玻璃板及隔板 | 任意品牌；用于在输注期间隔离饲养小鼠 |
参考文献
- March, W. A., et al. The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria. Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).
- Yildiz, B. O., et al.
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重印与许可
