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方法文章

微孔板格式的磁力镊子

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DOI：

10.3791/62994

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2022年2月9日

 , 
1Department of Oncology and Metabolism, University of Sheffield

本文内容

摘要

本文介绍了一种新型微孔板检测方法，可在进行群体生化检测的同时实现对生物分子的机械操控。该方法通过使用带有磁体的微孔板盖，从而在微孔板上形成多个静态磁镊来实现。

摘要

力学生物学描述了生物材料的物理力和机械特性如何影响生理过程和疾病发生。通常，这些研究方法局限于单分子技术，从而限制了其广泛应用。为满足这一需求，已开发出一种微孔板检测方法，可在进行常规生化检测的同时实现机械操控。该方法通过在微孔板盖中集成磁体，形成多个磁镊来实现。在此体系中，力作用于连接顺磁性微珠的生物分子上，其效果等同于典型的磁镊系统。研究展示了该工具结合基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法用于监测蛋白质构象变化的应用。然而，该方法具有广泛适用性，可应用于多种生物体系，范围涵盖从酶活性测定到活细胞中信号通路的激活等研究。

引言

力学生物学致力于研究物理力在细胞内及细胞间的传递如何调控细胞活动1,2，以及这种调控如何与蛋白质和细胞的组织结构及动态行为相关联。

单分子力测量技术揭示了从单个蛋白质到完整细胞及组织等生物系统中力的作用机制3,4,5,6,7。这类实验具有较高挑战性，需要专用设备和技术专长。相比之下，标准的生化检测可在 readily available commercial equipment 中以更高的通量进行。

本研究介绍了一种机械生物学检测方法，可同时实现基于磁镊的操作与生化检测8。将磁铁置于3D打印的微孔板盖上（图1A-D），从而可使用商用酶标仪进行检测。通过将目标生物分子与顺磁性微粒偶联，由磁铁对分子施加拉力。改变微粒与磁铁之间的距离，可调节作用于该生物分子上的力（图1E）。

我们以基于肌动蛋白的分子马达——肌球蛋白VI为例，展示该检测方法的应用。肌球蛋白VI受到分子内反向折叠的调控9。研究表明，肌球蛋白VI可处于自抑制状态，而结合伴侣蛋白（如NDP52）可触发其解折叠10,11。为开展这些检测，我们将使用一种双标记的肌球蛋白VI尾部结构域构建体，其N端带有绿色荧光蛋白（GFP），C端带有红色荧光蛋白（RFP），当蛋白发生反向折叠时，GFP与RFP之间将产生荧光共振能量转移（FRET）。N端还带有一个生物素化标签，用于将蛋白固定在表面。我们结合FRET测量技术使用该检测方法，以展示外力如何影响肌球蛋白VI的反向折叠。

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方案

本实验所需的示例蛋白质及试剂列表见材料表。为检测构象变化，应针对用户的研究体系制备相应的蛋白质。

1. 3D打印磁性盖板

  1. 设计一个微孔板盖，用于在24孔微孔板内容纳磁铁。示例CAD文件可从GitHub12下载。尺寸如图1所示。
    注意：可通过调整基座高度来改变磁铁与表面之间的距离，从而调节施加的力。此外，作用于颗粒上的最终力还取决于颗粒大小以及磁铁对之间的间隙。Dos Santos等人8提供了用于计算在0.5 mm、1 mm和2 mm间隙下对1 µm和2.8 µm颗粒施加力的方程。对于本文所述使用2.8 µm颗粒和2 mm间隙的实验，请使用公式1。
    公式1：静力平衡公式；包含力变量和常数的数学方程。
  2. 使用聚对苯二甲酸乙二醇酯-共-环己烷二甲醇酯（PETG）在3D打印系统上3D打印微孔板盖。
    注意：应使用层分辨率为0.02 mm的打印机，以确保精度和可重复性。Dos Santos等人8讨论了打印机精度的影响。
  3. 使用粘合剂将成对的5 mm立方体钕铁硼N42磁铁固定在基座上，磁极方向应使磁场指向微孔板底部。
  4. 至少留出一个位置为空，作为无磁铁对照。
  5. 将微孔板盖存放在尺寸足够的密封容器中，以便于放置和取出。

2. 微孔板表面修饰

  1. 取一个洁净的未经处理的玻璃底24孔微孔板。
  2. 在室温下，用500 µL洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 和 50 mM NaCl）洗涤各孔3次。
  3. 在洗涤缓冲液中加入200 µL生物素标记的BSA（0.2 mg/mL），室温下静置15分钟。
    注意：生物素-BSA用于钝化和固定。也可采用其他钝化和表面固定策略。首次使用或优化时，生物素-BSA浓度可提高至1 mg/mL。
  4. 用500 µL洗涤缓冲液洗涤各孔3次。
  5. 在洗涤缓冲液中加入200 µL链霉亲和素（20 µg/mL），室温下静置15分钟。
    注意：首次使用时，链霉亲和素浓度可提高至1 mg/mL。
  6. 移除溶液，然后用洗涤缓冲液洗涤各孔3次。
  7. 每孔加入500 µL洗涤缓冲液覆盖孔面。
  8. 4 °C保存，待使用时取出。平板应在同一天内使用。

3. 样品制备：蛋白质固定化

  1. 让表面修饰的微孔板恢复至室温。
  2. 用 500 µL 洗涤缓冲液洗涤各孔。
  3. 加入 100 nM 生物素-eGFP-肌球蛋白 VI 尾段-mRFP（储备样品蛋白），在洗涤缓冲液中室温孵育 15 分钟。
    注意：该示例蛋白的制备方法如 Dos Santos 等人8所述。不同蛋白的浓度和孵育时间可能有所不同。
  4. 用 500 µL 洗涤缓冲液洗涤各孔 3 次。
  5. 设置酶标仪记录 GFP（激发波长 490 nm，发射波长 510–600 nm）和 RFP（激发波长 560 nm，发射波长 580–650 nm）的荧光光谱，以确认融合蛋白的存在。
  6. 若蛋白信号不足，可提高步骤 3.3 中的蛋白浓度。
    注意：结合效果差可能与生物素-BSA 和/或链霉亲和素结合不充分有关，此时可将用量提高 10 倍。
  7. 如条件允许，进行微孔扫描测量，以确定融合蛋白是否在微孔板表面均匀结合（图 2）。
    注意：该测量将记录微孔板孔内多个特定位置的荧光强度，从而揭示蛋白是否在整个孔内均匀结合。
  8. 确保在检测区域所在的孔中心位置信号均匀（差异在 5% 以内）。

4. 磁珠制备

  1. 涡旋混匀小瓶中的内容物 2.8 µm 带有重组蛋白A的顺磁性微珠（材料表) 30秒以重悬珠子。
  2. 将相当于1 mg磁性微珠的体积转移至1.5 mL离心管中。
  3. 将试管置于磁力分离器中（材料表) 然后弃去上清液。
  4. 将珠子重悬于 200 µL 用移液器轻轻吹打溶液，以彻底置换 PBS。
  5. 将试管置于磁力架上，然后移除上清液。
  6. 重复洗涤步骤3次。
  7. 稀释 10 µg 抗RFP抗体的 200 µL PBS。
  8. 将磁珠置于磁力分离器中分离，然后重悬于抗体溶液中。
  9. 在室温下使用台式旋转仪以 20 rpm 转速旋转 10 分钟。
  10. 将试管置于磁力架上，移除上清液。
  11. 用 PBS 洗涤 3 次。
  12. 将珠子重悬于 200 µL 洗涤缓冲液。
  13. 为验证抗体在磁珠上的固定效果，将负载抗体的磁珠与溶液共同孵育 >1 µM RFP 融合蛋白
    注意：通过肉眼观察确认蛋白质是否被磁珠分离。
  14. 或者，使用荧光分光光度计测量上清液中RFP的荧光强度（激发波长560 nm，发射波长580–650 nm）。

5. 样品制备：珠子连接

  1. 将10 µg用洗涤缓冲液稀释的磁珠-抗体融合物（200 µL）加入已结合蛋白的微孔板孔中。
  2. 设置一个对照孔，不加入磁珠，以检测磁珠对荧光信号的影响。另准备不含抗体的对照样品，以确定磁珠是否存在非特异性结合。
  3. 将微孔板在室温下孵育30分钟。
  4. 用500 µL洗涤缓冲液洗涤孔3次。
  5. 如条件允许，可在明场显微镜下检查磁珠是否已结合至表面。若磁珠数量不足，将步骤5.1中的浓度提高至500 µg/mL。

6. 数据采集

  1. 将微孔板（不带盖）放入25 °C的荧光酶标仪中。
  2. 设置酶标仪记录GFP（激发波长490 nm，发射波长510-600 nm）和RFP（激发波长560 nm，发射波长580-650 nm）的荧光光谱，以确认融合蛋白的存在。
    注意：应通过微孔板底部进行荧光光谱的测量/记录，以便将盖子置于顶部。因此，应选择合适的微孔板酶标仪。
  3. 记录FRET荧光光谱（激发波长490 nm，发射波长510-650 nm），或在490 nm激发下监测510 nm和610 nm处的荧光。此设置应根据制造商的指导进行。
  4. 从酶标仪中取出微孔板，并加上磁性盖。
  5. 将微孔板放回酶标仪中，静置样品2分钟。
  6. 重复FRET测量，步骤同6.3。

7. 数据分析

  1. 将数据导出以便导入电子表格（例如 Excel）。
  2. 手动提取供体 GFP 在 510 nm 和受体 RFP 在 610 nm 处的数据。
  3. 根据每种条件，使用公式 2 计算相对 FRET。
    公式 2：荧光共振能量转移（FRET）方程，展示能量转移效率。
    A：受体强度（RFP 610 nm），D：供体强度（GFP 510 nm）。
    注意：使用在相同激发和发射条件下表达的重组 RFP，以控制受体的背景激发。

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结果

图2 展示了一个微孔板孔内扫描测量的示例，其中GFP的荧光强度在微孔板孔内以1 mm的间隔进行记录。典型的荧光测量通常在微孔板孔的中心位置（即 图2 中的位置8,8）进行；因此，该位置必须有结合的蛋白。如 图2 所示，在孔中心几毫米半径范围内的荧光强度最高。通常情况下，远离孔边缘的区域固定效果更佳，这可能是由于蛋白与侧壁结合所致。此处可识别出因蛋白结合不足或生物素化BSA和/或链霉亲和素存在缺陷而导致的信号弱的问题。可使用荧光标记的链霉亲和素偶联物来确认表面是否存在生物素化BSA。同样，使用生物素化GFP作为对照蛋白可判断链霉亲和素是否已结合到生物素化BSA表面。如实验方案中所述，可增加生物素化BSA、链霉亲和素和目标蛋白的用量。

图3 提供了肌球蛋白VI受力诱导去折叠的示例数据。将生物素-eGFP-肌球蛋白VI尾部-mRFP构建体

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讨论

该方法能够利用荧光酶标仪在微孔板中便捷地进行基于力的测量。重要的是，该检测方法假设蛋白质在结合到表面时仍具有功能活性。因此，在开展这些测量之前，需要预先了解并确认蛋白质具有活性。此外，针对每个系统，优化分子与超顺磁性微珠及表面的结合条件也是有益的。

该方法可修改后适用于所有类型的微孔板；然而，对于24孔以上的微孔板，需根据情况调整磁体的选择，因为磁体无法放入孔内。尽管仍可将磁体放置在孔的上方，但在24孔板中，这种布置不会对其他孔产生杂散磁场8；而在孔径更小的微孔板（如96孔板）中，孔之间可能会出现磁场分布不均的情况。最后，在倒置显微镜上进行荧光显微成像时，同样可以采用该方法。

该方法不具备单分子测量中的力精度，因此旨在作为这些方法的补充。此外，该方法对样品施加固定的力，无法在单个孔内调节力的大小，也无法监测蛋白质所施加的力。同时，该方法基于一些不适用于单分子测量的假设。例如，我们无法确定每个磁珠上连接的分子数量。然而，假设每个磁珠-分子连接对的分子结合情况相同，因此可以测量相对的...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢英国癌症研究基金会（A26206）、英国医学研究理事会（MR/M020606/1）和皇家学会（RG150801）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔玻璃底微孔板CellvisP24-1.5H-N可从多个来源获取。除非必要，应避免使用表面处理过的微孔板，我们使用成像级玻璃N1.5。
抗RFP抗体Abcamab290可从多个来源获取，但必须确保其与GFP的交叉反应性极低。
台式光学显微镜OptikaIM-3
台式旋转混合仪Cole-Palmer-StuartSB3
生物素标记的BSASigma AldrichA8549
CAD软件 - SketchUp 教育版SketchUp可使用其他CAD软件。用户应确保文件格式与其3D打印机兼容。
Dynabeads Protein AFisher Scientific107467132.8 µm 超顺磁性微珠，包被重组Protein A
Impact接触型胶粘剂EVO-STIK
MagnaRack磁性分离架ThermoFisher ScientificCS15000磁力分离器
NaClFisher Scientific10316943
钕铁硼N42级5 mm立方磁铁SupermagneteW-05-N
酶标仪 - ClarioStarBMG Labtech可使用任何能从微孔板底部进行检测的酶标仪系统。磁铁盖板会阻碍从上方进行常规检测
链霉亲和素Sigma Aldrich189730
Tris-HClFisher Scientific10142400
Ultimaker PETG线材Ultimaker
Ultimaker S3 - 3D打印机Ultimaker

参考文献

  1. Jansen, K. A., et al. A guide to mechanobiology: Where biology and physics meet. Biochimica et Biophysica Acta. 1853, 3043-3052 (2015).
  2. Dos Santos, A., Toseland, C. P. Regulation of nuclear mechanics and the impact on dna damage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3178(2021).
  3. Dos Santos, A., et al. DNA damage alters nuclear mechanics through chromatin reorganization. Nucleic Acids Research. 49 (1), 340-353 (2020).
  4. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171, 1397-1410 (2017).
  5. Lherbette, M., et al. Atomic force microscopy micro-rheology reveals large structural inhomogeneities in single cell-nuclei. Scientific Reports. 7, 8116(2017).
  6. Seo, D., et al. A mechanogenetic toolkit for interrogating cell signaling in space and time. Cell. 165, 1507-1518 (2016).
  7. Yao, M., et al. The mechanical response of talin. Nature Communications. 7, 11966(2016).
  8. Dos Santos, A., Fili, N., Pearson, D. S., Hari-Gupta, Y., Toseland, C. P. High-throughput mechanobiology: Force modulation of ensemble biochemical and cell-based assays. Biophysical Journal. 120, 631-641 (2021).
  9. Fili, N., Toseland, C. P. Unconventional myosins: How regulation meets function. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 67(2019).
  10. Fili, N., et al. Competition between two high- and low-affinity protein-binding sites in myosin VI controls its cellular function. Journal of Biological Chemistry. 295, 337-347 (2020).
  11. Fili, N., et al. NDP52 activates nuclear myosin VI to enhance RNA polymerase II transcription. Nature Communications. 8, 1871(2017).
  12. MagPlate at GitHub. , Available from: https://github.com/cptoseland/MagPlate (2021).
  13. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6, 85-95 (2013).

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