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焦磷酸测序:一个准确的基因分型的简单方法

完成人类基因组计划所提供的信息丰富的第一手的药理学研究的好处。有了这样一个大量的可用数据，基因分型方法的爆炸。焦磷酸测序（R）是其中一个最彻底而又简单的方法用于分析基因多态性。它还具有识别能力，三等位基因，INDELS，短重复序列多态性，同时与甲基化或样本评估确定的等位基因百分比。此外，还有一个标准化的控制序列，提供了内部质量控制。此方法具有快速，高效的单核苷酸多态性的评价，包括很多临床相关基因多态性。焦磷酸测序的技术和方法进行了解释。

焦磷酸测序（R）是其中一个最彻底而又简单的方法用于分析基因多态性。此方法具有快速，高效的单核苷酸多态性的评价，包括很多临床相关基因多态性。焦磷酸测序的技术和方法进行了解释。

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

遗传学研究从人类基因组序列的发布中受益匪浅。Pyro 测序是一种独特的系统，可以分析遗传变异以及 RNA 等位基因失衡、DNA、甲基化状态和基因拷贝数。在本视频中，我们演示了用于基因分析的基本焦释测序反应。大家好，我是来自华盛顿大学医学院内科 Charles Eby 博士和 Brian Gage 博士实验室的 Kristy King。今天我们将向你展示一个热释电测序的程序。该程序很有用，因为它是用于分析 SNP 的最彻底而简单的方法之一。Pyro 测序基于边合成边测序，每当核苷酸掺入开放的三引物 DNA 链中时，就会利用焦磷酸盐的释放。加载板后，根据软件提供的序列掺入核苷酸一旦释放，焦磷酸盐就用于反应中，导致释放 TP，荧光素酶使用TP将荧光素转化为氧荧光素，从而发射光。入射光由 CCD 相机收集并记录为峰，也称为 pyros。任何未掺入 DNA 链的核苷酸都会被 AP pyra 降解，以防止背景噪音。此过程包括以下步骤。分析设计、用于质量控制的 PCR 凝胶电泳和焦磷酸测序。那么让我们开始进行 pyro 测序。为了进行焦磷酸测序，必须首先制备 A PCR 产物。用于焦磷酸测序的 PCR 比大多数 PCR 需要更多的循环，以确保所有引物都用完大约 50 个循环。焦磷酸测序还要求其中一个 PCR 引物被生物素化。最后，重要的是要注意还需要内部底漆。可以使用通过热释测序提供的软件进行高效的分析设计，以确保不存在污染。为了确认存在 PCR 产物，应在一些样品和阴性对照上进行凝胶电泳。要制备焦磷酸测序板，请将 12 微升焦磷酸测序引物混合物添加到 96 孔焦磷酸测序板中。这需要 43.2 μL 内部引物和 1396.8 μL 跪姿缓冲液的混合物，并用粘合膜覆盖热释测序板。如果 96 孔 PCR 产物的每个孔的设置时间超过 50 分钟，则添加 70 微升 SRO 快速混合物，其中包含 240 微升链霉亲和素包被的血清速度。4、560 微升结合缓冲液，由 triss 氯化钠、EDTA 和吐温 20 和 3、600 微升水制成，并牢固地盖上盖子。将含磁珠混合物的 96 孔 PCR 产物板在室温下放入板振荡器中 5 分钟。确保盖子已固定，以防止孔之间出现任何交叉污染。此步骤将允许将链球菌 ENC、包被的球状微珠彻底跪在位于 PCR 引物上的生物素标签上。设置用于制备板的工作站。这包括试剂槽、PCR 产物和磁珠混合物托盘以及热磷酸测序引物托盘。确保 PCR 产物和磁珠混合板以及焦磷酸测序引物托盘正确对齐，以便阴性物处于相同的方向。在转移样品之前，摇晃真空工具，该工具在清水中关闭，以释放其上可能存在的任何珠子或碎屑。丢弃剩余的水，重新装满水槽，然后打开真空吸尘器。将真空工具留在槽中，直到去除所有水，这大约需要 30 秒。将真空工具的过滤头放入 PCR 微珠混合板的孔中，并保留它，直到从板中去除所有液体。可以使用轻柔的摇摆来防止表面张力。当液体开始流过管道时，将真空置于 70% 乙醇槽中。让过滤嘴吸干乙醇 5 秒钟。对 0.2 摩尔氢氧化钠重复此作，该钠将 DNA 变性为单链 PCR，并对洗涤缓冲液重复此作。清洁和中和 PCR 产物。断开真空软管与真空工具的连接，然后将真空工具放入热释测序板中，该板含有跪姿缓冲液混合物中的热释测序引物。如果真空软管仍然连接着，当放入热释电测序板时，引物混合物将被吸入。导致您丢失 PCR 产物的提示。轻轻摇晃或摇动 pyro 测序板孔中的真空尖端，以分散 PCR 产物。摇晃或摇晃完成后，从 pyro 测序板上取下真空工具，将真空工具重新连接到软管上，然后将工具放入清水中清洗，用于下一个板。将热释测序板放在 80 摄氏度的加热块上 2 分钟。两分钟后，从加热块中取出板子，放在凉爽的表面上。冷却后，可以使用胶膜覆盖板，除非板将在 15 分钟内运行以防止蒸发。现在是时候开始 pyro 测序了。焦磷酸测序的第一步是将检测详细信息输入计算机。在单纯形输入下，选择新条目并输入检测信息，包括 ID 名称和要分析的序列，这些信息由检测设计软件提供，并允许质量控制选择分配顺序，该顺序提供围绕 SNP 和对照碱基的序列。最后，选择直方图以提供 pigram 的可视化外观。现在是时候进入 snip 运行了。在 snip runs （截图运行） 和 general （常规） 选项卡下，输入运行名称并选择运行的仪器参数。在设置选项卡下，选择检测条目，然后单击并拖动板。要将所选检测试剂盒输入您的检测板，请务必注意，不必使用整个检测板，您可以在其中灭活不同的孔进行分析，并且可以在同一板上运行许多不同的检测。单击 view 选项卡，然后选择。跑。本页列出了运行所需的适当体积的核苷酸、酶和底物。使用前清洁核苷酸或毛细管和试剂吸头。将吸头装满水，并在吸头顶部施加压力，以检查是否有任何吸头堵塞。如果水没有从吸头底部喷出，请清空并重新装满几次，以尝试迫使水通过。或者，如果吸头仍然堵塞，您可以对吸头进行超声处理。丢弃并获得新的提示。酶和底物在使用前应用水重悬。如果摇晃的气泡可能导致吸头堵塞或分配不一致，则未使用的重悬酶和底物可以储存在零下 20 摄氏度。为了将来在微量离心管中用于毛细管分液吸头，请用核苷酸和 te 缓冲液 P 8 进行一对一稀释。使用前请充分混合。根据软件建议的量，用适当的体积填充核苷酸和试剂吸头。沿吸头侧面轻轻分配液体，以防止气泡吹入吸头并导致堵塞。请务必检查核苷酸分液吸头中是否有任何气泡。如果存在气泡，只需轻敲吸头的侧面，直到气泡浮出水面，或者用干净的移液器吸头将其移开。填充小柱后运行测试板。将小柱放入热释测序仪中，将测试板置于 96 孔板平台中。在板上放置一层封膜，可以很容易地看到试剂和核苷酸的分配。选择屏幕左侧的仪器选项卡，然后单击 manage（管理）。从下拉菜单中选择检测。单击 test，将出现警告。要求您检查测试板是否已放入仪器中。单击 确定。完成后，取下测试板，在测试板的中间，六个孔上应有液点，代表四个核苷酸、酶和底物。如果少于 6 个小点，则表示发生了堵塞，应检查尖端并清除任何堵塞。将板放入 pyro 测序 96 孔板平台中。关闭所有杠杆，然后单击单个板上的 run（运行）。运行设置酶底物，核苷酸将按预定顺序分配。一旦 pyro sequencer 分析了运行，就该检查运行了。蓝色孔代表传递的基因型和 pyro。橙色孔需要人工干预，可以通过单击感兴趣的孔并打开预测的直方图进行编辑。基因型可以通过、失败或检查，基因型本身也可以适当地改变。编辑孔后，板图上将显示一个黑圈。阴性对照应评分为阴性。负孔中可能存在非特异性峰，但是，这通常是由内部引物的环引起的。所以我们刚刚向你展示了如何在人类基因组中对多态性进行 py 测序。DNA Pyro 测序比其他测序程序有用，因为它适用于广泛的应用。它还足够稳定，可以处理来自任何来源的 DNA，包括低浓度和降解的 DNA。执行此程序时，请务必记住从优质干净的 PCR 产物开始。每次检测都包括一个阴性对照，并确保所有试剂都良好。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。

pyrosequencing-a-simple-method-for-accurate-genotyping

Research

JoVE Journal

Biology

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Washington University in St. Louis.  焦磷酸测序（R）是其中一个最彻底而又简单的方法用于分析基因多态性。此方法具有快速，高效的单核苷酸多态性的评价，包括很多临床相关基因多态性。焦磷酸测序的技术和方法进行了解释。

焦磷酸测序:一个准确的基因分型的简单方法

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