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方法文章

使用腔室型和板式呼吸仪通过高分辨率呼吸测定法评估细胞和组织的生物能量学

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DOI：

10.3791/63000

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2021年10月26日

 , 
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

本文内容

摘要

利用高分辨率呼吸测量仪评估氧化磷酸化已成为线粒体功能及细胞能量代谢分析的重要组成部分。本文介绍了使用腔室型和微孔板型高分辨率呼吸测量仪分析细胞能量代谢的实验方案，并讨论了每种设备的主要优势。

摘要

高分辨率呼吸测定法（HRR）可实时监测氧化磷酸化过程，用于分析单个细胞的能量状态，并通过多样化的底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）方案评估呼吸链复合物。本文展示了两种高分辨率呼吸测定仪的使用方法，并提供了一系列适用于培养细胞、骨骼肌和心肌纤维以及脑、肝等软组织分析的基础实验方案。针对培养细胞和组织的方案分别适用于基于腔室的呼吸测定仪，而培养细胞的方案也适用于基于微孔板的呼吸测定仪，两者均包含标准呼吸测定流程。为便于比较，本研究使用CRISPR基因编辑技术构建的线粒体翻译缺陷型HEK293细胞（导致多种呼吸系统缺陷），在两种设备上进行实验，以展示细胞呼吸功能的缺陷。两种呼吸测定仪均可对细胞呼吸进行全面测量，其各自的技术优势和适用性取决于具体的研究问题和研究模型。

引言

线粒体承担着关键的能量供应功能，是一种区室化的细胞器，参与多种重要的细胞生物能量学和代谢过程，如核苷酸、脂质和氨基酸的合成、铁硫簇的生成，并涉及细胞信号传导，例如调控细胞程序性死亡1,2,3。通过氧化磷酸化实现的线粒体生物能量学过程几乎参与细胞内所有生命活动，因此，原发性或继发性线粒体功能障碍与多种疾病状态密切相关4,5。线粒体功能障碍不仅涉及线粒体结构或密度的改变，还包括呼吸系统的质量及其调控的异常6。这种定性层面的异常涵盖底物调控、偶联特性、翻译后修饰、嵴结构动态变化以及呼吸链超复合体的形成与功能7,8。因此，在健康与疾病状态下，对线粒体生物能量学进行准确分析，对于实验研究和临床诊断中评估细胞能量代谢具有重要意义。

线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）是呼吸系统或电子传递系统（ETS）内一系列反应，通过三磷酸腺苷（ATP）生成细胞能量9。该多酶促步骤通过电子从复合物I和复合物II流向复合物IV，从而在线粒体内膜上建立电化学质子梯度，此梯度随后被复合物V（F1FO ATP合酶）用于将二磷酸腺苷（ADP）磷酸化为ATP（图1A）。

首先，在三羧酸循环（TCA）、糖酵解和丙酮酸氧化过程中会产生双电子载体：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和二氢黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）。NADH 在复合体 I（NADH 脱氢酶）处被氧化，期间两个电子被传递给辅酶 Q（醌被还原为氢醌），同时质子被泵入膜间隙（IMS）。其次，复合体 II（琥珀酸脱氢酶）氧化 FADH2，并将电子传递给辅酶 Q，此过程不伴随质子泵出。第三，在复合体 III（细胞色素 c 氧化还原酶）中，来自辅酶 Q 的电子被传递给细胞色素 c，同时质子被泵入膜间隙。第四，细胞色素 c 将电子传递至复合体 IV（细胞色素 c 氧化酶），这是最后一个泵出质子的复合体，氧气在此作为电子受体结合质子，最终形成水。线粒体所消耗的正是这部分氧气，可通过氧电极仪进行测量。最后，由复合体 I、复合体 III 和复合体 IV 产生的质子驱动复合体 V 旋转，从而生成 ATP9。

重要的是，电子传递不仅以线性方式进行，即通常所说的电子传递链。相反，电子可以通过多种呼吸途径传递至辅酶Q池，从而实现电子流的汇聚。例如，NADH底物和琥珀酸可分别通过复合物I和复合物II进入传递链。来自脂肪酸氧化的电子则可通过电子转移黄素蛋白复合物进行传递。因此，对氧化磷酸化（OXPHOS）进行全面分析时，需要采用整体性方法，并使用适当的燃料底物（图1A）。

线粒体氧化磷酸化示意图及细胞实验中的氧气消耗图。
图1：线粒体氧化磷酸化及特异性底物与抑制剂实验方案。（A）线粒体结构及电子传递系统（CI-CIV）和线粒体F1F0 ATP合酶（CV）示意图。所有结构均来源于PDB。图中仅展示本研究中描述的底物和抑制剂。（B）使用标准方案在mHRR设备中测定完整HEK293细胞的氧通量示例轨迹。（C）使用标准方案在cHRR设备中测定完整HEK293细胞的氧通量示例轨迹。（D）使用相应SUIT方案测定来自健康供体的透化人成纤维细胞的氧通量示例轨迹。缩写：1 = 完整细胞的常规呼吸；2 = 状态2；3 = 状态3(I)；4 = 加入细胞色素c后的状态3(I)；5 = 状态3(I+II)；6 = 寡霉素敏感性漏呼吸（Leak(OM)）；7 = 电子传递系统（ETS）容量；8 = S(ROT)；9 = 非线粒体呼吸（ROX）；10 = TMPD；11 = 叠氮化物（Az）。ROT = 鱼藤酮，AM = 抗霉素，ATP = 三磷酸腺苷，Az = 叠氮化物，OM = 寡霉素，FCCP = 羰基氰化对三氟甲氧基苯腙；Asc = 抗坏血酸，TMPD = N,N,N′,N′-四甲基对苯二胺，Succ = 琥珀酸，M = 苹果酸，P = 丙酮酸，ADP = 二磷酸腺苷，NAD = 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，IMS = 膜间隙，FAD = 黄素腺嘌呤二核苷酸。请点击此处查看该图的放大版本。

利用高分辨率呼吸测定法（HRR）分析线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）能力已成为一种具有诊断价值的关键生化方法，不仅适用于原发性线粒体缺陷10,11，还广泛应用于癌症和衰老等生物学其他领域12。HRR可通过评估线粒体OXPHOS能力来测定细胞呼吸，该能力直接反映单个或复合线粒体呼吸链复合物的功能缺陷，并间接关联细胞功能障碍及能量代谢异常9。在方法学上，呼吸测定可使用细胞、组织或分离的线粒体进行11,13,14，而冷冻样本仅部分适用15,16。研究表明，冷冻组织中的电子传递系统（ETS）仍保持完整，且超复合物稳定性得以维持15。因此，与传统的三羧酸（TCA）循环中间产物不同，相应的底物可直接进入ETS。然而，由于冷冻损伤（冰晶形成）破坏了膜完整性，ETS与ATP合成之间的偶联作用会丧失。

呼吸实验通常在37 °C的生理温度下进行，适用于恒温动物的非透化细胞或透化细胞及组织。前者考虑了胞质代谢环境，而后者通过添加特定底物（和抑制剂）来评估各个OXPHOS复合物及ATP酶的能量贡献。底物与抑制剂的添加顺序和变化促使了多种SUIT方案17和检测方法18的发展，以解决有关OXPHOS功能的各种科学问题（综述见12）。细胞呼吸的基本方案评估四种不同的状态：i) 常规呼吸——在未添加任何外源底物或抑制剂的情况下，仅依赖内源性底物进行的呼吸。该状态可揭示由代谢物谱改变等因素引起的普遍性OXPHOS功能障碍或继发性呼吸缺陷。接下来，加入ATP酶抑制剂寡霉素，可揭示线粒体内膜对质子的通透性，定义为ii) 质子漏呼吸。随后逐步滴加质子载体（如解偶联剂羰基氰化对三氟甲氧基苯腙，FCCP），可确定电子传递系统（ETS）在跨膜质子通路完全开放模式下的最大容量，定义为iii) 解偶联呼吸。值得注意的是，实验过程中若对线粒体膜造成过度机械损伤，也可能导致解偶联状态。相反，“非偶联状态”指的是由内在生理机制调控的生理性呼吸解偶联。最后，通过加入复合体III抑制剂抗霉素A和复合体I抑制剂鱼藤酮，完全抑制电子传递系统，从而测定来自非线粒体耗氧过程的残余氧消耗（ROX）（图1A-C）。

线粒体生物能量学包含五种不同的呼吸状态19,20。状态1呼吸指除内源性存在的物质外，未添加任何额外底物或ADP的情况。加入ADP后但仍未添加底物时，进入状态2呼吸。当添加底物后，电子传递和ATP合成得以进行，此时达到状态3呼吸。在此状态下，氧化磷酸化（OXPHOS）能力可在ADP、无机磷酸盐、氧气、NADH和琥珀酸相关底物达到饱和浓度时进行定义。状态4呼吸，即漏呼吸（LEAK respiration），是指在缺乏ADP或ATP合酶被化学抑制的情况下，但底物充足的呼吸状态。最后，在密闭体系中所有氧气被耗尽（无氧）时，可观察到状态5呼吸。

目前存在多种方法用于评估细胞能量状态14，其中两种设备通过分析封闭腔室系统中随时间变化的氧气消耗量，主导了当前对氧化磷酸化（OXPHOS）的实时评估。这两种设备分别是Oroboros 2k高分辨率呼吸测定仪和Seahorse XF细胞外通量分析仪，其适用性因实验模型和研究问题而异。两种设备均以腔室或微孔板孔内每秒氧气（O2）皮摩尔（pmol）的减少量作为绝对值，记录氧气消耗速率。通过将特定缓冲液配方中的氧气消耗量归一化为细胞数量（百万个）、组织重量（mg）或蛋白含量，可获得单位质量的特异性氧气消耗量。

O2k（Oroboros Instruments）是一种封闭式双腔系统，配备有极谱氧传感器（简称基于腔室的高分辨率呼吸测定仪：cHRR）。每个实验腔室可容纳2 mL液体，并通过磁力搅拌器保持均一。该极谱氧传感器采用安培法测量氧气：其包含一个金制阴极、一个银/氯化银阳极，以及两者之间的KCI溶液，构成一个电化学电池，并施加0.8 V电压。检测介质中的氧气通过一层25 µm厚的氟化乙烯丙烯膜（允许O2透过）扩散进入传感器，在阴极被还原生成过氧化氢。在阳极，银被过氧化氢氧化，从而产生电流。该电流（安培）与氧分压呈线性关系。利用氧分压以及检测介质的氧溶解度因子可计算出氧浓度。由于氧分压依赖于实验温度，且极谱测量对温度敏感，因此需要通过帕尔贴加热模块对温度进行精确调控（±0.002 °C）。温度控制范围为4 °C至47 °C。

Seahorse XF 细胞外通量分析仪（Agilent）是一种基于微孔板的系统，采用 24 孔或 96 孔微孔板格式，其中三个荧光电极可随时间测量每个孔中的耗氧量（简称微孔板式高分辨率呼吸仪：mHRR）。检测过程中，检测卡盒最多可提供四个端口用于自动加样。一次检测包含多个循环，每个循环分为三个阶段：1）混匀、2）等待和 3）测量。在测量阶段，传感器探针下降至微孔板中，形成一个临时封闭的腔室（体积为 7–10 µL），用于检测发射光。该光信号由传感器探针尖端嵌入聚合物中的荧光探针发出，其通过磷光猝灭效应感应 O2 浓度。荧光信号强度与 O2 浓度成正比，同时受传感器及检测介质温度的影响。因此，准确估算氧气浓度需采用相对法，即设置不含任何样品的背景孔作为对照。在混匀阶段，传感器上下移动，混合临时腔室上方的液体，从而恢复氧气浓度。每个循环计算出一个氧气消耗速率。温度可在 16 °C 至 42 °C 范围内精确控制。

高分辨率呼吸测定法（HRR）是评估原发性线粒体相关疾病及一般细胞代谢中细胞生物能量学的金标准。本研究提供了HRR的基本实验方案，用于评估细胞和组织中的氧化磷酸化（OXPHOS）功能。

cHRR和mHRR示意图、哺乳动物细胞、组织步骤及培养板设置的实验流程图
图2：用于cHRR的细胞与组织制备，以及用于mHRR呼吸测定的细胞制备工作流程。（A）所提供的实验方案概览。（B）哺乳动物细胞（步骤1.2）：相当于3 × 106个细胞的HEK293细胞沉淀（左图）；非纤维性组织（步骤1.3）：在2 mL特氟龙玻璃匀浆器中制备小鼠小脑裂解物（中图）；皂苷诱导的骨骼肌通透化处理（步骤1.4，右图），用于cHRR呼吸测定。（C）用于mHRR呼吸测定的真核细胞（HEK293）的标准微孔板接种布局（步骤2.4）及汇合度检查。（D, E）mHRR呼吸测定中进样孔加样示意图（步骤2.4）。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

所有动物实验均按照国家动物实验审查委员会和芬兰南部地区国家行政机构的规定进行。本研究使用雄性 C57BL/6JOlaHsd 小鼠（4-6 月龄）。使用人源细胞系已获得赫尔辛基大学机构伦理委员会的同意。

1. 高分辨率呼吸测定法：基于腔室的呼吸测定仪（cHRR）

注意：本方案此部分的实验使用 Oroboros O2k-Core：Oxygraph-2k（材料表）完成

  1. 氧气传感器的校准
    1. 在 2.1 mL 线粒体呼吸介质（MiR05）中将呼吸仪预运行至 37 °C， 表1，溶解度因子：0.92）用于 >45 分钟，按所述方法进行氧气校准21若基线波动在 ± 4 pmol/s 范围内，则继续进行。
      注意：背景信号出现大幅波动可能表明传感器膜需要维护，或前次实验后呼吸室中残留有抑制剂。建议在进行一批实验前，进行仪器背景氧通量校正。25.
    2. 记录氧气校准值，以长期监测传感器膜的性能。
      注意：这可以揭示传感器功能、信噪比稳定性以及何时需要进行传感器膜维护。根据环境压力的不同，MiR05 中可溶解 180–200 µmol 的氧气。
    3. 在向呼吸介质中加入任何样品之前，先移除腔室中的所有液体。
      注意：定期校准呼吸室的容积，确保精确为 2 mL。
  2. 高分辨率呼吸测定法的细胞制备
    1. 在10 cm培养皿中培养HEK293细胞2 直径培养皿中，使用含高糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并补充10%热灭活胎牛血清（FBS）、GlutaMax、非必需氨基酸和丙酮酸钠22 和尿苷23 在37 °C、5% CO₂的培养箱中支持OXPHOS缺陷型代谢2.
      注意：任何类型的真核细胞均可进行培养。对于大多数细胞类型，培养一个10 cm2 培养皿可获得足够数量的细胞（通常 >3 × 106 细胞。常规检测支原体污染，以避免其对细胞代谢和呼吸作用产生影响。
    2. 细胞培养时，汇合度不得超过90%（图2C).
      注意：具有 >90% 汇合度可能表现出与生长相关的呼吸抑制效应（若细胞未同步化或处于有丝分裂后状态）。
    3. 用 1× PBS 洗涤细胞，加入 1 mL 温热的 0.25% 胰蛋白酶消化使细胞脱落，再加入温热的 DMEM（5 mL/10 cm）终止胰蛋白酶反应2 平板）并使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    4. 轻轻离心细胞悬液，体积为 2.5 x 106 300 × 下的细胞 g 5分钟，完全去除上清液，加入2.5 mL预热的MiR05重悬（1 × 106 细胞/毫升）（图2A).
    5. 对于悬浮细胞，计数后弃去相当于 2.5 x 106 细胞，离心收集沉淀，然后按照步骤1.2.4中所述继续操作。
    6. 运行SUIT方案以优化透化条件（步骤1.6）、透化细胞或组织（步骤1.5）或完整细胞（步骤1.7）
      注意：为获得一致的结果，建议保持细胞浓度恒定（例如，1 x 106 细胞/mL）。尽管在呼吸计中呼吸作用与细胞密度无关24，如果细胞数量保持恒定，则在整个实验过程中底物和抑制剂的浓度相当。
  3. 非纤维组织（如脑、肝）的高分辨率呼吸测定前处理
    1. 切除一块重量为30–40 mg的均质组织，或使用整个器官（本例中为小鼠小脑）。
      注意：如果组织未立即使用，应将其保存在 2 mL 冰冷的 MiR05 溶液中，大多数组织可在此条件下保存长达 2 小时。不同组织的具体保存时间需通过时间序列实验进行评估。
    2. 用Whatman滤纸将组织吸干（注意：软组织容易粘附）。
    3. 将30-40 mg的组织块放入预冷的2 mL聚四氟乙烯玻璃匀浆器中，置于冰上。
    4. 加入适量 MiR05 缓冲液，使组织浓度达到 20 mg/mL，以维持组织与缓冲液的比例。保持总体积 >1.5 mL 和 <2 mL，以避免机械通透化过程中液体量不足或过量。
    5. 插入研杵，通过小心回撤研杵缓慢裂解组织，避免产生真空导致组织过度损伤。
    6. 总共进行7次研磨（1次定义为一上一下各一次），直至细胞裂解（表现为液体浑浊且无明显残渣）图2B).
      注意：每种组织所需的匀浆次数需通过细胞色素C反应（步骤1.5.11）评估线粒体外膜完整性来确定。难以裂解的结缔组织或血管部分可能仍然存在。
    7. 将裂解的组织液倒入15 mL离心管中。
    8. 用裂解步骤中所用的等量 MiR05 缓冲液（例如 1.5 mL）冲洗 Potter 匀浆器内壁，并将冲洗液加入已含有 3–4 mL MiR05 的 15 mL 离心管中，该管中同时含有浓度为 10 mg/mL 的组织裂解物。
    9. 每 chamber 加入 2 mL 普通 MiR05，预热至 37 °C。
    10. 轻轻涡旋混匀试管，以确保均匀分布，然后缓慢吸取每种裂解液各 500 µL（相当于 5 mg）加入每个腔室，以尽量减少从低温到 37 °C 的温度变化带来的应激。
    11. 等待 >关闭培养室前，需等待室内容物升温至37 °C，耗时约3分钟。拔除塞子顶部多余的液体（关闭每个培养室后的液体量为4 mg）。
    12. 运行标准透化SUITE方案（步骤1.5）。
  4. 骨骼肌和心肌纤维组织的高分辨率呼吸测定前处理
    1. 提取硬组织，用尖头镊子在2 mL冰浴的BIOPS溶液中去除肌肉中的结缔组织和脂肪表 2在解剖显微镜下。
    2. 用尖头镊子沿纵轴分离纤维束（约4 mg），充分撕解纤维以获得网状结构（图2B).
      注意：机械性纤维分离和透化成功的标志是红色色素肌红蛋白的流失以及组织透明度的增加。
    3. 用新配制的含皂苷（50 µg/mL）的BIOPS溶液在4 °C下洗涤并透化肌纤维束20分钟（纤维变得半透明，表明已完全透化） 图2B).
    4. 用 MiR05 在 4 °C 下洗涤纤维，每次 5 分钟，共洗涤两次。
    5. 用滤纸吸干后称重，再加入装有 2.1 mL MiR05 的测量室中。
    6. 插入塞子但不完全关闭，然后用 2 mL 纯 O₂ 对腔室进行氧合2 使用20 mL注射器，并通过旋转方式拧紧塞子以封闭腔室。保持O2 实验过程中浓度保持在300-500 µM之间，以避免氧气扩散限制。
  5. 评估细胞或组织常规呼吸的实验方案
    1. 按照步骤1.5.2-1.5.3中所述，将样品加入腔室。
    2. 加入2.3 mL温热的MiR05细胞悬液（标准加入量：1 × 106 细胞/mL（如步骤1.2）或组织2 mg/mL（如步骤1.3）
    3. 骨骼肌和心肌（步骤 1.4）：根据步骤 1.4.4–1.4.6，将约 4 mg 皂苷透化的肌纤维加入预热的 2.3 mL 温热 MiR05 溶液中
    4. 在37 °C、搅拌速度为700 rpm的条件下运行反应室。等待 >3 分钟，使培养基脱气，并通过旋转塞子关闭腔室。Peltier 块稳定表明已达到设定温度。
    5. （可选）将搅拌速度调至300 rpm，使残留气泡通过塞子的毛细管逸出。
    6. 吸除封堵剂上方多余的液体。等待10分钟，直至任何类型的样品均达到稳定的氧通量信号，以记录基础/状态1呼吸。 图1B).
    7. 对于透化细胞和组织的呼吸测量，继续进行步骤 1.6；对于完整细胞，进行步骤 1.8。
  6. 透化细胞或组织中氧化磷酸化分析的实验方案
    1. 使用已裂解（透化）的组织样本，或通过加入 1 µL 皂苷（8.1 mM 皂苷储存液溶于二甲基亚砜（DMSO））使细胞透化，终浓度为 5 µg/mL。荧光信号将下降，并应稳定在 >5 分钟
      警告：皂苷（digitonin）对呼吸道具有急性毒性，皮肤接触或吞食后亦具有急性毒性。
      注意：所有化学试剂的注射均使用精密玻璃注射器进行。每种注射器仅用于指定的化学试剂，以避免交叉污染，使用后须用 ddH₂O 和乙醇彻底清洗。若注射器堵塞，可能需要在温热的 ddH₂O 中进行超声处理。2使用O形环或清洁丝清除任何化学堵塞物。每次操作时，始终将过量的相应储备液吸回注射器，以避免将空气引入腔室。每次注射后检查腔室内部是否引入空气。记录每一步骤，直至通量达到平台期。
    2. 依次快速加入：5 µL 0.4 M 苹果酸（M），终浓度为 1 mM；5 µL 2.0 M 丙酮酸（P，新鲜配制），终浓度为 5 mM；4 µL 2.5 M 谷氨酸（G），终浓度为 5 mM。
    3. 在先前的通量达到平台期后，加入 5 µL（肌肉组织为 10 µL）0.5 M 二磷酸腺苷（ADP，分装后储存于 -80 °C），终浓度为 1.25 mM。
      注意：肌肉等组织可能需要不同的浓度才能达到饱和。
    4. 加入5 µL的4 mM细胞色素C（cytC），使其终浓度为10 µM。
      注意：可选步骤，用于评估细胞透化效果的质量。
    5. 加入16 µL 1.25 M琥珀酸盐（S），终浓度为10 mM。（可选）加入3 µL 0.5 M ADP，终浓度为2 mM，以控制ADP浓度的饱和度。
    6. 对于细胞和非纤维组织，加入 2 µL 的 1 mg/mL 寡霉素（OM），使其终浓度为 1 µg/mL。
      警告：所使用的所有 ETS 抑制剂均具有高毒性。
      注意：寡霉素可能需要滴定以确定最佳浓度，因为它可能抑制电子传递系统（ETS）能力，且在肌肉组织中应省略。当检测肌肉组织时，此处需重新供氧，若使用寡霉素则需注意2 低于 300 µM。
    7. 从2 mM储备液中滴定FCCP，先加入0.6 µL，随后以0.2 µL为步长逐次添加，直至呼吸速率不再升高且呼吸达到最大解偶联状态（理论状态：非偶联）。
    8. 加入1 µL 1 mM 鱼藤酮（ROT），终浓度为0.5 µM。加入2 µL 1 mg/mL 抗霉素（AM）储备液，终浓度为1 µg/mL。
    9. 通过缓慢旋转提升活塞，使各腔室重新充氧，以达到相似的氧气水平（约150 µM）。
    10. 加入5 µL 0.8 M抗坏血酸，使其终浓度为2 mM，随后立即加入5 µL 0.2 M N,N,N′,N′-四甲基对苯二胺（TMPD），使其终浓度为0.5 mM，以检测复合体IV活性（可选）。
    11. 立即加入 5 µL 的 4 M 叠氮化物，使终浓度为 10 mM，以终止峰期 O2 使用TMPD达到最大通量。继续运行实验。 >测定TMPD自氧化以计算复合体IV基础水平，耗时5分钟。
    12. 重新计数细胞以确认上机前的细胞数量，并继续进行步骤1.9。
      注意：仅针对细胞的皂苷透化处理需要在预实验中进行滴定，以达到最大通量且不影响线粒体膜完整性（见步骤1.7）。透化后的样品（尤其是肌肉组织） >由于线粒体外膜受损，细胞色素c添加后呼吸速率增加10%的情况应排除在进一步分析之外。添加乙醇溶解的化学物质后，通量出现短暂下降属于预期现象。
  7. 确定细胞最佳透化条件的实验方案
    1. 按照步骤1.2和1.5.2所述添加细胞。
    2. 取10 µL 10 mg/mL的皂苷素原液，加入10 µL DMSO，稀释至5 mg/mL。
    3. 加入1 µL 鱼藤酮（1 mM 储液）。加入10 µL 琥珀酸（2 mM 储液）和5 µL ADP（0.5 M 储液）。
    4. 用皂苷（每步2.5 mg）反复滴定1 µL，直至呼吸不再进一步增加并达到最大值。
      注意：呼吸作用减弱表明皂苷素浓度过高。
  8. 完整细胞中氧化磷酸化分析方案
    1. 常规呼吸（步骤1.6.1–1.6.6）后，加入2 µL浓度为0.01 mM的寡霉素，使终浓度为10 nM。
    2. 从2 mM储备液中滴定FCCP，先加入0.6 µL，随后以0.2 µL为增量逐步添加，直至呼吸速率不再进一步增加，且呼吸达到最大解偶联状态（理论值：非偶联状态）
    3. 加入1 µL 1 mM 鱼藤酮，终浓度为0.5 µM。加入2 µL 1 mg/mL 抗霉素储存液，终浓度为1 µg/mL。
    4. 通过以旋转动作缓慢提起活塞，将腔室重新充氧至相同氧气水平（约150 µM）。
    5. 加入5 µL 0.8 M抗坏血酸，终浓度为2 mM。立即加入5 µL 0.2 M TMPD，终浓度为0.5 mM，以测定复合体IV活性。
      注意：由于 TMPD 易发生自氧化，因此在进行较大规模实验前应 freshly 配制。即使在 -20 °C 保存，其活性也可能随时间下降。
    6. 立即加入 5 µL 4 M 叠氮化物，使终浓度为 10 mM，以终止峰 O2 使用TMPD达到稳定通量。继续运行 >测定TMPD自氧化以计算复合体IV基础水平，耗时5分钟。
    7. 重新计数细胞以确认上机前的细胞数量，并继续进行步骤1.9。
  9. 运行后样品采集
    1. 从每个腔室（搅拌器保持开启）中准确收集 1 mL MiR05 悬液至 1.5 mL 离心管中。
    2. 以 1000 x g 离心 g 用于透化细胞或在20,000 × g 用于组织裂解液。移除上清液，将沉淀物在 -80 °C 冷冻，以供后续处理（第 3 节）。
  10. SUIT方案分析
    1. 在添加底物或抑制剂后，分析每个平台期的氧通量（pmol/s，归一化至输入量）图1C 和 图3A）。将数值导出至电子表格。
    2. 减去残余氧消耗（ROX， 图1C 和 图3C从每次实验的所有数值中减去背景值。用TMPD值减去叠氮化物残留呼吸值，得到复合体IV呼吸值。
    3. 绘制经细胞归一化的绝对值图3A，B）或组织投入（图 5A，B）。计算通量控制比率（步骤 1.11），或将其归一化至蛋白投入量（图3C).
  11. 通量控制比率计算
    1. 使用通量控制比率（FCR）获取呼吸功能与偶联控制的指数9,26.
      注意：这可以评估线粒体的内在质量，而不受线粒体数量的影响。此外，通量控制比率（FCR）在同一细胞系中具有可比性，可用于试剂的质量控制（相应的 FCR 通过文中标注的编号参考值获得） 图1B- D 和 图3C).
    2. 使用公式1计算氧化磷酸化（OXPHOS）与泄漏呼吸（LEAK）偶联的呼吸控制比。
      公式 1：FCRADP 5/6 = 状态3 / 状态4
    3. 使用公式 2 计算 FCR 以评估 NADH 依赖性呼吸作用
      公式 2：FCR状态3（I） = 3/5 = 状态3（I）/ 状态3（I+II）
    4. 使用公式 3 计算 FCR，以评估琥珀酸依赖性呼吸。
      公式 3：FCR状态3（II） = 8/7 = Srot / ETS容量
    5. 使用公式4计算FCR，以评估耦合与非耦合状态。
      公式 4：FCR偶联/非偶联 = 5/7 = 状态3（I+II）/ ETS容量
    6. 为检测线粒体外膜完整性，使用公式5。
      公式 5：线粒体外膜损伤百分比 = 3/4 = 状态 3 （I） 状态3 （I）与细胞色素c一起

2. 高分辨率呼吸测定法：基于微孔板的呼吸测定仪（mHRR）

注意：本方案此部分的实验使用 Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪（材料表）进行

  1. 细胞培养
    1. 培养任何类型的细胞。可使用贴壁剂（例如胶原蛋白、层粘连蛋白）以促进细胞贴附。此处，HEK293细胞的培养方法同前（步骤1.3）。
    2. 实验前一天，将细胞消化并转移至指定的mHRR 96孔微孔板中，以确保实验当天达到理想的汇合度（80%–100%）（图2C）。
      注意：对于mHRR，微孔板中的细胞密度至关重要。必须考虑不同细胞系的个体生长特性或处理因素对生长的影响，以确保实验当天各组细胞汇合度具有可比性。
  2. 高分辨率呼吸测定前的细胞准备
    1. 接种前充分收集并重悬细胞。
      注意：建议从同一稀释浓度接种重复样本。
    2. 根据各细胞系的生长速率或处理条件下的生长特性进行细胞接种。
      注意：应先在标准96孔微孔板上优化条件，并将所得细胞密度外推至专用的96孔检测微孔板。本实验中，每孔接种7 × 104个HEK293野生型细胞。96孔板的第一列和最后一列用于蛋白定量（图2C）。四个角孔不接种细胞，用于校正实验背景信号。理想情况下，靠近边缘的孔应保持空置，以尽量减少边缘效应（例如因温度变化导致细胞生长速率改变）（图2C，D）。
  3. 传感器板的准备及抑制剂加载
    1. 实验当天，向38.8 mL培养基中加入0.4 mL 1 M葡萄糖、0.4 mL 200 mM谷氨酰胺和0.4 mL 100 mM丙酮酸钠。
      注意：mHRR呼吸检测需使用pH为7.4的无缓冲DMEM培养基。通常，40 mL足以完成一次含一块96孔板的实验。
    2. 将呼吸检测培养基预热至37 °C，并用该培养基洗涤细胞两次（每孔80 µL），替换原有细胞培养基。
    3. 将含细胞的微孔板置于37 °C、无CO2的培养箱中孵育60分钟。
      注意：此步骤至关重要，目的是脱气，因为CO2可能影响呼吸结果，且培养基中的血清在检测过程中可能产生气泡。
    4. 将OM、FCCP、ROT和AM的抑制剂分装液预热至37 °C，并从培养箱中取出传感器板。
    5. 将OM、FCCP、ROT和AM分别用3 mL检测培养基稀释，使各孔终浓度分别为1.5 µM、1.125 µM和1 µM。按图2E所示分别加入不同的加样孔中。
      注意：建议使用多通道移液器填充传感器探头。由于系统通过加压空气注入化合物，每当某一加样孔加入试剂时，所有其他孔必须加入等体积的液体。ROT与AM可合并加入同一孔中。抑制剂可溶于乙醇或DMSO。
    6. 检查各注射孔，确认各孔加样体积均匀一致。
      注意：所有加样孔底部均有通孔用于注射。移动传感器板时应小心操作。如有气泡，可用针头去除。
  4. 完整细胞中氧气消耗检测流程
    1. 实验前一天，执行步骤2.4.2–2.4.7。
    2. 将20 mL校准液分装至50 mL锥形管中。
    3. 打开细胞外通量检测试剂盒，取出内容物。
    4. 将传感器探头倒置放置于校准板旁。向校准板的每个孔中加入200 µL校准液。
    5. 将传感器探头安装至校准板上，注意确保所有传感器均浸没于液体中。
    6. 将该板置于37 °C、无CO2的培养箱中过夜或至少12小时。确认培养箱内湿度足够，以防止校准液蒸发。
    7. 开启微孔板检测系统及计算机，确保次日可正常使用（仪器需至少3小时预热至37 °C方可开始检测）。
      注意：为提高信号稳定性，建议将每个呼吸状态的测量点增加至6次，而非3次测量循环。每次循环包括3分钟混合和3分钟检测。
    8. XF检测当天，执行步骤2.4.9–2.4.20。
    9. 确认细胞培养板的汇合度、细胞形态以及背景孔为空。
    10. 按照步骤2.4.11–2.4.12所述，用已准备好的呼吸检测培养基洗涤细胞。
    11. 每孔保留20 µL培养基，其余吸除。若因过夜蒸发导致原培养基体积为80 µL，则吸除55 µL（约蒸发5 µL）。
    12. 用90 µL检测培养基洗涤细胞两次，最后加入100 µL检测培养基，终体积为120 µL。
      注意：建议使用多通道移液器完成此步骤，以确保所有实验条件下的洗涤程序一致（取决于板的设计）。吸液时，将微孔板倾斜45°角，并将移液枪头置于孔的角落进行液体吸取和加入。洗涤过程中需格外小心，某些细胞可能容易从培养板底部脱落。
    13. 将微孔板置于37 °C、无CO2的培养箱中孵育60分钟。
    14. 从无CO2培养箱中取出已水化的传感器探头板。
    15. 弃去旧的校准液，更换为预热至37 °C的新鲜校准液。
    16. 准备抑制剂和检测培养基（每种抑制剂3 mL，共12 mL检测培养基），并使用移液器储液槽将抑制剂加入加样孔。
    17. 打开软件，运行预设或新建的模板。填写板图，调整滴定浓度和测量循环参数，然后点击开始以启动光学传感器的校准。
    18. 取下已加载的探头盖板，将其放入仪器自动滑出的插槽中，确保微孔板右下角的标记与插槽右下角的三角形对齐。
    19. 点击继续，开始自动校准，持续约20分钟。
    20. 校准完成后，取下含有校准液的校准板。
    21. 取下含细胞的微孔板盖板，在仪器提示时将板放入插槽，点击继续以启动检测运行。
  5. 运行后样品收集
    1. 将微孔板从仪器中取出，小心吸除残留的检测培养基而不扰动细胞，随后将整块板在-80 °C冷冻保存，用于后续处理（第3节）。

3. 使用二辛可宁酸法（BCA 法）测定蛋白质

  1. 在用于蛋白质提取且与BCA法兼容的缓冲液中配制稀释的牛血清白蛋白（BSA）：分别为2 mg/mL、1.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL和0 mg/mL，用于标准曲线的双复孔测定。
  2. 通过在适当的裂解缓冲液（例如RIPA缓冲液）中重悬样品来提取蛋白质：mHRR每孔使用20 µL，cHRR每个沉淀使用100 µL，置于1.5 mL离心管中。
  3. 将含有蛋白裂解物的mHRR板或1.5 mL离心管置于冰上孵育30分钟。
  4. 在4 °C条件下，以20,000 × g 离心1.5 mL离心管中的蛋白裂解物20分钟，然后将上清液转移至新的洁净1.5 mL离心管中。
  5. 在微孔板中，每个样品和标准品各取10 µL，设置双复孔。每孔加入200 µL BCA工作液，并孵育>15分钟。
  6. 使用标准分光光度计在562 nm波长下读取微孔板吸光值，并利用BSA标准曲线计算蛋白质浓度。
  7. 将呼吸测定结果归一化至蛋白质浓度。
    注意：以蛋白质含量进行归一化可验证细胞接种密度或湿重投入量。所提取的蛋白质可用于后续针对电子传递链（ETS）亚基的免疫印迹分析等实验，但不能完全代表原始样本的天然状态（例如磷酸化位点可能丢失）。

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结果

本文提供了用于测定真核细胞、非纤维组织（例如小脑）和纤维组织（例如骨骼肌）中线粒体生物能量的实验方案。对于真核细胞，我们检测了通过CRISPR技术敲除两种与线粒体翻译相关蛋白的HEK293细胞，这些细胞分别表现出多种（CRISPRKO1）和严重/完全的氧化磷酸化缺陷（CRISPRKO2），检测方法采用细胞高分辨率呼吸测定（cHRR）（图3A-C）或线粒体高分辨率呼吸测定（mHRR）（图3A-D）。

对于细胞全高分辨率呼吸（cHRR），HEK293细胞经皂苷透化处理后，按照标准方案（步骤1.5–1.6）进行呼吸实验，并成功记录结果（图3A）。与野生型（WT）相比，在归一化至细胞输入量后，CRISPRKO1表现...

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讨论

传统上，线粒体生物能量学 研究主要采用克拉克型氧电极。然而，由于其分辨率和通量较低，亟需技术进步。迄今为止，O2k（称为cHRR）和Seahorse XF96细胞能量代谢分析仪（称为mHRR）已在细胞生物能量学领域得到广泛应用。本文提供了一套全面且易于理解的实验方案，用于通过cHRR或mHRR评估线粒体呼吸来分析细胞能量代谢，讨论了每种设备的主要优势，并提供了实用的操作指导。本文所述方案涵盖哺乳动物细胞、纤维状（坚硬）组织（如骨骼肌和心肌）以及非纤维状（柔软）组织（如脑和肝），并适用于类似类型的样品材料。

尽管两种高分辨率呼吸测定法（HRR）在具有多种氧化磷酸化缺陷的HEK293细胞中所得数据具有可比性，但其基本工作原理和设备技术配置使其适用于不同的应用场景。微孔板式高分辨率呼吸测定（mHRR）系统支持自动化数据采集，具备高通量能力，可采用24孔或96孔板设计，所需样品量极少。然而，由于实验体积小、孔表面积有限，并使用了透氧性聚合物（如聚苯乙烯），可能导致孔内变异度较高（尤其是在96孔板设置中），因此建议每种条件至少使用≥6个复孔以获得可重复的结果。与基于传统极谱氧传感器...

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致谢

本工作获得了芬兰科学院（C.B.J）、马格努斯·埃伦罗特基金会（C.B.J）以及综合生命科学研究生院博士奖学金（R.A.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 mL Potter-Elvehjem 玻璃/聚四氟乙烯组织研磨器/匀浆器Omni International07-358029
95% O2, 5% CO2 医用气体混合物用于组织研磨的 Potter 匀浆器
ADPSigmaA 4386
抗霉素 ASigmaA 8674化学试剂
抗坏血酸MerckPHR1279-1G化学试剂，溶于乙醇
BSA（无脂肪酸）SigmaA 6003化学试剂
CaCO3SigmaC 4830化学试剂
细胞色素 cSigmaC 7752化学试剂
皂苷SigmaD 5628化学试剂
二硫苏糖醇SigmaD 0632化学试剂，溶于 DMSO
D-蔗糖Roth4621.1化学试剂
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（高葡萄糖）Fisher Scientific41965-039化学试剂
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 （无葡萄糖）Fisher ScientificA14430-01
EGTASigmaE 4378
依托莫西尔SigmaE1905化学试剂
Falcon 15 ml 圆锥形离心管Fisher ScientificAM12500化学试剂
Falcon 50 ml 圆锥形离心管Fisher ScientificAM12501
FCCPSigmaC 2920
葡萄糖SigmaG7021化学试剂，溶于乙醇
谷氨酸SigmaG 1626化学试剂
GlutaMax (100x) (200 nM L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽)Fisher Scientific35050061化学试剂
HEK293 细胞ATTCCRL-1573
血细胞计数板Fisher Scientific0267151B细胞计数仪器
HepesSigmaH 7523化学试剂
咪唑Fluka56750化学试剂
KClMerck1.04936化学试剂
L-肉碱SigmaC0283化学试剂
苹果酸SigmaM 1000化学试剂
MES 水合物SigmaM8250化学试剂
MgCl2SigmaM 9272化学试剂
Na2ATPSigmaA 2383化学试剂
Na2磷酸肌酸SigmaP 7936化学试剂
Na-丙酮酸盐 (100 mM) (100x)Fisher Scientific11360070
NEAA （非必需氨基酸）100xFisher Scientific11140035
正常 FBS (10x)Fisher Scientific10500064
O2k-Core：Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02高分辨率呼吸测定仪
O2k-滴定装置Oroboros Instruments20820-03用于化学试剂注射的汉密尔顿注射器
寡霉素SigmaO 4876化学试剂，溶于乙醇
棕榈酰肉碱SigmaP 4509化学试剂
青霉素-链霉素Fisher Scientific15140122
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒Fisher Scientific23227
丙酮酸SigmaP 2256化学试剂
RIPA 缓冲液Fisher Scientific89900化学试剂
鱼藤酮SigmaR 8875化学试剂，溶于乙醇
皂素SigmaS7900化学试剂

Seahorse XF DMEM 检测培养基套装，pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		103680-100
Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪
Agilent, Santa Clara, CA		高通量呼吸测定仪
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA
包含检测板、检测盒、化合物转移至检测盒的加载引导工具以及校准液。
小型剪刀Fisher Scientific08-951-20
叠氮化钠SigmaS2002化学试剂
琥珀酸SigmaS 2378化学试剂
牛磺酸SigmaT 8691化学试剂
TMPDSigmaT 3134化学试剂
台盼蓝溶液Merck72-57-1化学试剂
0.25% EDTA 胰蛋白酶Fisher Scientific25200056
两把细刃镊子Fisher Scientific12-000-122
尿苷储备液 (500x)SigmaU3750化学试剂

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线粒体生物能量学氧气消耗氧化磷酸化基于腔室的呼吸测定法基于培养板的呼吸测定法底物-解偶联剂-抑制剂CRISPR HEK293细胞氧化磷酸化缺陷细胞外酸化
使用腔室型和板式呼吸仪通过高分辨率呼吸测定法评估细胞和组织的生物能量学
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