使用腔室型和板式呼吸仪通过高分辨率呼吸测定法评估细胞和组织的生物能量学

摘要

利用高分辨率呼吸测量仪评估氧化磷酸化已成为线粒体功能及细胞能量代谢分析的重要组成部分。本文介绍了使用腔室型和微孔板型高分辨率呼吸测量仪分析细胞能量代谢的实验方案，并讨论了每种设备的主要优势。

摘要

高分辨率呼吸测定法（HRR）可实时监测氧化磷酸化过程，用于分析单个细胞的能量状态，并通过多样化的底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）方案评估呼吸链复合物。本文展示了两种高分辨率呼吸测定仪的使用方法，并提供了一系列适用于培养细胞、骨骼肌和心肌纤维以及脑、肝等软组织分析的基础实验方案。针对培养细胞和组织的方案分别适用于基于腔室的呼吸测定仪，而培养细胞的方案也适用于基于微孔板的呼吸测定仪，两者均包含标准呼吸测定流程。为便于比较，本研究使用CRISPR基因编辑技术构建的线粒体翻译缺陷型HEK293细胞（导致多种呼吸系统缺陷），在两种设备上进行实验，以展示细胞呼吸功能的缺陷。两种呼吸测定仪均可对细胞呼吸进行全面测量，其各自的技术优势和适用性取决于具体的研究问题和研究模型。

引言

线粒体承担着关键的能量供应功能，是一种区室化的细胞器，参与多种重要的细胞生物能量学和代谢过程，如核苷酸、脂质和氨基酸的合成、铁硫簇的生成，并涉及细胞信号传导，例如调控细胞程序性死亡^1,2,3。通过氧化磷酸化实现的线粒体生物能量学过程几乎参与细胞内所有生命活动，因此，原发性或继发性线粒体功能障碍与多种疾病状态密切相关^4,5。线粒体功能障碍不仅涉及线粒体结构或密度的改变，还包括呼吸系统的质量及其调控的异常⁶。这种定性层面的异常涵盖底物调控、偶联特性、翻译后修饰、嵴结构动态变化以及呼吸链超复合体的形成与功能^7,8。因此，在健康与疾病状态下，对线粒体生物能量学进行准确分析，对于实验研究和临床诊断中评估细胞能量代谢具有重要意义。

线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）是呼吸系统或电子传递系统（ETS）内一系列反应，通过三磷酸腺苷（ATP）生成细胞能量⁹。该多酶促步骤通过电子从复合物....

方案

所有动物实验均按照国家动物实验审查委员会和芬兰南部地区国家行政机构的规定进行。本研究使用雄性 C57BL/6JOlaHsd 小鼠（4-6 月龄）。使用人源细胞系已获得赫尔辛基大学机构伦理委员会的同意。

1. 高分辨率呼吸测定法：基于腔室的呼吸测定仪（cHRR）

注意：本方案此部分的实验使用 Oroboros O2k-Core：Oxygraph-2k（材料表）完成

1. 氧气传感器的校准
   1. 在 2.1 mL 线粒体呼吸介质（MiR05）中将呼吸仪预运行至 37 °C， 表1，溶解度因子：0.92）用于 >45 分钟，按所述方法进行氧气校准²¹若基线波动在 ± 4 pmol/s 范围内，则继续进行。
      注意：背景信号出现大幅波动可能表明传感器膜需要维护，或前次实验后呼吸室中残留有抑制剂。建议在进行一批实验前，进行仪器背景氧通量校正。²⁵.
   2. 记录氧气校准值，以长期监测传感器膜的性能。
      注意：这可以揭示传感器功能、信噪比稳定性以及何时需要进行传感器膜维护。根据环境压力的不同，MiR05 中可溶解 180–200 µmol 的氧气。

结果

本文提供了用于测定真核细胞、非纤维组织（例如小脑）和纤维组织（例如骨骼肌）中线粒体生物能量的实验方案。对于真核细胞，我们检测了通过CRISPR技术敲除两种与线粒体翻译相关蛋白的HEK293细胞，这些细胞分别表现出多种（CRISPR^KO1）和严重/完全的氧化磷酸化缺陷（CRISPR^KO2），检测方法采用细胞高分辨率呼吸测定（cHRR）（图3A-C）或线粒体高分辨率呼吸测定（mHRR）（图3A-D）。

对于细胞全高分辨率呼吸（cHRR），HEK293细胞经皂苷透化处理后，按照标准方案（步骤1.5–1.6）进行呼吸实验，并成功记录结果（图3A）。与野生型（WT）相比，在归一化至细胞输入量后，CRISPR^KO1表现.......

讨论

传统上，线粒体生物能量学 研究主要采用克拉克型氧电极。然而，由于其分辨率和通量较低，亟需技术进步。迄今为止，O2k（称为cHRR）和Seahorse XF96细胞能量代谢分析仪（称为mHRR）已在细胞生物能量学领域得到广泛应用。本文提供了一套全面且易于理解的实验方案，用于通过cHRR或mHRR评估线粒体呼吸来分析细胞能量代谢，讨论了每种设备的主要优势，并提供了实用的操作指导。本文所述方案涵盖哺乳动物细胞、纤维状（坚硬）组织（如骨骼肌和心肌）以及非纤维状（柔软）组织（如脑和肝），并适用于类似类型的样品材料。

尽管两种高分辨率呼吸测定法（HRR）在具有多种氧化磷酸化缺陷的HEK293细胞中所得数据具有可比性，但其基本工作原理和设备技术配置使其适用于不同的应用场景。微孔板式高分辨率呼吸测定（mHRR）系统支持自动化数据采集，具备高通量能力，可采用24孔或96孔板设计，所需样品量极少。然而，由于实验体积小、孔表面积有限，并使用了透氧性聚合物（如聚苯乙烯），可能导致孔内变异度较高（尤其是在96孔板设置中），因此建议每种条件至少使用≥6个复孔以获得可重复的结果。与基于传统极谱氧传感器.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mL Potter-Elvehjem 玻璃/聚四氟乙烯组织研磨器/匀浆器	Omni International	07-358029
95% O2, 5% CO2 医用气体混合物			用于组织研磨的 Potter 匀浆器
ADP	Sigma	A 4386
抗霉素 A	Sigma	A 8674	化学试剂
抗坏血酸	Merck	PHR1279-1G	化学试剂，溶于乙醇
BSA（无脂肪酸）	Sigma	A 6003	化学试剂
CaCO3	Sigma	C 4830	化学试剂
细胞色素 c	Sigma	C 7752	化学试剂
皂苷	Sigma	D 5628	化学试剂
二硫苏糖醇	Sigma	D 0632	化学试剂，溶于 DMSO
D-蔗糖	Roth	4621.1	化学试剂
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（高葡萄糖）	Fisher Scientific	41965-039	化学试剂
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 （无葡萄糖）	Fisher Scientific	A14430-01
EGTA	Sigma	E 4378
依托莫西尔	Sigma	E1905	化学试剂
Falcon 15 ml 圆锥形离心管	Fisher Scientific	AM12500	化学试剂
Falcon 50 ml 圆锥形离心管	Fisher Scientific	AM12501
FCCP	Sigma	C 2920
葡萄糖	Sigma	G7021	化学试剂，溶于乙醇
谷氨酸	Sigma	G 1626	化学试剂
GlutaMax (100x) (200 nM L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽)	Fisher Scientific	35050061	化学试剂
HEK293 细胞	ATTC	CRL-1573
血细胞计数板	Fisher Scientific	0267151B	细胞计数仪器
Hepes	Sigma	H 7523	化学试剂
咪唑	Fluka	56750	化学试剂
KCl	Merck	1.04936	化学试剂
L-肉碱	Sigma	C0283	化学试剂
苹果酸	Sigma	M 1000	化学试剂
MES 水合物	Sigma	M8250	化学试剂
MgCl2	Sigma	M 9272	化学试剂
Na2ATP	Sigma	A 2383	化学试剂
Na2磷酸肌酸	Sigma	P 7936	化学试剂
Na-丙酮酸盐 (100 mM) (100x)	Fisher Scientific	11360070
NEAA （非必需氨基酸）100x	Fisher Scientific	11140035
正常 FBS (10x)	Fisher Scientific	10500064
O2k-Core：Oxygraph-2k	Oroboros Instruments	10000-02	高分辨率呼吸测定仪
O2k-滴定装置	Oroboros Instruments	20820-03	用于化学试剂注射的汉密尔顿注射器
寡霉素	Sigma	O 4876	化学试剂，溶于乙醇
棕榈酰肉碱	Sigma	P 4509	化学试剂
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	15140122
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Fisher Scientific	23227
丙酮酸	Sigma	P 2256	化学试剂
RIPA 缓冲液	Fisher Scientific	89900	化学试剂
鱼藤酮	Sigma	R 8875	化学试剂，溶于乙醇
皂素	Sigma	S7900	化学试剂
Seahorse XF DMEM 检测培养基套装，pH 7.4	Agilent, Santa Clara, CA	103680-100
Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪	Agilent, Santa Clara, CA		高通量呼吸测定仪
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent, Santa Clara, CA		包含检测板、检测盒、化合物转移至检测盒的加载引导工具以及校准液。
小型剪刀	Fisher Scientific	08-951-20
叠氮化钠	Sigma	S2002	化学试剂
琥珀酸	Sigma	S 2378	化学试剂
牛磺酸	Sigma	T 8691	化学试剂
TMPD	Sigma	T 3134	化学试剂
台盼蓝溶液	Merck	72-57-1	化学试剂
0.25% EDTA 胰蛋白酶	Fisher Scientific	25200056
两把细刃镊子	Fisher Scientific	12-000-122
尿苷储备液 (500x)	Sigma	U3750	化学试剂