牛初乳既是新生犊牛的主要营养来源，也是其免疫支持的重要物质。了解牛初乳中治疗性蛋白质（乳铁蛋白和IgG）的含量，对于将其用于人类消费时的剂量确定和标准化具有重要意义。
本文内容
摘要
摘要
初乳是一种哺乳动物在分娩后立即产生的复杂生物液体。它富含宏量和微量营养素、生物活性肽及生长因子，能够满足新生儿的全部营养需求。牛初乳因其富含蛋白质，包括免疫球蛋白G（IgG）和乳铁蛋白，也具有作为营养和生物活性物质来源的潜力。然而，在泌乳期间，牛初乳中乳铁蛋白和IgG的含量会发生显著变化。因此，监测IgG和乳铁蛋白的浓度，以评估牛初乳作为蛋白质来源的应用价值，是一个重要的研究课题。本文所述方法介绍了如何测定蛋白质含量以及乳铁蛋白和IgG的特定浓度，包括以下步骤：牛初乳蛋白质的分离、蛋白质浓度的测定 通过 二辛可宁酸法（BCA），蛋白质可视化 通过 SDS-PAGE、ELISA法测定乳铁蛋白和IgG浓度
引言
初乳是哺乳动物在分娩后不久由乳腺产生的最初分泌物。初乳富含宏量和微量营养素、抗菌肽以及生长因子1,2,3,4。其成分随时间逐渐变化，经历向成熟乳的过渡过程5,6,7，但在分娩后24小时内变化最为显著8。初乳的成分还受到母体因素的影响，包括年龄、胎次、品种、健康状况和营养状态，以及外部因素，如季节、早产、过早泌乳、初乳处理方式（混合初乳和储存温度）以及引产等9,10,11。与成熟乳相比，初乳含有较少的乳糖，而脂肪、蛋白质、肽类、非蛋白氮、灰分、激素、生长因子、细胞因子、核苷酸、维生素和矿物质含量更高12。牛初乳含有多种蛋白质，包括免疫球蛋白、乳铁蛋白、α-乳白蛋白（α-LA）、β-乳球蛋白（β-Lg）、乳过氧化物酶以....
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方案
在7月至8月期间，从土耳其恰纳卡莱的乌鲁奥瓦乳品贸易公司选取28头荷斯坦奶牛，在产后第1至第6天的中午采集初乳样品，并进行深冻保存。同一天采集的样品按日期混合成池，测定其总蛋白、乳铁蛋白和IgG浓度。所有样品均进行双复孔检测。
1. 样品制备
- 将200 µL牛初乳与400 µL dH₂O混合2O 以获得稀释样品用于分析。根据需要稀释所有样品。
- 在 4 °C 下以 1000 x g 离心稀释和未稀释的样品 g 30分钟。
- 将中间相转移至适当标记的新离心管中。重复步骤1.2，以获得澄清的中间相。若不立即使用，将全部中间相和稀释后的样品于-20 °C保存。
- 使用稀释样品获得的中间相进行BCA、SDS-PAGE和乳铁蛋白检测。收集未稀释样品的中间相用于IgG检测。
- 为确保检测值落在标准曲线范围内，需为每个样本制备相应的稀释液。将稀释样本所得的各中层相按1:300稀释用于BCA检测，按1:30,000稀释用于乳铁蛋白（Lactoferrin）检测；将未稀释样本所得的各中层相按1:400,000稀释用于IgG检测。
注意：稀释倍数根据吸光度值和标准曲线确定。
2. 使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度
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结果
按照方案，对牛初乳样品进行分析，以测定蛋白质、乳铁蛋白和IgG浓度。牛初乳中蛋白质、乳铁蛋白和IgG分析结果见表4。
表4：牛初乳中蛋白质、乳铁蛋白和IgG的浓度。
| 牛初乳 | |||
| 天数 | 蛋白质 (mg/mL) | 乳铁蛋白 (mg/mL) | IgG (mg/mL) |
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讨论
本研究提供了关于初乳向成熟乳过渡过程中乳铁蛋白和IgG浓度发生显著变化的信息。采用夹心ELISA法检测乳铁蛋白和IgG浓度的变化，总蛋白浓度则通过BCA法进行分析。结果表明，早期初乳中蛋白质、乳铁蛋白和IgG的浓度最高，随后在接下来的3天内逐渐下降。准确测定这些蛋白质的含量对于初乳在乳制品（如酸奶50,51、乳饮料、黄油52、冰淇淋53和发酵乳54）生产中的应用具有重要意义。牛初乳中的生物活性蛋白（如乳铁蛋白、溶菌酶和免疫球蛋白）也广泛应用于制药工业55。本文表明，牛初乳的组成随时间发生显著变化。因此，高效且可靠的检测方法对于评估牛初乳及其衍生的生物活性成分在功能性食品和制药工业中的应用至关重要。
由于BCA法和ELISA具有高检测灵敏度，它们是分子生物学中常用的技术
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由乌卢奥瓦乳品贸易有限公司（Uluova Süt Ticaret A.Ş）资助。RMD 和 BMH 为致力于恢复婴儿微生物组的公司 Evolve BioSystems 的员工。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10X 运行缓冲液（Tris-甘氨酸-SDS） | ClearBand | TGS10 | SDS-Page 分析 |
| 2-巯基乙醇 | gibco | 31350-010 | SDS-Page 分析 |
| 冰醋酸 | Isolab | 901,013,2500 | SDS-Page 分析 |
| 牛IgG ELISA试剂盒 | Aviva Systems Biology | OKIA00005 | 测定IgG浓度 |
| 牛乳铁蛋白（LF / LTF / Lactoferrin）ELISA试剂盒 | LSBio Lifespan Biosciences | LS-F4884 | 测定乳铁蛋白浓度 |
| 考马斯亮蓝R 250 | amresco | 0472-25G | SDS-Page 分析 |
| 发烟盐酸 37% | Isolab | 932,103,2501 | SDS-Page 分析 |
| 异丙醇 | Isolab | 961,023,2500 | SDS-Page 分析 |
| Laemmli 样品缓冲液（2X） | ClearBand | LSB-2x | SDS-Page 分析 |
| 甲醇 | Isolab | 947,046,2500 | SDS-Page 分析 |
| PageRuler Plus 预染蛋白Marker 10至250 | Thermo Scientific | 26619 | SDS-Page 分析 |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | 测定蛋白浓度 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | BioShop | SDS001.500 | SDS-Page 分析 |
| SureCast 丙烯酰胺溶液 40%（w/v） | Invitrogen | HC2040 | SDS-Page 分析 |
| SureCast 过硫酸铵（APS） | Thermo Scientific | 17874 | SDS-Page 分析 |
| SureCast 四甲基乙二胺（TEMED） | Invitrogen | HC2006 | SDS-Page 分析 |
| TECAN Infinite M200 酶标仪 | Tecan | 30035094 | 吸光度测定 |
| Tris 碱 | BioShop | TRS001.1 | SDS-Page 分析 |
参考文献
- Kehoe, S. I., Jayarao, B. M., Heinrichs, A. J. A survey of bovine colostrum composition and colostrum management practices on Pennsylvania dairy farms. Journal of Dairy Science. 90 (9), 4108-4116 (2007).
- Levieux, D., Ollier, A.
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