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测定牛初乳中的总蛋白和生物活性蛋白浓度

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DOI：

10.3791/63001

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2021年12月10日

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1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, Reno, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, Lincoln, 5Evolve BioSystems Inc.

本文内容

摘要

牛初乳既是新生犊牛的主要营养来源，也是其免疫支持的重要物质。了解牛初乳中治疗性蛋白质（乳铁蛋白和IgG）的含量，对于将其用于人类消费时的剂量确定和标准化具有重要意义。

摘要

初乳是一种哺乳动物在分娩后立即产生的复杂生物液体。它富含宏量和微量营养素、生物活性肽及生长因子，能够满足新生儿的全部营养需求。牛初乳因其富含蛋白质，包括免疫球蛋白G（IgG）和乳铁蛋白，也具有作为营养和生物活性物质来源的潜力。然而，在泌乳期间，牛初乳中乳铁蛋白和IgG的含量会发生显著变化。因此，监测IgG和乳铁蛋白的浓度，以评估牛初乳作为蛋白质来源的应用价值，是一个重要的研究课题。本文所述方法介绍了如何测定蛋白质含量以及乳铁蛋白和IgG的特定浓度，包括以下步骤：牛初乳蛋白质的分离、蛋白质浓度的测定 通过 二辛可宁酸法（BCA），蛋白质可视化 通过 SDS-PAGE、ELISA法测定乳铁蛋白和IgG浓度

引言

初乳是哺乳动物在分娩后不久由乳腺产生的最初分泌物。初乳富含宏量和微量营养素、抗菌肽以及生长因子1,2,3,4。其成分随时间逐渐变化，经历向成熟乳的过渡过程5,6,7，但在分娩后24小时内变化最为显著8。初乳的成分还受到母体因素的影响，包括年龄、胎次、品种、健康状况和营养状态，以及外部因素，如季节、早产、过早泌乳、初乳处理方式（混合初乳和储存温度）以及引产等9,10,11。与成熟乳相比，初乳含有较少的乳糖，而脂肪、蛋白质、肽类、非蛋白氮、灰分、激素、生长因子、细胞因子、核苷酸、维生素和矿物质含量更高12。牛初乳含有多种蛋白质，包括免疫球蛋白、乳铁蛋白、α-乳白蛋白（α-LA）、β-乳球蛋白（β-Lg）、乳过氧化物酶以及多种生长因子13。牛初乳的总蛋白浓度范围为11.26 mg/mL至169.55 mg/mL14。蛋白质成分中乳清蛋白和酪蛋白的平均浓度分别为124.00 mg/mL和26.00 mg/mL15。乳清部分包含三种主要类型的免疫球蛋白（Igs）：IgG（85%–90%）、IgM（7%）和IgA（5%）16。牛初乳中的主要免疫球蛋白是IgG，其可为犊牛提供被动免疫，并调节其适应性免疫系统和先天免疫系统17。首次挤奶所得牛初乳的初始免疫球蛋白浓度可在20至200 mg/mL之间，随后逐渐下降至约0.4–1.0 mg/mL18。IgG的平均浓度约为60 mg/mL，在向成熟乳过渡的过程中持续下降，最终降至1 mg/mL以下19。

初乳中的另一种重要生物活性蛋白是乳铁蛋白，它是一种铁结合糖蛋白，浓度为1.5–5 mg/mL。乳铁蛋白的特性包括增强铁吸收、具有抗菌活性20,21、结合脂多糖、免疫调节作用，以及促进肠道上皮细胞和成纤维细胞的生长22。牛初乳还含有α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。这些蛋白质是必需氨基酸的来源，同时也具有杀菌活性23,24,25。初乳中α-LA和β-Lg的平均浓度分别为2.77 mg/mL2和11.5 mg/mL26。随后，在成熟乳中，这些浓度分别下降至1–1.5 mg/mL27和4.8 mg/mL26。初乳还含有大量乳过氧化物酶（平均22.8 µg/mL）和溶菌酶（平均0.40 µg/mL）26。乳过氧化物酶是一种糖蛋白，可通过产生活性氧物种对革兰氏阳性菌和阴性菌发挥抗菌活性28。溶菌酶通过裂解细菌细胞壁中的肽聚糖成分发挥抗菌作用，从而导致细胞死亡29,30。

由于其特性，IgG 和乳铁蛋白被加工成多种食品，用于强化婴儿配方食品、膳食补充剂、康复期患者和运动员用高蛋白制剂，以及用于药理学和美容学31,32,33。牛初乳是 IgG 和乳铁蛋白的重要来源。然而，这些生物活性蛋白在牛初乳中的组成在泌乳期内会发生显著变化。因此，监测用于研究和食品加工的初乳样品中这些生物活性蛋白浓度的变化至关重要。本研究旨在描述产犊后6天内牛初乳中总蛋白、乳铁蛋白和IgG浓度及其组成的监测方法。

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方案

在7月至8月期间，从土耳其恰纳卡莱的乌鲁奥瓦乳品贸易公司选取28头荷斯坦奶牛，在产后第1至第6天的中午采集初乳样品，并进行深冻保存。同一天采集的样品按日期混合成池，测定其总蛋白、乳铁蛋白和IgG浓度。所有样品均进行双复孔检测。

1. 样品制备

  1. 将200 µL牛初乳与400 µL dH₂O混合2O 以获得稀释样品用于分析。根据需要稀释所有样品。
  2. 在 4 °C 下以 1000 x g 离心稀释和未稀释的样品 g 30分钟。
  3. 将中间相转移至适当标记的新离心管中。重复步骤1.2，以获得澄清的中间相。若不立即使用，将全部中间相和稀释后的样品于-20 °C保存。
  4. 使用稀释样品获得的中间相进行BCA、SDS-PAGE和乳铁蛋白检测。收集未稀释样品的中间相用于IgG检测。
  5. 为确保检测值落在标准曲线范围内，需为每个样本制备相应的稀释液。将稀释样本所得的各中层相按1:300稀释用于BCA检测，按1:30,000稀释用于乳铁蛋白（Lactoferrin）检测；将未稀释样本所得的各中层相按1:400,000稀释用于IgG检测。
    注意：稀释倍数根据吸光度值和标准曲线确定。

2. 使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度

  1. 标准品和试剂的准备
    1. 使用市售试剂盒中提供的试剂（参见材料表）进行检测：BCA试剂A，含有碳酸钠、碳酸氢钠、双辛可宁酸和酒石酸钠的0.1 M氢氧化钠溶液；BCA试剂B，含有4%硫酸铜。白蛋白（BSA）标准品，含有2.0 mg/mL牛血清白蛋白的0.9%生理盐水溶液，并含0.05%叠氮化钠。
    2. 将所有样品和蛋白标准品平衡至室温（RT）。
    3. 按50:1的比例混合试剂A与试剂B，配制足够体积的工作液（WR）。每个样品和标准品需200 µL工作液。
    4. 根据以下稀释方案（表1）配制稀释的白蛋白（BSA）标准品，使其最终BSA浓度工作范围为20–2,000 µg/mL。使用dH2O作为稀释液。

表1： BSA标准品的稀释方案。

样品瓶稀释剂体积 (µL)BSA 体积及来源 (µL)最终 BSA 浓度 (µg/mL)
A0300 µL 原液2000
B125375 µL 原液1500
C325325 µL 原液1000
D175175 µL B 瓶稀释液750
E325325 µL C 瓶稀释液500
F325325 µL E 瓶稀释液250
G325325 µL F 瓶稀释液125
H400100 µL G 瓶稀释液25
I40000 = 空白
  1. BCA 法检测步骤
    1. 将每种 BCA 标准品或样品各 25 µL 转移至 96 孔板中。向含有标准品或样品的每个孔中加入 200 µL 工作试剂（WR）。在板式振荡器上充分混匀 30 秒。
    2. 用酶标板封板膜覆盖酶标板，于 37 °C 孵育 30 分钟。孵育结束后，将反应体系在室温下平衡约 10 分钟。使用酶标仪及其配套软件在 562 nm 处读取每块板的吸光值。
  2. 绘制标准曲线并确定结果
    1. 记录标准品和样品的吸光度值。标准品稀释系列请参见 表 1。从各标准品和样品的吸光度值中减去标准空白孔的吸光度值。对每个标准品和样品的重复孔读数取平均值，以估算总蛋白浓度。
    2. 通过将各标准品校正后的平均吸光度值作为横坐标（x 轴），浓度作为纵坐标（y 轴），绘制标准曲线。使用具备四参数拟合功能的适当软件绘制线性曲线。
    3. 利用标准曲线，通过内插法根据样品的响应值确定其浓度。乘以稀释倍数（步骤 1.5）以获得样品的实际浓度。

3. 使用 SDS-PAGE 检测法对蛋白质进行可视化

  1. 样品和溶液的制备
    1. 配制储备溶液
      1. 配制10% (w/v) SDS、1.5 M Tris-HCl pH 8.3、0.5 M Tris-HCl pH 6.8、10% (w/v) 过硫酸铵（APS）溶液（现配现用）。
      2. (w/v) SDS：称取1 g SDS，加入10 mL dH2O。
      3. M Tris-HCl pH 8.8：称取18.15 g Tris，溶于约60 mL dH2O中，用HCl调节pH至8.8，再加dH2O定容至100 mL。
      4. M Tris-HCl pH 6.8：称取6.00 g Tris，溶于约60 mL dH2O中，用HCl调节pH至6.8，再加dH2O定容至100 mL。
      5. APS：称取15 mg APS，加入150 µL dH2O。
        注意：丙烯酰胺和SDS具有毒性且有害。请佩戴防护手套并在通风橱中操作。
    2. 在950 µL 2x SDS-PAGE上样缓冲液中加入50 µL β-巯基乙醇，配制样品缓冲液。
      注意：β-巯基乙醇吸入后有毒。请佩戴防护手套并在通风橱中操作。
    3. 将100 mL 10x Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液与900 mL dH2O混合，配制电泳缓冲液。
    4. 配制染色液（45% dH2O、45% 甲醇、10% 冰醋酸、2 g 考马斯亮蓝R）。
    5. 配制脱色液（50% dH2O、40% 甲醇、10% 冰醋酸）。
  2. 凝胶的制备
    1. 准备电泳装置，包括凝胶夹板、电源、电极和电缆。用乙醇清洁玻璃板并组装成夹心结构，确保玻璃板和垫片的下边缘对齐。
    2. 配制分离胶混合液：3.5 mL dH2O、2.4 mL 40% 丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺、2 mL 1.5 M Tris-HCl、100 µL 10% (w/v) SDS、80 µL 10% APS、8 µL N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）。
      注意：TEMED具有毒性或刺激性。请佩戴防护手套并在通风橱中操作。
    3. 将分离胶混合液倒入玻璃板之间，液面高度距离较短玻璃板顶部约1-1.5 cm。
    4. 在分离胶上层覆盖异丙醇，以去除凝胶顶部的气泡并防止聚合后的凝胶干燥。
    5. 待分离胶聚合至少15分钟后，倒掉上层异丙醇。
    6. 配制浓缩胶混合液：1.92 mL dH2O、300 µL 40% 丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺、750 µL 0.5 M Tris-HCl、100 µL 10% (w/v) SDS、30 µL 10% APS、3 µL TEMED。
    7. 将浓缩胶混合液加至分离胶上方，填满玻璃板间隙，插入梳子至垫片顶部。
    8. 室温下静置约15分钟，使浓缩胶完全聚合。
  3. 电泳运行
    1. 将凝胶固定在电极装置上，向装置的上下电泳槽中加入新配制的1x Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液。
    2. 小心拔出梳子。
    3. 在凝胶孔中加入5 µL蛋白分子量标准（10-250 kDa）和8 µL稀释后样品的中间相。先以80 V电压运行，待染料进入分离胶后，提高电压至120 V，直至染料迁移至凝胶底部，随后关闭电源。
  4. 凝胶染色与脱色
    1. 电泳结束后，从装置中取出凝胶，移除垫片和玻璃板，将凝胶放入小型托盘中。
    2. 加入染色液（步骤3.1.4）进行染色，55 rpm轻柔摇动30分钟。
    3. 倒掉染色液，用少量脱色液冲洗凝胶并弃去废液。
    4. 加入足量脱色液覆盖凝胶，轻柔摇动脱色约1小时，直至蛋白条带清晰可见。

4. 使用牛乳铁蛋白ELISA法测定乳铁蛋白浓度

  1. 标准品和试剂的准备
    1. 本实验使用市售的牛乳铁蛋白（Bovine LF/LTF/Lactoferrin）ELISA试剂盒。
    2. 将所有样品和标准品平衡至室温（RT）。
    3. 配制足够体积的检测试剂A和检测试剂B工作液，用于与捕获的抗原结合。
    4. 分别使用测定稀释液A和稀释液B将检测试剂A和检测试剂B按1:100的比例稀释。
    5. 用去离子水（dH2O）将30倍浓缩洗涤液稀释，配制成1倍工作浓度的洗涤缓冲液。
    6. 取适量3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液置于无菌微量离心管中。
    7. 将一管冻干标准品（100 ng/mL）用0.5 mL样品稀释液重悬，并在室温下轻轻振荡孵育10分钟。短暂离心以确保所有冻干粉末沉降至管底。
    8. 根据以下稀释方案（表2）配制标准品的系列稀释液。

表2： 牛乳铁蛋白标准品的稀释方案。

小瓶稀释液体积 (µL)Lf 体积及来源 (µL)最终 Lf 浓度 (ng/mL)
D10500 µL 原液100
D2250250 来自 D1 小瓶的稀释液50
D3250250 来自 D2 小瓶的稀释液25
D4250250 来自 D3 小瓶的稀释液12.5
D5250250 来自 D4 小瓶的稀释液6.25
D6250250 来自 D5 小瓶的稀释液3,125
D7250250 来自 D6 小瓶的稀释液1,563
D825000 = 空白
  1. 测定牛乳铁蛋白浓度
    1. 将每种乳铁蛋白标准品或样品各100 µL加入已包被的96孔条板中。用板封膜覆盖板孔，防止蒸发。在37 °C孵育1小时。
    2. 吸去各孔中的液体。向每孔加入100 µL检测试剂A工作液。用板封膜覆盖，并轻轻振荡以确保充分混匀。在37 °C孵育1小时。
    3. 每次洗涤时，在吸去每孔液体后加入约350 µL的1×洗涤缓冲液，共洗涤3次。每次洗涤液在孔中停留1–2分钟后再完全吸去。最后一次洗涤后，吸尽残留洗涤缓冲液，然后将板倒置并在洁净的吸水纸上轻拍。
    4. 向每孔加入100 µL检测试剂B工作液。用新的板封膜覆盖。在37 °C孵育30分钟。吸去各孔液体，并按照步骤4.2.3所述方法洗涤5次。向每孔加入90 µL TMB底物溶液，并用新的板封膜覆盖。
    5. 避光在37 °C孵育10–20分钟。定期监测以判断最佳显色效果。观察到孔中呈现深蓝色表示乳铁蛋白浓度较高。
    6. 向每孔加入50 µL终止液。颜色将由蓝色变为黄色。立即使用酶标仪及其配套软件在450 nm处测定各孔的吸光度。
      注：轻轻敲击板面以确保充分混匀，直至颜色变化均匀。
  2. 绘制标准曲线并确定结果
    1. 按照步骤2.3.1进行数据生成，以估算乳铁蛋白浓度。
    2. 通过绘制每个标准品的校正后平均吸光度值来构建标准曲线，方法如步骤2.3.2所述，但需使用支持四参数曲线拟合的适当软件绘制多项式曲线。
    3. 通过将样品的吸光度值代入所生成的方程中进行插值，计算各样品的乳铁蛋白含量，方法如步骤2.3.3所述。

5. 使用牛IgG ELISA法测定样品中的IgG浓度

  1. 标准品和试剂的准备
    1. 使用牛IgG ELISA试剂盒中提供的所需物品。
    2. 将所有样品和标准品平衡至室温（RT）。
    3. 通过将10 µL辣根过氧化物酶（HRP）-亲和素浓缩液（100倍）与990 µL酶标抗体稀释液混合，配制足够体积的工作用酶标抗体结合物溶液。
    4. 通过将20倍洗涤缓冲液浓缩液用dH2O稀释，配制足够体积的1倍洗涤缓冲液。
    5. 通过将20倍稀释液浓缩液用dH2O稀释，配制足够体积的1倍稀释液。
    6. 向牛IgG校准品中加入1.0 mL dH2O，轻轻混匀至完全溶解。校准品的最终浓度为123.000 ng/mL。
    7. 根据表3中描述的稀释方案，配制标准品稀释系列。

表3： 牛IgG标准品的稀释方案。

小瓶稀释液体积 (µL)IgG 加入体积及来源 (µL)最终 IgG 浓度 (ng/mL)
D1900100 µL 原液12300
D2900100 来自小瓶 D1 的稀释液1230
D3178122 来自小瓶 D2 的稀释液500
D415050 来自小瓶 D3 的稀释液250
D5150150 来自小瓶 D4 的稀释液125
D6100100 来自小瓶 D5 的稀释液62.5
D7100100 来自小瓶 D6 的稀释液31.25
D8100100 来自小瓶 D7 的稀释液15,625
D9100100 来自小瓶 D8 的稀释液7,813
D1010000 = 空白
  1. 牛IgG ELISA检测操作步骤
    1. 将每种IgG标准品或样品各100 µL加入包被的96孔条板中。用板封膜覆盖板孔，在室温下孵育30分钟。吸去各孔中的液体。
    2. 用1×洗涤缓冲液填充各孔进行洗涤，共洗涤4次，每次均吸去液体。最后一次洗涤后，彻底吸净残留洗涤缓冲液，将板倒置并在洁净的吸水纸上轻拍。向每孔中加入100 µL适当稀释的酶标抗体结合物。用板封膜覆盖，并轻轻振荡以确保充分混匀。
    3. 在室温下孵育10分钟。按照步骤5.2.2所述方法洗涤并去除孔内残留洗涤缓冲液。向每孔中加入100 µL TMB底物溶液，并用新的板封膜覆盖。
    4. 避光精确孵育10分钟。通过向每孔加入100 µL终止液终止反应。使用酶标仪及其配套软件在450 nm波长处读取每块板的吸光度值。
  2. 绘制标准曲线并确定结果
    1. 按照步骤2.3.1进行数据处理，以估算IgG浓度。
    2. 以标准品浓度为横坐标（x轴），各标准品校正后的平均吸光度为纵坐标（y轴）绘制标准曲线。使用具备四参数曲线拟合功能的适当软件拟合多项式曲线。
    3. 按照步骤2.3.3所述方法，将样品的吸光度值代入生成的方程中，通过插值法计算各样品的IgG含量。

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结果

按照方案，对牛初乳样品进行分析，以测定蛋白质、乳铁蛋白和IgG浓度。牛初乳中蛋白质、乳铁蛋白和IgG分析结果见表4。

表4：牛初乳中蛋白质、乳铁蛋白和IgG的浓度。

牛初乳
天数蛋白质 (mg/mL)乳铁蛋白 (mg/mL)IgG (mg/mL)

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讨论

本研究提供了关于初乳向成熟乳过渡过程中乳铁蛋白和IgG浓度发生显著变化的信息。采用夹心ELISA法检测乳铁蛋白和IgG浓度的变化，总蛋白浓度则通过BCA法进行分析。结果表明，早期初乳中蛋白质、乳铁蛋白和IgG的浓度最高，随后在接下来的3天内逐渐下降。准确测定这些蛋白质的含量对于初乳在乳制品（如酸奶50,51、乳饮料、黄油52、冰淇淋53和发酵乳54）生产中的应用具有重要意义。牛初乳中的生物活性蛋白（如乳铁蛋白、溶菌酶和免疫球蛋白）也广泛应用于制药工业55。本文表明，牛初乳的组成随时间发生显著变化。因此，高效且可靠的检测方法对于评估牛初乳及其衍生的生物活性成分在功能性食品和制药工业中的应用至关重要。

由于BCA法和ELISA具有高检测灵敏度，它们是分子生物学中常用的技术

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由乌卢奥瓦乳品贸易有限公司（Uluova Süt Ticaret A.Ş）资助。RMD 和 BMH 为致力于恢复婴儿微生物组的公司 Evolve BioSystems 的员工。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10X 运行缓冲液（Tris-甘氨酸-SDS）ClearBandTGS10SDS-Page 分析
2-巯基乙醇gibco31350-010SDS-Page 分析
冰醋酸Isolab901,013,2500SDS-Page 分析
牛IgG ELISA试剂盒Aviva Systems BiologyOKIA00005测定IgG浓度
牛乳铁蛋白（LF / LTF / Lactoferrin）ELISA试剂盒LSBio Lifespan BiosciencesLS-F4884测定乳铁蛋白浓度
考马斯亮蓝R 250amresco0472-25GSDS-Page 分析
发烟盐酸 37%Isolab932,103,2501SDS-Page 分析
异丙醇Isolab961,023,2500SDS-Page 分析
Laemmli 样品缓冲液（2X）ClearBandLSB-2xSDS-Page 分析
甲醇Isolab947,046,2500SDS-Page 分析
PageRuler Plus 预染蛋白Marker 10至250Thermo Scientific26619SDS-Page 分析
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒Thermo Scientific23225测定蛋白浓度
十二烷基硫酸钠（SDS）BioShopSDS001.500SDS-Page 分析
SureCast 丙烯酰胺溶液 40%（w/v）InvitrogenHC2040SDS-Page 分析
SureCast 过硫酸铵（APS）Thermo Scientific17874SDS-Page 分析
SureCast 四甲基乙二胺（TEMED）InvitrogenHC2006SDS-Page 分析
TECAN Infinite M200 酶标仪Tecan30035094吸光度测定
Tris 碱BioShopTRS001.1SDS-Page 分析

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