利用高分辨率熔解分析在蚊子Aedes aegypti中检测CRISPR/Cas9诱变后的插入缺失

摘要

本文详细介绍了一种利用高分辨率熔解分析对埃及伊蚊（Aedes aegypti）中由CRISPR/Cas9诱导的插入缺失（indel）进行快速鉴定并筛选突变品系的实验方案。

摘要

随着转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）、锌指核酸酶（ZFNs）和归巢核酸酶（HEs）等系统的建立，蚊虫基因编辑已在多个实验室成为常规技术。近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）技术为精确基因组编辑提供了更简便且成本更低的替代方案。核酸酶作用后，DNA修复通路会修复断裂的DNA末端，通常引入插入或缺失（indels）。这些移码突变可用于研究目标生物中基因的功能。然而，一个缺点是突变个体不携带显性标记，使得突变等位基因的鉴定与追踪变得困难，尤其是在许多实验所需的大规模操作中。

高分辨率熔解分析（HRMA）是一种用于识别核酸序列变异的简单方法，利用PCR熔解曲线来检测此类变异。这种PCR后分析方法使用荧光性双链DNA结合染料，并依赖具有温度梯度控制和数据采集功能的仪器，可轻松扩展至96孔板格式。本文描述了一种利用HRMA快速检测CRISPR/Cas9诱导的插入缺失（indels）并建立蚊子Ae. aegypti突变品系的简单工作流程。关键的是，所有步骤均可仅使用少量腿部组织完成，且无需处死生物体，从而可在基因分型后继续进行遗传杂交或表型分析实验。

引言

作为登革热病毒¹、寨卡病毒²、基孔肯雅热病毒³以及疟原虫⁴等病原体的传播媒介，蚊子对人类公共卫生构成重大威胁。针对这些疾病，防控蚊媒传播已成为干预措施的重点。研究在病原体易感性、蚊虫适应性、存活率、繁殖能力以及杀虫剂抗性等方面发挥重要作用的基因，对于开发新型蚊虫控制策略至关重要。为此，蚊虫基因组编辑正日益成为常规手段，尤其是随着HEs、ZFNs、TALENs以及近年来CRISPR/Cas9等技术的发展。基因编辑品系的建立通常需要将携带目标突变的个体回交数代，以尽量减少脱靶效应和奠基者效应（瓶颈效应），随后通过杂合子个体间的交配获得纯合子或反式杂合子品系。在缺乏显性标记的情况下，该过程必须依赖分子基因分型，因为在许多情况下，杂合突变体并无明显的表型特征可供识别。

尽管测序是基因型鉴定的金标准，但在数百甚至可能数千个个体中进行测序会带来显著的成本、劳动强度和获取结果所需的时间，这对于蚊子等寿命较短的生物尤其关键。常用的替代方法包括Surveyor核酸酶检测法⁵（SNA）、T7E1检测法⁶以及高分辨率熔解曲线分析（HRMA，综述见⁷）。SNA和T7E1....

方案

1. 单核苷酸多态性（SNPs）扫描、HRMA 引物设计及引物验证

1. 在野生型实验室种群蚊子中鉴定 SNP
   1. 选择目标外显子以中断正常的多肽翻译。
      注意：目标位点应靠近起始密码子或位于对蛋白质功能至关重要的关键残基区域。外显子越短（例如 ≤200 个碱基），越难靶向和分析。应避免在外显子边界附近进行编辑，因为这会迫使其中一个 HRMA 引物跨越内含子或位于内含子中。这是不理想的，因为这些区域的 SNP 频率通常要高得多。
   2. 引物设计
      1. 前往 NCBI Blast - Primer Blast 网站¹⁵，将选定的 外显子 序列复制并粘贴到页面顶部的输入框中 | 选择 PCR 产物大小（确保其涵盖大部分外显子）| 选择 物种。
      2. 点击 高级参数 | Opt （用于 PCR 产物 Tm）并输入 60 （以获得 60 °C 的最佳温度）| 获取 引物。其他参数保持默认设置。
   3. 从野生型实验室种群中提取基因组 DNA（gDNA）。保留 10 只蚊子，用 CO₂ 麻醉，并将其置于冰上的培....

结果

利用 CRISPR/Cas9 技术获得了AaeZIP11（推测的铁转运蛋白²¹）和myo-fem（一种与飞行肌相关的雌性偏向性肌球蛋白基因¹³）基因突变的蚊子，并通过 HRMA 进行基因分型，且经测序验证（图5）。图5A 和 图5C 分别显示了来自 AaeZIP11 和 myo-fem 突变样本的高分辨率熔解曲线（HRM）归一化荧光强度，同时包括野生型对照。图5B 和 图5D 分别显示了软件在将各熔解曲线减去野生型参考曲线后，对所分配的不同聚类进行分析所得的差异曲线的放大图（来自 AaeZIP11 和 myo-fem 突变样本）。杂合突变型与.......

讨论

高分辨率熔解曲线分析为鉴定媒介蚊虫埃及伊蚊（Ae. aegypti）中由CRISPR/Cas9技术产生的插入缺失突变（indels）提供了一种简单且快速的解决方案。该方法具有灵活性，可适用于对影响从飞行肌到铁代谢等多种基因发生突变的蚊虫进行基因分型^13,14。从样本采集到最终分析，HRMA仅需数小时即可完成。引物设计需要额外时间，且整体耗时还取决于获取测序结果（用于SNP鉴定）、序列分析以及引物订购所需的时间。

本文所述方案详细介绍了成功进行分析的逐步操作方法。该过程中最关键的步骤之一是引物的合理设计。高分辨率熔解曲线分析（HRMA）具有足够高的灵敏度，即使扩增片段中存在单个单核苷酸多态性（SNP），也可能产生明显的差异曲线，从而被误判为突变。在进行CRISPR诱变之前，对实验室菌群样本进行测序，有助于在设计靶序列时识别并避开富含SNP的区域；针对HRMA设计的引物将有助于防止此类问题的发生。设计扩增片段较小（70–100 bp）的引物还可提高实验.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70% 乙醇			水中配制的70%乙醇溶液
96孔PCR和实时PCR板	VWR	82006-636	用于提取基因组DNA（来自蚊子腿部）
96孔板模板			自制打印，用于基因型记录
Bio Rad CFX96	Bio Rad		具有梯度功能和高分辨率熔解分析（HRMA）能力的PCR仪
Diversified Biotech试剂储液槽	VWR	490006-896
Exo-CIP快速PCR纯化试剂盒	新英格兰生物实验室（New England Biolabs）	E1050S
玻璃培养皿	VWR	89001-246	150 mm × 20 mm
硬壳薄壁带裙边96孔PCR板	Bio-rad	HSP9665	用于HRMA
多通道移液器（P10）	Integra Biosciences	4721
多通道移液器（P300）	Integra Biosciences	4723
Nunc聚烯烃丙烯酸酯密封膜，Thermo Scientific	VWR	37000-548	与96孔 PCR板配合使用，用于获取基因组DNA
光学密封膜	Bio-rad	2239444	与带裙边96孔PCR板配合使用，用于HRMA
Phire动物组织直接PCR试剂盒（不含采样工具）	Thermo Fisher	F140WH	用于提取基因组DNA并进行PCR扩增
塑料果蝇小瓶分隔板	Genesee	59-128W
Precision Melt Analysis软件	Bio Rad	1845025	用于蚊子DNA样本的基因分型及双链DNA热变性特性的分析（参见实验步骤3.3）
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene软件		用于多序列比对
单通道移液器	Gilson
Dumont #5 镊子，11 cm	WPI	14098
白色泡沫塞	VWR	60882-189
宽口果蝇小瓶，聚苯乙烯材质	Genesee	32-117
宽口果蝇小瓶托盘，蓝色	Genesee	59-164B