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方法文章

利用高分辨率熔解分析在蚊子Aedes aegypti中检测CRISPR/Cas9诱变后的插入缺失

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DOI：

10.3791/63008

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2021年9月10日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Agrilife Research, Texas A&M University

本文内容

摘要

本文详细介绍了一种利用高分辨率熔解分析对埃及伊蚊（Aedes aegypti）中由CRISPR/Cas9诱导的插入缺失（indel）进行快速鉴定并筛选突变品系的实验方案。

摘要

随着转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）、锌指核酸酶（ZFNs）和归巢核酸酶（HEs）等系统的建立，蚊虫基因编辑已在多个实验室成为常规技术。近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）技术为精确基因组编辑提供了更简便且成本更低的替代方案。核酸酶作用后，DNA修复通路会修复断裂的DNA末端，通常引入插入或缺失（indels）。这些移码突变可用于研究目标生物中基因的功能。然而，一个缺点是突变个体不携带显性标记，使得突变等位基因的鉴定与追踪变得困难，尤其是在许多实验所需的大规模操作中。

高分辨率熔解分析（HRMA）是一种用于识别核酸序列变异的简单方法，利用PCR熔解曲线来检测此类变异。这种PCR后分析方法使用荧光性双链DNA结合染料，并依赖具有温度梯度控制和数据采集功能的仪器，可轻松扩展至96孔板格式。本文描述了一种利用HRMA快速检测CRISPR/Cas9诱导的插入缺失（indels）并建立蚊子Ae. aegypti突变品系的简单工作流程。关键的是，所有步骤均可仅使用少量腿部组织完成，且无需处死生物体，从而可在基因分型后继续进行遗传杂交或表型分析实验。

引言

作为登革热病毒1、寨卡病毒2、基孔肯雅热病毒3以及疟原虫4等病原体的传播媒介，蚊子对人类公共卫生构成重大威胁。针对这些疾病，防控蚊媒传播已成为干预措施的重点。研究在病原体易感性、蚊虫适应性、存活率、繁殖能力以及杀虫剂抗性等方面发挥重要作用的基因，对于开发新型蚊虫控制策略至关重要。为此，蚊虫基因组编辑正日益成为常规手段，尤其是随着HEs、ZFNs、TALENs以及近年来CRISPR/Cas9等技术的发展。基因编辑品系的建立通常需要将携带目标突变的个体回交数代，以尽量减少脱靶效应和奠基者效应（瓶颈效应），随后通过杂合子个体间的交配获得纯合子或反式杂合子品系。在缺乏显性标记的情况下，该过程必须依赖分子基因分型，因为在许多情况下，杂合突变体并无明显的表型特征可供识别。

尽管测序是基因型鉴定的金标准，但在数百甚至可能数千个个体中进行测序会带来显著的成本、劳动强度和获取结果所需的时间，这对于蚊子等寿命较短的生物尤其关键。常用的替代方法包括Surveyor核酸酶检测法5（SNA）、T7E1检测法6以及高分辨率熔解曲线分析（HRMA，综述见7）。SNA和T7E1均利用能够特异性切割错配碱基的内切酶。当扩增杂合突变基因组中的突变区域时，突变型和野生型等位基因的DNA片段会退火形成含有错配的双链DNA（dsDNA）。SNA通过使用错配特异性的内切酶进行消化，并结合简单的琼脂糖凝胶电泳来检测错配的存在。另一种方法HRMA则利用双链DNA结合型荧光染料检测dsDNA的热力学特性，染料的解离温度会因突变的存在与否及其类型而发生变化。HRMA已被用于单核苷酸多态性（SNPs）检测8、斑马鱼突变基因分型9、微生物学应用10以及植物遗传学研究11等多个领域。

本文介绍了一种用于CRISPR/Cas9技术产生的突变蚊子进行分子基因分型的简单方法——高分辨率熔解曲线分析（HRMA）。与替代技术相比，HRMA具有以下优势：1）灵活性高，已被证明适用于多种基因、不同大小的插入缺失（indel），并可区分不同大小的插入缺失以及杂合子、纯合子和反式杂合子12,13,14；2）成本低，仅需使用常规PCR试剂；3）节省时间，整个过程仅需数小时即可完成。此外，该方案采用蚊子的小型身体部位（如一条腿）作为DNA来源，使蚊子可在基因分型后继续存活，从而便于突变品系的建立与维持。

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方案

1. 单核苷酸多态性（SNPs）扫描、HRMA 引物设计及引物验证

  1. 在野生型实验室种群蚊子中鉴定 SNP
    1. 选择目标外显子以中断正常的多肽翻译。
      注意：目标位点应靠近起始密码子或位于对蛋白质功能至关重要的关键残基区域。外显子越短（例如 ≤200 个碱基），越难靶向和分析。应避免在外显子边界附近进行编辑，因为这会迫使其中一个 HRMA 引物跨越内含子或位于内含子中。这是不理想的，因为这些区域的 SNP 频率通常要高得多。
    2. 引物设计
      1. 前往 NCBI Blast - Primer Blast 网站15，将选定的 外显子 序列复制并粘贴到页面顶部的输入框中 | 选择 PCR 产物大小（确保其涵盖大部分外显子）| 选择 物种。
      2. 点击 高级参数 | Opt （用于 PCR 产物 Tm）并输入 60 （以获得 60 °C 的最佳温度）| 获取 引物。其他参数保持默认设置。
    3. 从野生型实验室种群中提取基因组 DNA（gDNA）。保留 10 只蚊子，用 CO2 麻醉，并将其置于冰上的培养皿中以保持其不活动状态。准备 10 个含有 0.5 µL 组织 DNA 释放试剂和 20 µL 稀释缓冲液的离心管，两者均来自 材料表 中推荐的 DNA 释放试剂盒。
    4. 使用镊子从一只蚊子上取下一条腿，并将其放入含有稀释 DNA 释放试剂溶液的对应离心管中（来自步骤 1.1.3），确保腿完全浸没在溶液中。对剩余蚊子重复此步骤，每次操作前用 70% 乙醇擦拭镊子。
    5. 将含有腿的溶液在室温下孵育 2–5 分钟，然后在 98 °C 下孵育 2 分钟，随后在设置 PCR 反应的同时让其冷却。
      注意：含有已释放 gDNA 的板可在 -20 °C 下保存，此时可暂停实验流程。
    6. 准备 10 个含有 10 µL 2x PCR 主混合液、引物（终浓度为 0.5 µM）和分子级水（终体积为 20 µL）的离心管，并将 1 µL 稀释样品转移至每个离心管中。按照以下循环参数进行 PCR：98 °C 5 分钟，40 个循环（98 °C 5 秒，60 °C 30 秒，72 °C 每 kb 20 秒）；最终延伸 72 °C 1 分钟。
    7. 使用酶降解残留的 PCR 引物并去磷酸化多余的 dNTP，或使用柱纯化试剂盒纯化 PCR 产物。随后进行样品测序。
    8. 分析每个电泳图谱中是否存在双峰/模糊碱基，并使用适当的简并碱基编码手动调整每个序列的碱基判读。
      注意：此步骤必须在多序列比对之前完成，因为碱基判读软件通常会选择更显著的峰作为"真实"碱基，从而错误地显示无 SNP 存在。
    9. 使用比对软件 SeqMan Pro（列于 材料表 中）或其他开源比对软件（如 ClustalW16 或 T-Coffee17）进行多序列比对。
      1. 打开比对软件 | 点击 添加序列 | 选择所需序列并点击 添加 | 所有序列选择完成后，点击 完成。
      2. 点击 组装 以执行比对。要打开比对结果，请点击 Contig 1 并分析比对结果以识别 SNP（图 1）。
        注意：作为步骤 1.1.3–1.1.6 的替代方案，可从批量样本（来自>10 个个体）中提取的基因组 DNA 直接进行 PCR。测序扩增子可直接分析电泳图谱中作为双峰出现的 SNP，但稀有 SNP 更难检测。
    10. 设计 3–5 个单导向 RNA（sgRNA），避免包含上述已鉴定 SNP 的区域，遵循文献中描述的方案18。
  2. HRMA 引物设计
    1. 使用 mFold19 检测外显子序列在 PCR 过程中可能形成的二级结构。
      1. 前往 UNAFold Web 服务器 | 点击 mFold | 在下拉菜单中点击 Applications | DNA Folding Form。
      2. 在输入框中输入 序列名称 并粘贴 外显子 序列。
      3. 将折叠温度更改为 60 °C；在 离子条件 中，将 [Mg++] 更改为 1.5，并将单位切换为 mM；点击 Fold DNA。
      4. 在 输出 部分，于 Structure 1 下方点击 pdf 以打开环形结构图谱。 
    2. 前往 NCBI Blast - Primer Blast15 进行引物设计。
    3. 将步骤 1.1 中测序确定的选定外显子序列（包含最少或无 SNP 的序列）复制并粘贴到页面顶部的输入框中。
    4. 使用符号 < > 标记并排除包含 SNP、靶位点以及可能形成二级结构的区域。
    5. 选择 PCR 产物大小 在 80 至 150 bp 之间，并选择 物种。
      注意：较大的片段大小也可成功使用（约 300 bp）。然而，较长的扩增子可能会降低在仅有一个或少数几个碱基对差异的序列之间的敏感性。
    6. 点击 获取引物。选择 2–3 对引物进行测试（理想情况下，引物位点距离任何 CRISPR 靶位点 ≥20–50 bp）。
  3. 引物验证
    1. 使用单一个体的 gDNA 进行梯度 PCR。
      1. 制备主混合液，并取出一份样品作为无模板对照（NTC）置于单独的离心管中。将模板加入剩余的主混合液中，并分装至 96 孔板中。
      2. 按照以下循环参数进行：98 °C 30 秒，34 个循环（98 °C 10 秒，55–65 °C 30 秒，72 °C 15 秒）；最终延伸 72 °C 10 分钟。
      3. 按照以下参数生成热熔曲线：变性步骤 95 °C 1 分钟，退火 60 °C 1 分钟，熔解曲线检测在 75 °C 至 95 °C 之间以 0.2 °C 递增，每个温度保持 10 秒。
        注意：仅应使用具有单一热熔曲线的退火温度。
  4. 按照文献中描述的方法12，通过胚胎注射生成突变品系。

2. 蚊虫腿部基因组DNA的制备

  1. 分离 G1 在蛹阶段按性别分离蚊子，以防止其在基因分型前交配，并确保有同龄的野生型对照蚊子可用于作为参考和回交。同样按性别进行分离。
  2. 收集所需的材料（图2A）并为每个待基因分型的个体在96孔PCR板中加入0.5 µL DNA释放试剂和20 µL稀释缓冲液（来自gDNA释放试剂盒）图2B）并置于冰上。预留两个反应体系用于NTC。
  3. 标记一个用于蚊子样本管的托盘（果蝇 小瓶），使96孔板上的每个孔对应托盘中的相应蚊虫小瓶。
  4. 麻醉G1 携带 CO 的蚊子2 并将它们放入玻璃培养皿中以保持麻醉状态（图 2C，D将8只野生型蚊子麻醉后置于第二个培养皿中。
  5. 用70%乙醇擦拭一对镊子，取下一只蚊子的后腿图2E，F).
  6. 将蚊虫腿部浸入DNA释放试剂溶液中，然后将蚊虫放入对应的样品管中，并用海绵塞紧管口图2G，H).
  7. 用70%乙醇再次擦拭镊子，然后继续从下一只蚊虫中移除腿部。重复步骤2.5–2.7，直至完成96孔板的操作。
    注意：务必用70%乙醇擦拭镊子，以最大限度减少DNA交叉污染。
  8. 使用光学PCR板密封膜密封反应板（图 2I）将含有果蝇腿的96孔板在室温（RT）下孵育2-5分钟，随后在98 °C下孵育2分钟。在准备PCR混合液的同时，让孔板冷却至室温。
    注意：整个过程通常需要3-4小时。如果蚊虫必须在离心管中存放的时间超过预期时长（尤其是≥1天），需为每只蚊虫提供一小块葡萄干（或糖和水的其他来源），以确保在延长孵育期间蚊虫的存活。

3. 高分辨率熔解曲线分析（HRMA）

  1. 进行PCR。
    1. 为每个反应配制主混合液，包含以下组分：10 µL 2x缓冲液（来自基因组DNA释放试剂盒）、每种引物各0.5 µM、1 µL EvaGreen染料、0.4 µL聚合酶（来自基因组DNA释放试剂盒），并用分子级水补足至19 µL。
    2. 使用多通道移液器将19 µL主混合液转移至各孔中。将1 µL含有蚊子DNA的DNA释放溶液（按第2节制备）加入到PCR板中（图3A）。使用光学PCR板密封膜密封PCR板。
    3. 按照以下扩增循环参数进行PCR：98 °C预变性5分钟；98 °C变性10秒、选定的退火温度（72 °C）退火30秒，共39个循环；最后72 °C延伸2分钟。
  2. 根据以下参数生成熔解曲线：95 °C变性1分钟，60 °C退火1分钟，熔解曲线检测范围为75 °C至95 °C，以0.2 °C递增，每个温度点保持10秒。有关使用CFX96实时系统进行高分辨率熔解分析（HRMA）的软件设置详细说明，请参见补充材料和补充图S1-S5。
  3. 观察熔解曲线图（图3B）。将野生型对照指定为参考聚类。
    注：软件（见材料表）会自动对数据进行归一化处理，并以不同颜色标记不同熔解曲线对应的聚类。
  4. 在96孔模板上用相应颜色标记不同的聚类（图3C）。
  5. 选择具有目标曲线的个体，将其从试管中取出并进行回交（图3D）。对交配后的雌蚊进行血液饲喂，并收集G2代卵。

4. 通过桑格测序进行序列验证

  1. 使用酶降解所选蚊虫（来自第3.1节制备的孔板）孔中PCR产物的残留引物，并去除多余的dNTP的磷酸基团，从而纯化PCR产物。或者，可使用任何柱式纯化试剂盒，并继续进行样品测序。
    注意：当PCR产物长度较小时（≤200 bp），直接测序可能更具挑战性。在此类情况下，应设计引物以扩增包含靶位点的较大片段（≥250 bp），并利用96孔板中的DNA（步骤2.2）通过PCR进行扩增。
  2. 使用测序峰图分析软件分析并鉴定插入缺失突变（图4）。或者，可使用Poly Peak Parser软件20辅助检测杂合个体中的突变。
    1. 访问Poly Peak Parser网站，在浏览菜单中选择突变个体的序列，并将参考序列复制粘贴至输入框中。
      注意：替代等位基因与参考序列的比对结果将自动显示在屏幕右侧。

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结果

利用 CRISPR/Cas9 技术获得了AaeZIP11（推测的铁转运蛋白基因21）和myo-fem（一种与飞行肌相关的雌性偏向肌球蛋白基因13）基因突变的蚊子，随后通过 HRMA 进行基因分型，并经测序验证（图 5）。图 5A 和 图 5C 分别显示了来自 AaeZIP11 和 myo-fem 突变样本的 HRM 曲线归一化荧光强度，以及野生型对照样本的结果。图 5B 和 图 5D 分别显示了软件在减去野生型参考曲线后，对 AaeZIP11 和 myo-fem 突变样本的熔解曲线进行差值计算所得的差异曲线放大图。杂合与纯合的 Aae...

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讨论

高分辨率熔解曲线分析为鉴定媒介蚊虫埃及伊蚊（Ae. aegypti）中由CRISPR/Cas9技术产生的插入缺失突变（indels）提供了一种简单且快速的解决方案。该方法具有灵活性，可适用于对影响从飞行肌到铁代谢等多种基因发生突变的蚊虫进行基因分型13,14。从样本采集到最终分析，HRMA仅需数小时即可完成。引物设计需要额外时间，且整体耗时还取决于获取测序结果（用于SNP鉴定）、序列分析以及引物订购所需的时间。

本文所述方案详细介绍了成功进行分析的逐步操作方法。该过程中最关键的步骤之一是引物的合理设计。高分辨率熔解曲线分析（HRMA）具有足够高的灵敏度，即使扩增片段中存在单个单核苷酸多态性（SNP），也可能产生明显的差异曲线，从而被误判为突变。在进行CRISPR诱变之前，对实验室菌群样本进行测序，有助于在设计靶序列时识别并避开富含SNP的区域；针对HRMA设计的引物将有助于防止此类问题的发生。设计扩增片段较小（70–100 bp）的引物还可提高实验...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

所有图示均在德克萨斯农工大学的许可下使用 Biorender.com 制作&M 大学。本研究获得了美国国家过敏与传染病研究所（资助号：AI137112 和 AI115138，授予 Z.N.A.）以及德克萨斯 A&M 农业生命研究所在昆虫传播疾病资助项目下的支持，以及美国农业部国家食品与农业研究所哈奇项目 1018401。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70% 乙醇水中配制的70%乙醇溶液
96孔PCR和实时PCR板VWR82006-636用于提取基因组DNA（来自蚊子腿部）
96孔板模板自制打印，用于基因型记录
Bio Rad CFX96Bio Rad具有梯度功能和高分辨率熔解分析（HRMA）能力的PCR仪
Diversified Biotech试剂储液槽VWR490006-896
Exo-CIP快速PCR纯化试剂盒新英格兰生物实验室（New England Biolabs）E1050S
玻璃培养皿VWR89001-246150 mm × 20 mm
硬壳薄壁带裙边96孔PCR板Bio-radHSP9665用于HRMA
多通道移液器（P10）Integra Biosciences4721
多通道移液器（P300）Integra Biosciences4723
Nunc聚烯烃丙烯酸酯密封膜，Thermo ScientificVWR37000-548与96孔 PCR板配合使用，用于获取基因组DNA
光学密封膜Bio-rad2239444与带裙边96孔PCR板配合使用，用于HRMA
Phire动物组织直接PCR试剂盒（不含采样工具）Thermo FisherF140WH用于提取基因组DNA并进行PCR扩增
塑料果蝇小瓶分隔板Genesee59-128W
Precision Melt Analysis软件Bio Rad1845025用于蚊子DNA样本的基因分型及双链DNA热变性特性的分析（参见实验步骤3.3）
SeqMan ProDNAstar Lasergene软件用于多序列比对
单通道移液器Gilson
Dumont #5 镊子，11 cmWPI14098
白色泡沫塞VWR60882-189
宽口果蝇小瓶，聚苯乙烯材质Genesee32-117
宽口果蝇小瓶托盘，蓝色Genesee59-164B

参考文献

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