使用埃及伊蚊的高分辨率熔融分析进行CRISPR/Cas9诱变后的Indel检测

作为登革热¹、寨卡²和基孔肯雅热³ 等病原体的载体，以及疟疾寄生虫⁴，蚊子对人类构成重大的公共卫生威胁。对于所有这些疾病，传播干预的重点是控制蚊媒。研究在病原体的允许性，蚊子适应性，存活率，繁殖和对杀虫剂的抵抗力等方面的重要基因是制定新的蚊子控制策略的关键。出于这些目的，蚊子的基因组编辑正在成为一种普遍的做法，特别是随着诸如HE，ZFN，TALENs以及最近带有Cas9的CRISPR等技术的发展。基因编辑菌株的建立通常涉及携带所需突变的个体在几代人内回交，以尽量减少脱靶和创始人（瓶颈）效应，然后交叉杂合子个体以产生纯合子或跨杂合子系。在没有显性标记的情况下，分子基因分型在这个过程中是必要的，因为在许多情况下，不能检测到杂合突变体的明确表型性状。

虽然测序是基因型表征的黄金标准，但在数百或数千个个体中进行测序会产生获得结果所需的大量成本，劳动力和时间，这对于蚊子等寿命较短的生物体尤其重要。常用的替代方法包括 Surveyor 核酸酶测定^法5 （SNA）、T7E1 测定^法6 和高分辨率熔融分析（HRMA，已于 ⁷ 中回顾）。SNA和T7E1都使用切除不匹配碱基的内切酶。当杂合突变基因组的突变区域被扩增时，来自突变体和野生型等位基因的DNA片段被退火以产生不匹配的双链DNA（dsDNA）。SNA通过酶切特异性内切酶和简单的琼脂糖凝胶电泳检测是否存在错配。或者，HRMA使用由dsDNA结合荧光染料检测的dsDNA的热力学特性，染料的解离温度根据突变的存在和类型而变化。HRMA已被用于检测单核苷酸多态性（SNPs）⁸，斑马鱼的突变基因分型⁹，微生物应用¹⁰和植物遗传研究¹¹等。

本文介绍了HRMA，这是一种由CRISPR/ Cas9技术产生的突变蚊子进行分子基因分型的简单方法。与替代技术相比，HRMA的优势包括1）灵活性，因为它已被证明对各种基因有用，广泛的凹槽大小，以及不同凹槽大小与杂合子，纯合子和跨杂合子分化之间的区别^12，13，14，2）成本，因为它基于常用的PCR试剂，以及3）节省时间， 因为它可以在短短几个小时内完成。此外，该协议使用一个小的身体部位（腿）作为DNA的来源，允许蚊子在基因分型过程中存活下来，允许建立和维持突变系。

1. 单核苷酸多态性（SNP）、HRMA引物设计和引物验证

1. 野生型实验室群落蚊子的SNP鉴定
   1. 选择目标外显子以破坏适当的多肽翻译。
      注意:靶标应靠近起始密码子或蛋白质功能所需的关键残基。外显子越短（例如，≤200碱基），靶向和分析就越困难。避免在靠近外显子边界的地方进行编辑，因为这会迫使其中一个HRMA引物穿过内含子或进入内含子。这是不可取的，因为这些地区的SNP率往往要高得多。
   2. 底漆设计
      1. 转到NCBI Blast - Primer Blast网站¹⁵，将所选 的外显子 复制并粘贴到页面顶部的框中，|选择 PCR产物尺寸 （确保它包含大部分外显子）|选择 生物体。
      2. 单击 "高级参数|选择 （对于 PCR 产品 Tm）并添加 60 （最佳温度为 60 °C） |获取 引物。将其他参数保留为默认值。
   3. 从野生型实验室菌落中获取基因组DNA（gDNA）。留出10只蚊子，用_CO2麻醉它们，然后将它们放在冰上的培养皿中，使它们保持不活动状态。设置10个管，其中包含0.5μL用于从组织中释放DNA的试剂和20μL稀释缓冲液，两者都在 材料表中建议的DNA释放试剂盒中提供。
   4. 使用镊子从一只蚊子身上取出一条腿，并将其放入DNA释放试剂稀释溶液的相应管中（从步骤1.1.3开始），将腿完全浸没在溶液中。对剩余的蚊子重复此步骤，用70%乙醇擦拭镊子，然后再进行下一个。
   5. 将含腿的溶液在室温下孵育2-5分钟，然后在98°C下孵育2分钟，并在建立PCR反应时使其冷却。
      注意:含有释放的gDNA的板可以储存在-20°C，并且方案可以在此时暂停。
   6. 准备10个包含10μL2x PCR预混液的试管，引物至0.5μM最终浓度，分子级水至最终体积为20μL，并将1μL稀释的样品转移到每个试管中。按照以下循环参数进行PCR:98°C 5分钟，40次循环98°C持续5秒，60°C 30秒，72°C每kb20秒;最终延伸72°C1分钟。
   7. 用酶纯化PCR产物，以降解残留的PCR引物，并对过量的dNTP或任何柱净化试剂盒进行去磷酸化。继续对样品进行测序。
   8. 分析每个电泳图是否存在双峰/模糊碱基，并使用适当的退化基码在每个序列中手动调整基数调用。
      注意:此步骤必须在多序列比对之前执行，因为碱基调用软件通常会选择更突出的峰值作为"真"碱基调用，从而给人一种没有SNP的错误印象。
   9. 使用材料表中列出的比对软件SeqMan Pro或其他开源比对软件（如ClustalW16或T-Coffee17）执行多序列比对。
      1. 打开对齐软件|单击 "添加序列 |选择所需的序列，然后单击 "添加 |选择所有序列后，单击" 完成"。
      2. 单击" 组装 "以执行对齐。要打开对齐，请单击 Contig 1 并分析对齐并识别 SNP（图 1）。
         注:作为步骤1.1.3-1.1.6的替代方法，PCR可以从从散装样品（来自>10个体）获得的分离基因组DNA中进行。测序扩增子可以直接分析是否存在在电泳图中表现为双峰的SNP，尽管罕见的SNP将更难检测。
   10. 按照¹⁸中描述的方案设计3-5个单向导RNA（sgRNA），避免含有上述任何SNP的区域。
2. 热塑性预处理底漆设计
   1. 使用^mFold19测试外显子序列，以确定在PCR过程中可能形成的二级结构。
      1. 转到 UNAFold Web Server |点击 mFold |在下拉菜单中，单击 "应用程序 | DNA折叠形式。
      2. 在框中输入 序列名称 并粘贴 外显子。
      3. 将折叠温度改为 60°C;在 离子条件下，将[Mg ⁺⁺]更改为 1.5 ，在单位上切换到 mM;点击 折叠DNA。
      4. 在 输出上，在 结构 1 下方，单击 pdf 以打开圆形结构图。
   2. 转到 NCBI 喷砂 - 底漆 ^Blast15 了解底漆设计。
   3. 将步骤 1.1 中通过测序确定的选定外显子序列（包含最少数量的 SNP 或无 SNP 的序列）复制并粘贴到页面顶部的框中。
   4. 使用 符号< > 标记和排除包含 SNP、目标位点和可能形成二级结构的区域的序列。
   5. 选择 PCR产物大小 在80和150 bp之间，然后选择 生物体。
      注意:可以成功使用较大的片段大小（~300 bp）。然而，较长的扩增子可能会降低在一个或几个碱基对中不同的序列之间的灵敏度。
   6. 点击 获取入门书。选择2-3对引物进行测试（理想情况下，引物位点距离任何CRISPR靶点≥20-50 bp）。
3. 入门验证
   1. 使用单个个体的 gDNA 进行梯度 PCR。
      1. 准备预混液，并在单独的试管中除去一个用于非模板对照（NTC）的样品。将模板添加到剩余的预混液中，并等分到96孔板中。
      2. 遵循循环参数:98 °C 30 s，98 °C 的 34 次循环 10 s，55–65 °C 30 s，72 °C 15 s;最终延伸72°C10分钟。
      3. 根据以下参数生成热熔体曲线:变性步骤 95 °C 持续 1 分钟，在 60 °C 退火 1 分钟，在 75 °C 和 95 °C 之间以 0.2 °C 为增量检测熔体曲线，每个温度的保持时间为 10 s。
         注:应仅使用具有单个热熔体曲线的退火温度。
4. 继续通过胚胎注射产生突变系，如¹²中所述。

2. 从蚊子腿上制备基因组DNA

1. 在蛹阶段按性别将_G1 蚊子分开，以便它们在基因分型之前不会交配，并确保年龄匹配的野生型控制蚊子可用于参考和回交。同样地将他们分开。
2. 收集所需的材料（图2A），并准备一个96孔PCR板，其中0.5μLDNA释放试剂和20μL稀释缓冲液（来自gDNA释放试剂盒）每个人进行基因分型（图2B）并将其留在冰上。为NTC保留两种反应。
3. 标记蚊子小瓶（果蝇 小瓶）的托盘，以便96板上的每个孔对应于托盘中相应的蚊子小瓶。
4. 用_CO2麻醉_G1蚊子，并将它们放在玻璃培养皿中以保持镇静（图2C，D）。麻醉并将8只野生型蚊子放入第二个培养皿中。
5. 用70%乙醇擦拭一对镊子，并取出蚊子的后腿之一（图2E，F）。
6. 将腿浸没在DNA释放试剂溶液中，将蚊子放入相应的小瓶中，然后用海绵将其关闭（图2G，H）。
7. 用70%乙醇再次擦拭镊子，然后继续从下一只蚊子身上取下腿。重复步骤2.5-2.7，直到96孔板完成。
   注意:用70%乙醇擦拭镊子很重要。这最大限度地减少了DNA交叉污染。
8. 用光学PCR板密封板密封板（图2I），并在室温（RT）下孵育含有腿的96孔板2-5分钟，然后在98°C下孵育2分钟。在制备PCR混合物时，让板冷却至室温。
   注意:整个过程通常需要3-4小时。如果蚊子必须在小瓶中保存超过预期持续时间（特别是≥1天），请与每只蚊子一起放置一小块葡萄干（或糖和水的来源），以确保蚊子在长时间的孵化期间存活。

3. 人力资源管理

1. 进行 PCR 检测。
   1. 为每个反应制备含有以下组分的预混液:10μL2x缓冲液（来自gDNA释放试剂盒），0.5μM每个引物，1μLEvaGreen染料，0.4μL聚合酶（来自gDNA释放试剂盒），并用分子级水完成至19μL。
   2. 使用多通道移液器，将19μL预混液转移到每个孔中。将1μL含有第2部分中制备的蚊子DNA的DNA释放溶液转移到板中（图3A）。用光学PCR板密封板密封板。
   3. 按照循环参数进行PCR:98°C持续5分钟，39次循环98°C持续10秒，所选退火温度（72°C）30秒;最终延伸72°C2分钟。
2. 根据以下参数生成热熔体曲线:变性步骤 95 °C 持续 1 分钟，在 60 °C 退火 1 分钟，在 75 °C 和 95 °C 之间以 0.2 °C 为增量检测熔体曲线，每个温度的保持时间为 10 s。请参阅 补充材料 和 补充图S1-S5 ，详细了解使用CFX96实时系统运行HRMA的软件设置。
3. 检查熔体曲线（图3B）。将 wild 类型控件分配给引用分类。
   注:软件（参见 材料表）会自动规范化数据，并为不同的熔体曲线指定带有颜色的聚类。
4. 在96孔模板上用相应的颜色标记不同的聚类（图3C）。
5. 选择具有感兴趣曲线的个体，将其从管中取出，然后回溯（图3D）。给交配的雌性喂血并收集_G2 卵。

4. 通过桑格测序进行序列验证

1. 使用酶从孔中用选定的蚊子（从3.1节中制备的板）纯化PCR产物，使用酶降解残留的PCR引物，并对过量的dNTPs进行去磷酸化。或者，使用任何色谱柱净化试剂盒并继续对样品进行测序。
   注意:当 PCR 产物尺寸较小 （≤200 bp） 时，直接测序可能更具挑战性。在这种情况下，设计引物以扩增包含靶位点的较大片段（≥250 bp），并使用96孔板中的DNA通过PCR扩增（步骤2.2）。
2. 使用跟踪查看器软件分析和识别内嵌（图 4）。或者，Poly Peak Parser ^software20 可以帮助检测杂合个体的突变。
   1. 转到 Poly Peak 解析器网站，从" 浏览 "菜单上的突变个体中选择序列，然后将参考序列复制并粘贴到框中。
      注意:交替等位基因和参考之间的对齐将自动显示在屏幕的右侧。

使用CRISPR / Cas9技术获得含有 AaeZIP11 （推定的铁转运蛋白21）和 myo-fem （与飞行肌肉相关的女性偏倚肌球蛋白基因13）突变的蚊子，使用HRMA进行基因分型，并进行序列验证（图5）。 图5A 和 图5C 分别显示了 AeEZIP11 和 肌-fem 突变样品的HRM曲线以及野生型对照的归一化荧光强度。 图4B 和 图4D 显示了从wild型参考中减去每条曲线后，软件分配的不同簇的熔体剖面之间的差异曲线（分别来自 AeZIP11 和 myo-fem 突变体样品）的放大倍率。将杂合子和纯合突变体 AaeZIP11 个体置于不同的簇中，并且很容易与野生型对照区分开来（图5B）。杂合子突变 肌女性 个体也与对照组不同（图5D）。请注意，在这两种情况下都存在野生型对照中的两个簇，很可能是由于目标区域中存在SNP（图5），这突出了使用多个对照样本以避免在无法避免SNP时将对照分类为突变体的必要性。

图4A 显示了 AeezIP11 突变体的序列分析。来自 AaeZIP11 杂合突变体的电泳图显示了发生凹陷的核苷酸位置。这表示为从单峰到双峰的转变，因为多态位置将同时显示两个核苷酸（图4A）。删除或插入的碱基对的数量是通过计算运行结束时的单个峰来计算的（图4B），因为其中一条DNA链将分别通过删除或插入的碱基对的数量比另一条短或长。建议使用来自突变体的序列验证gDNA作为鉴定杂合子的参考，以帮助后续世代的HRMA分析。当相似的曲线自动分配给不同的聚类时，可能需要手动分配曲线。这可以通过比较温度偏移曲线和差分曲线来完成。可能需要手动调整软件才能将样品正确分配给聚类。来自 AaeZIP11 和一种名为 Aeflightin 的突变体的HRMA结果表明，需要单独的样品分析才能成功对杂合子，纯合子和反式杂合子进行分类。最初，软件的自动群集分配无法在组之间做出适当的区分（图6A、 图6C、 图6E和 图6G）。然后单独分析每个样品，并根据与杂合子，纯合子和反式杂合子的参考样品的相似性（先前通过测序验证）将每个样品分配给正确的组（图6B， 图6D， 图6F和 图6H）。

图 1:SNP 标识。 来自野生型的 AaeZIP11 片段多序列比对示意图。红色是SNP，绿色是没有SNP的片段;建议将这个无SNP的区域用于sgRNA和引物设计。缩写:SNP = 单核苷酸多态性;sgRNA = 单向导链;LVP = 利物浦应变。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2:从蚊子腿上获取HRMA基因组DNA的实验程序。 （A）用于获取基因组DNA的材料，包括移液器，吸头，PCR板，光学密封，储液罐，稀释缓冲液和DNA释放溶液。（二）PCR板制备含DNA释放试剂和稀释缓冲液。（C）蚊子麻醉与CO2。（D）用70%乙醇擦拭镊子，以防止样品之间的污染。（E）实验装置包括镊子，蚊子小瓶架，带有麻醉蚊子的冰容器顶部的培养皿以及先前制备的PCR板。（G）蚊子腿被浸没在DNA释放试剂溶液中的放大视图。（H）将单个蚊子放入小瓶中。（I）密封含有蚊腿的PCR板。缩写:HRMA = 高分辨率熔体分析。请点击此处查看此图的放大版本。

图3:HRM分析的实验程序。 （A）将释放的gDNA转移到含有PCR混合物的96孔板中。（二）目视检查差值曲线。（C）在96孔模板上用与其各自的差分曲线颜色相同的颜色标记每个样品。（D） 将同一集群中的个体反向交叉。缩写:HRM = 高分辨率熔体;gDNA = 基因组 DNA。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4: AaeZIP11 突变体的序列分析。 （A） AaeZIP11Δ56突变体的核苷酸比对。以黄色突出显示的短划线是已删除的基数。在框中，电泳图从单峰过渡到双峰，描绘了发生缺失的位置（箭头）。（B）测序运行结束和从双峰到单峰过渡的电泳图。请注意，单个峰值的数量表示删除的碱基数（灰色矩形）。引物序列在 补充表S1中提供。 请点击此处查看此图的放大版本。

图5:从蚊子腿中提取的DNA的HRMA。 从 AeezIP11 （A 和 B）和 肌女性 （C 和 D）敲除 埃及伊蚊 的单条腿中提取DNA，并通过HRMA进行分析。 A 和 C 表示样品的归一化荧光信号到1.0至0的相对值。 B 和 D 通过从百型参考（利物浦应变）中减去每条曲线来表示曲线差异的放大倍数。缩写: HRMA = 高分辨率熔体分析;LVP = 利物浦应变;RFU = 相对荧光单位。引物序列在 补充表S1中提供。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 6:手动组分配示例。（A-D） Aeflightin 突变体的 HRMA。（A 和 C） 熔体曲线（分别为归一化线性尺度曲线和差分曲线）由精密熔体分析软件自动分组。（B） 手动更改差分曲线的归一化。（D）在改变差分曲线的归一化后，通过差分曲线中的峰值温度单独分配每个样品，用于相应的阳性对照（先前测序的样品由Δ4和Δ5杂合子和Δ4Δ5反杂合子鉴定），从而能够清晰地识别3组。添加红色和棕色箭头以突出显示不同温度下的峰值。（E-H）AaeZIP11突变体的HRMA。（E 和 G） 熔体曲线由软件自动分配。（F和H）第二个杂合自交中的突变体通过归一化曲线和差分曲线与先前确定的参考文献的相似性（在曲线中以颜色编码）被适当地分配给正确的组。杂合子 asg、纯合子 asg 和反式杂合子 asg:由 Precision Melt Analysis Software 指定熔点曲线。缩写: HRMA = 高分辨率熔体分析;LVP = 利物浦应变;RFU = 相对荧光单位。引物序列在补充表S1中提供。请点击此处查看此图的放大版本。

补充材料:在 CFX96 实时系统（例如 Bio-rad）中设置 HRMA 的详细协议。请单击此处下载此文件。

补充图S1:在Bio-rad CFX管理器上设置循环协议的分步说明。见 补充材料 2.1-2.3。 请点击此处下载此文件。

补充图S2: 有关 Bio-rad CFX 管理器上的印版设置的分步说明。见 补充材料 3.1-3.4。 请点击此处下载此文件。

补充图 S3:Bio-rad CFX 管理器上板设置的分步说明。 见补充材料3.5-3.6。请点击此处下载此文件。

附图S4:有关在 Bio-rad CFX 管理器上运行设置的分步说明。见补充材料4.1。请点击此处下载此文件。

补充图S5:Bio-rad CFX Manager 上 HRMA 分析的分步说明。见补充材料5.1-5.3。缩写:HRMA = 高分辨率熔体分析。请点击此处下载此文件。

补充表S1:引物列表。请点击此处下载此表格。

作者没有利益冲突要声明。