本方案描述了一种微型基因报告基因检测方法，用于监测5´剪接位点突变对剪接的影响，并开发了用于挽救突变所致剪接抑制的抑制性U1 snRNA。将报告基因和抑制性U1 snRNA构建体在HeLa细胞中表达，通过引物延伸或RT-PCR分析剪接情况。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在基因表达过程中，前体mRNA剪接这一关键步骤涉及对剪接位点的精确识别以及剪接体复合物的有效组装，从而在成熟mRNA转运至细胞质之前连接外显子并去除内含子。剪接效率可能受到剪接位点突变、反式作用剪接因子的影响或治疗药物活性的调控。本文介绍了一种可用于监测任意给定外显子剪接效率的细胞实验方案。该实验采用一种可灵活设计的质粒载体，编码包含3个外显子和2个内含子的微型基因报告系统，可通过瞬时转染在哺乳动物细胞中表达。转染后提取全细胞RNA，通过引物延伸法或半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测报告mRNA中外显子剪接的效率。我们阐述了如何通过在报告系统中引入与疾病相关的5′剪接位点突变以评估其影响，以及如何通过共转染携带补偿性突变的U1小核RNA（snRNA）构建体来实现对这些突变的校正——该U1 snRNA的5′区发生突变后可与前体mRNA中外显子-内含子交界处的5′剪接位点形成碱基配对。因此，该报告系统可用于设计治疗性U1颗粒，以增强对突变5′剪接位点的识别。插入 顺式-作用 调控位点，例如剪接增强子或沉默子序列，也可插入报告基因中，以研究U1 snRNP在特定选择性剪接因子介导的调控中的作用。最后，可将表达报告基因的细胞与小分子共同孵育，以确定潜在治疗药物对组成型pre-mRNA剪接或携带突变5′剪接位点外显子的剪接影响。总体而言，该报告基因检测可用于多种条件下剪接效率的监测，从而研究基本的剪接机制及与剪接相关的疾病。
引言
前体mRNA剪接是一个关键的加工步骤，可去除非编码的内含子，并精确连接编码的外显子以形成成熟的mRNA。剪接机器的组分通过识别外显子-内含子交界处的保守序列——即5′-剪接位点和3′-剪接位点——来启动剪接过程。U1小核核糖核蛋白（snRNP）通过U1 snRNA与前体mRNA的碱基配对识别5′-剪接位点1。遗传性突变若改变了5′-剪接位点序列，已知与多种疾病相关2,3。据预测，U1 snRNA与突变型5′-剪接位点之间碱基配对的丧失 会导致异常剪接，从而影响受影响转录本的翻译。一种潜在的治疗策略是利用经过修饰的U1 snRNA来抑制突变效应，该U1 snRNA在其5′-区域携带补偿性核苷酸改变，可与突变的5′-剪接位点重新形成碱基配对。这类修饰后的U1 snRNA也被称为外显子特异性U1 snRNA，已被证实可有效逆转剪接缺陷，从而提高 rescued mRNA 所介导的蛋白表达水平4,5,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 试剂与缓冲液
注意：所有使用真空滤器的灭菌操作均应在生物安全柜中使用0.2 µm聚醚砜（PES）膜进行。
- 通过向 1.0 L 去离子水中加入 1.0 mL 二乙基焦碳酸酯（DEPC），在室温（RT）下混合至少 1 小时，高压灭菌两次，然后冷却至室温后使用，制备无 RNase 水。
- 通过将一包 DMEM 粉末（13.4 g）、3.7 g 碳酸氢钠、100 mL 胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素加入约 800 mL 无菌去离子水中来制备 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）。DMEM 中青霉素和链霉素的终浓度应分别为 50 U/mL 和 50 µg/mL。调节 pH 至 7.4，然后用无菌去离子水定容至 1.0 L。过滤除菌后，于 4 °C 保存。
- 通过将 25.6 g 七水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）、2 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）、2 g 氯化钾（KCl）和 80 g 氯化钠（NaCl）加入 800 mL 去离子水中来制备 10× 磷酸盐缓冲液（10× PBS）。搅拌溶解后定容至 1.0 L。过滤除菌后，于 4 °C 保存。
- 通过将 186.1 g Na2•EDTA•2H2
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
剪接报告基因Dup51是一种源自人类β-珠蛋白基因的三外显子-两内含子微型基因，此前已有描述（图1A)11,12 我们通过引入与Usher综合征相关的原钙黏蛋白15（protocadherin 15）第3外显子中的5′剪接位点突变，构建了一种突变报告基因Dup51p。PCDH15) 基因13. 外显子2-内含子2连接处的5´剪接位点序列由CAG/GUUGGUAUC改为AUG/GUGUGUAUC（/表示外显子-内含子边界）图1B)14这些序列变化改变了5´-剪接位点与内源性U1 snRNA碱基配对的预测模式，并导致成熟转录本中第2外显子的缺失。图2）。这些突变的影响可通过U1 snRNA 5´区的补偿性改变而被抑制。将5´端尿嘧啶替换.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
该检测方法可适用于HeLa以外的细胞系中的剪接分析，但可能需要优化影响转染效率的因素，例如细胞融合度和DNA用量。报告基因与U1构建体的比例是另一个关键参数，可能需要根据在其他细胞类型中观察到的表达水平来确定。提取RNA的质量对剪接分析至关重要；因此，强烈建议使用无RNase的水，并用RNase失活剂对实验表面进行去污染处理。
通过引物延伸或荧光RT-PCR分析报告基因转录本可获得相似的结果，因此这两种技术均可用于监测成熟转录本中外显子2包含情况的变化。荧光PCR反应必须在扩增的指数期停止并进行定量，该阶段依赖于初始RNA浓度。因此，对于与本文所述不同的转染条件，可能需要确定扩增循环次数。RT-PCR检测由于无需使用放射性物质，操作简便，具有明显优势。尽管使用放射性标记引物的引物延伸法需要额外的安全防护措施，但其能够检测到极少量RNA产生的信号。引物延伸和RT-PCR的通量较低，是本检测方法的局限性。
U1 snRNP互补实验已被用于多种目的。除了逆转5′剪接位点突变的影响外，对U1 snRNA的5′区域进行改造后还可用于基因.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了美国国立卫生研究院（R21CA170786 和 R01GM127464）、美国癌症协会（机构研究基金 74-001-34-IRG）向 S.S. 提供的资金支持，以及 Valley Research Partnership Program 向 S.S. 和 W.M. 提供的资金支持（P1-4009 和 VRP77）。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂级去离子水 | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| DMEM培养基粉末（Dulbecco改良Eagle培养基） | Gibco | 12100-046 | |
| 碳酸氢钠 | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| 胎牛血清（FBS），澳洲来源，经热灭活 | Omega Scientific | FB-22 | |
| 青霉素-链霉素（P/S） | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| 氢氧化钠标准溶液 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| 盐酸，ACS Plus认证，36.5%至38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| 一次性PES瓶顶滤器 | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA） | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5%胰蛋白酶（10倍浓度），无酚红 | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| 氯化钠 | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| 氯化钾 | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| 磷酸氢二钠七水合物 | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| 磷酸二氢钾 | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| 转染培养基 - Opti-MEM™ I 低血清培养基，无酚红 | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| 转染试剂 - Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ 试剂 | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| 氯仿（约含0.75%乙醇作为防腐剂，分子生物学级） | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| 乙醇，无水（200 proof），分子生物学级，Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| 异丙醇，分子生物学级，Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| 糖原（5 mg/ml） | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep 试剂盒 | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml 铅屏蔽，1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4多核苷酸激酶 | New England Biolabs | M0201L | |
| 凝胶过滤填料 - Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| 凝胶过滤微型柱 | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI 消化产物 | New England Biolabs | N3032S | |
| 低分子量标记物，10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| RNase失活试剂 - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP混合液（每种10 mM） | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ 重组核糖核酸酶抑制剂 | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| 逆转录酶 - M-MLV 逆转录酶 | ThermoFisher Scientific | 28025013 | 用于引物延伸 |
| Taq DNA聚合酶 | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| 随机六聚体（50 µM） | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| 实时PCR预混液 - SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III 逆转录酶 | ThermoFisher Scientific | 18080093 | 用于cDNA制备 |
| 二硫苏糖醇（DTT） | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X第一链缓冲液 | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 甲酰胺（≥99.5%） | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | 查阅材料安全数据表 |
| 溴酚蓝钠盐 | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| 二甲苯青FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris碱（白色晶体或结晶性粉末，分子生物学级） | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| 硼酸（结晶性，电泳级） | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| 丙烯酰胺:双丙烯酰胺 19:1（40%溶液，电泳级） | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | 查阅材料安全数据表 |
| 尿素（无色至白色晶体或结晶性粉末，分子生物学级） | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| 过硫酸铵（APS）≥98%，Pro-Pure，蛋白质组学级 | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）≥99%，超纯 | VWR | 0761-25ML | 查阅材料安全数据表 |
| 可调式平板凝胶系统，Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ 玻璃板组，16.5 x 14.5 cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ 玻璃板组，16.5 x 22.0 cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ 玻璃板组，16.5 x 38.7 cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE储存式磷屏 | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 生物分子成像仪 | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 液体闪烁计数器 | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch 梯度PCR仪 | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量PCR系统 | ThermoFisher Scientific |
参考文献
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
