该详细方案涵盖了从消化阶段开始的成年猪胰岛分离的方法学步骤 通过 从胰岛的纯化到最终功能评估的完整流程。该方案可作为科研机构进行成年猪胰岛分离的参考指南。
本文内容
摘要
摘要
1型糖尿病（T1DM）是由自身免疫系统对胰腺β细胞的破坏所引起的，导致胰岛素分泌极少或完全缺失。胰岛移植在T1DM的治疗中发挥着重要作用，相较于传统的胰岛素治疗，其可改善糖代谢控制，减缓并发症的进展，并减少低血糖发作次数。III期临床试验的结果也证实了同种异体胰岛移植在T1DM治疗中的安全性和有效性。然而，胰腺供体的短缺限制了该疗法的广泛应用。动物来源的胰岛（如猪）提供了一种替代选择。由于猪胰腺的结构与小鼠或人类的胰岛不同，猪胰岛的分离过程仍具挑战性。鉴于将异种来源的猪胰岛通过细胞移植应用于T1DM临床治疗具有重要意义，亟需一种经济、标准化且可重复的猪胰岛分离方案。本文介绍了一种简化且经济高效的成年猪胰岛分离与纯化方法，该方法基于先前已成功将猪胰岛移植至非人灵长类动物的实验方案。本方法旨在为初学者提供指导，无需使用COBE 2991细胞处理机等专用设备。
引言
1型糖尿病（T1DM） 是一种严重的疾病，其特征是自身免疫系统破坏β细胞，导致胰岛素分泌极少或完全缺失1,2,3。相当一部分T1DM患者无法通过胰岛素治疗稳定血糖波动，并会经历危及生命的低血糖发作。成功的胰岛移植可实现血糖稳定。全球已有超过1,500名糖尿病患者接受了成功的胰岛移植，其长期疗效的成功率虽低于胰腺移植，但风险更小4。
与胰岛素治疗相比，胰岛移植在减缓并发症进展方面效果更佳5。III期临床试验的结果也证实了同种胰岛移植在1型糖尿病（T1DM）患者中的安全性和有效性6,7。对于经历危及生命低血糖发作的1型糖尿病患者，胰岛移植可能是目前可获得的最佳治疗选择。
然而，人同种异体供体胰岛的短缺限制了胰岛移植的广泛应用8,9。因此，使用动物胰岛作为替代来源是可取的....
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方案
所有涉及动物的实验程序均经深圳市第二人民医院机构动物护理和使用委员会批准，并遵循所有国家 法规。本方案中所用的胰腺供体为从市场购买的杜洛克-长白-约克夏猪（约6月龄）。采集的胰腺重量为123.63 g ± 22.50 g。实验过程中需穿戴个人防护装备，包括防护服、口罩、手套和帽子。
1. 培养基制备
- 清洗液：配制 100 mL 清洗液，需混合 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）、2% 猪血清、20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 1% 青霉素-链霉素（P/S）。
- 收集液：将 RPMI 1640 与 5% 猪血清和 1% 青霉素-链霉素（P/S）混合。
- 培养液：将 CMRL 1066 与 10% 猪血清、10 mmol/L 烟酰胺、1% 青霉素-链霉素（P/S）和 2 mmol/L L-谷氨酰胺混合。
- 酶解液：在 HBSS 中配制 1 mg/mL 的 V 型胶原酶（活性：918 单位/毫克固体）溶液。
- 低葡萄糖浓度溶液：配制低葡萄糖浓度溶液时，向 1 mL Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液（KRBB）中加入 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2.8 mM D-葡萄糖。
- 高葡萄糖浓度溶液：配制高葡萄糖浓度溶液时，向 1 mL Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液（KRBB）....
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结果
生物安全柜的准备工作如图1所示。设置三个独立的操作区域。生物安全柜#1配备有肾形盘、手术器械和烧杯，用于胰腺修剪（图1A）。生物安全柜#2配备有水浴装置、蠕动泵、带循环管的试管架以及用于胰岛消化的消化室（图1B）。生物安全柜#3配备有一次性滤器和离心管，用于酶液制备、胰岛纯化及后续步骤（图1C）。
胰腺（酶灌注前和灌注后）如图2所示。通过胰管从胰腺头部开始，将V型胶原酶溶液灌注至整个胰腺。via 如果连接叶未能成功灌注，则需将其切成独立的组织块，并对每一块分别进行灌注。
胰腺消化在消化室中进行，如图3所示。图中显示了机械破碎后的胰腺组织以及消化后残留的未消.......
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讨论
利用猪作为胰岛来源的异种胰岛移植是一种克服人源胰岛短缺的有前景的方法。尽管成年猪胰岛的分离具有挑战性，但已有多个研究团队建立了能够稳定、成功分离胰岛的实验方案10,11。无论采用何种方法，均需验证胰岛的存活率及其功能特性，以确认所获得产品的高质量。本实验方案基于已发表的文献10,11，以视频形式呈现，便于理解与重复操作。
根据以往的报道和我们的经验，成功分离成年猪胰岛的几个关键参数至关重要13,14。这些关键参数包括：（1）供体猪的年龄和性别：优先选择产仔超过两胎的雌性猪（即所谓的退役繁殖母猪），因为它们能够更易提供大量高质量的胰岛25,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢大卫·K·C·库珀教授（David K. C. Cooper，移植科学中心， 感谢马萨诸塞州总医院（Massachusetts General Hospital）帮助我们建立完整的异种移植系统。感谢胡星玲（Shenzhen Second People's Hospital）、田晓鹤（University of California, Berkeley）、周波（Boston University）在讨论和建议方面的帮助。本工作由国家关键研发计划项目&D 计划（2017YFC1103701， 中国国家重点研发计划（2017YFC1103704）、广东省高水平医院建设专项资金（2019）和深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201812079）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 500 mL 一次性滤器 | Corning | 431097 | |
| 1 L 塑料蓝盖瓶 | Celltrans | YKBH1 | |
| 10 mL、25 mL 一次性移液管 | CORNING | 4488 | |
| 150 mm 培养皿 | BIOLGIX | 66-1515 | |
| 1× HBSS 基础溶液 | GIBCO | C14175500BT | |
| 200 mL 锥形 离心瓶 | Falcon | 352075 | |
| 50 mL 离心管 | NEST | 602052/430829 | |
| 500 mL Ricordi 反应室 | Biorep | 600-MDUR-03 | |
| 500 微米筛网 | Yikang | YKBE | |
| 6 孔板 | COSTAR | 3511 | |
| 套管针（16G、18G、20G） | BD | 682245, 383005, 383012 | |
| 麻醉机 | RWD | R620-S1 | |
| 麻醉剂 A：鲁米那宁（2.5–5 mg/kg） | Huamu, 中国 | 动物药品 GMP (2015) 070011777 | |
| 麻醉剂 B：丙泊酚（2–3 mg/kg） | Sigma Aldrich | S30930-100g | |
| 烧杯（500 mL、1000 mL） | Shuniu | SB500ml, SB1000ml | |
| 血糖仪 | Sinocare | 2JJA0R05232 | |
| 血糖试纸 | Sinocare | 41120 | |
| 钙黄绿素/碘化丙啶细胞活力检测试剂盒 | Beyotime | C2015M | |
| CMRL 1066 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| 胶原酶 V | Sigma Aldrich | C9263 | |
| CyQUANT 细胞增殖检测试剂盒 | Molecular Probes | C7026 | |
| 消化道组织 | Celltrans | YKBAO | |
| 一次性采血针 | FKE | 20153152149 | |
| 二苯硫腙（Dithizone） | Sigma Aldrich | D5130 | |
| 手术铺巾 | Xinwei | 20182640332 | |
| 平板底盘 | Jinzhong | R0B010 | |
| 硬膜外导管 | Aoocn | No. 20163661148 | |
| 肝素钠 | Chinawanbang | 99070 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-080 | |
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771-100ml | 1077 多蔗糖溶液 |
| Histopaque 1083 | Sigma Aldrich | 10831-100ml | 1083 多蔗糖溶液 |
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191-100ml | 1119 多蔗糖溶液 |
| 输液管 | BOON | 20163660440 | |
| 碘伏 | LIRCON | Q/1400ALX002 | |
| 异氟烷 | Rwdls | R510-22-16 | |
| 0-2 号缝合线 | Jinhuan | No. 20142650770 | |
| 22 号手术刀片 | Lianhui | 2011126 | |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO | 15140-122 | |
| 蠕动泵 | LongerPump | BT300-2J | |
| 猪血清 | Kangyuan | 20210601 | |
| RPMI-1640 培养基 | GIBCO | C1875500BT | |
| 取样注射器 | Yikang | YKBB0 | |
| 手术刀 | Jinzhong | J11030 | |
| 氮化硅珠 | Celltrans | YKBI0 | |
| 直血管钳 | Jinzhong | J31120 | |
| 直壁广口瓶 | Nalgene | 2118-0001 | |
| 组织镊 | Jinzhong | J41010 | |
| 组织剪 | Jinzhong | J21210 | |
| 有齿镊 | Jinzhong | JD1060 | |
| 巾钳 | Shinva | 154285 | |
| 真空采血管 | Sanli | 20150049 | |
| 水浴锅 | Yiheng | HWS-12 |
参考文献
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), London, England. 69-82 (2014).
- Smith, M. J., Simmons, K. M., Cambier, J. C. B cells in type 1 diabetes mellitus and diabetic kidney disease. Nature Reviews. Nephrology. 13 (11), 712-720 (2017).
- Zullo, A.,....
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